Name: isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments at JoVE.com

De ontwikkeling van dit manuscript wordt ondersteund door de National Science Foundation EPSCoR Center voor Root en Rhizobiome innovatie Award OIA-1557417. Het verzamelen van gegevens werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Nebraska-Lincoln, landbouwkundig onderzoek en ontwikkeling en door een subsidie van de Hatch van USDA. Wij erkennen ook steun van de USDA-ARS en ondersteuning werd verstrekt door de landbouw en voedsel onderzoek initiatief concurrerende Grant nr. 2011-68005-30411 van de USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw te richten en te beheren van deze velden.

<ol>
	<li>Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+back+to+the+roots:+the+microbial+ecology+of+the+rhizosphere.">Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).</li><li>Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embracing+the+unknown:+disentangling+the+complexities+of+the+soil+microbiome.">Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome.</a> Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere+and+roots+of+two+major+crop+systems+under+elevated+CO2+and+O3.">Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15019 (2017).</li><li>White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Br&#246;zel, V. S., Subramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio+Temporal+influence+of+isoflavonoids+on+bacterial+diversity+in+the+soybean+Rhizosphere.">Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).</li><li>Edwards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+variation,+and+assembly+of+the+root-associated+microbiomes+of+rice.">Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li><li>Bougoure, D. S., Cairney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblages+of+ericoid+mycorrhizal+and+other+root-associated+fungi+from+Epacris+pulchella+(Ericaceae)+as+determined+by+culturing+and+direct+DNA+extraction+from+roots.">Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots.</a> Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).</li><li>Doty, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazotrophic+endophytes+of+native+black+cottonwood+and+willow.">Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow.</a> Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).</li><li>Gottel, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microbial+communities+within+the+endosphere+and+rhizosphere+of+populus+deltoides+roots+across+contrasting+soil+types.">Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).</li><li>Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+three+endophytic,+indole-3-acetic+acid-producing+yeasts+occurring+in+Populus+trees.">Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees.</a> Mycological Research. 113, 973-980 (2009).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biolology. 12, 87 (2014).</li><li>Gohl, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+improvement+of+amplicon+marker+gene+methods+for+increased+accuracy+in+microbiome+studies.">Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).</li><li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+innovations+for+high-throughput+amplicon+sequencing.">Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPARSE:+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads.">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+theory+of+communication.">A mathematical theory of communication.</a> Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).</li><li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+diversity.">Measurement of diversity.</a> Nature. 163, 688 (1949).</li><li>Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+estimation+of+the+number+of+classes+in+a+population.">Non-parametric estimation of the number of classes in a population.</a> Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).</li><li>Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+beta+diversity:+Ecological+variation+partitioning+by+multiple+regression+and+canonical+analysis.">Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis.</a> Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).</li><li>Oksanen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vegan+package.">The vegan package.</a> Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ggplot2:+Elegant+graphics+for+data+analysis.">ggplot2: Elegant graphics for data analysis.</a> Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 1-212 (2009).</li><li>Cole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ribosomal+Database+Project+(RDP-II):+sequences+and+tools+for+high-throughput+rRNA+analysis.">The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).</li><li>Wagner, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+genotype+and+age+shape+the+leaf+and+root+microbiomes+of+a+wild+perennial+plant.">Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant.</a> Nature Communications. 7, 12151 (2016).</li><li>O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+community+analysis+by+large-scale+sequencing+of+environmental+samples.">Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).</li><li>Taylor, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+comprehensive+census+of+fungi+in+soil+reveals+both+hyperdiversity+and+fine-scale+niche+partitioning.">A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning.</a> Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).</li><li>Lebeis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salicylic+acid+modulates+colonization+of+the+root+microbiome+by+specific+bacterial+taxa.">Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa.</a> Science. 349 (6250), 860-864 (2015).</li><li>Ofek-Lalzar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche+and+host-associated+functional+signatures+of+the+root+surface+microbiome.">Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome.</a> Nature Commununications. 5, 4950 (2014).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Fitzpatrick, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+ecological+function+of+the+root+microbiome+across+angiosperm+plant+species.">Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).</li><li>Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+effects+of+nitrogen+fertilization+on+soil+bacterial+communities+in+contrasting+systems.">Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems.</a> Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).</li><li>Paungfoo-Lonhienne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+the+table:+Plants+consume+microbes+as+a+source+of+nutrients.">Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients.</a> PLoS One. 5 (7), e11915 (2010).</li><li>Yeoh, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application.">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Peiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+heritability+of+the+maize+rhizosphere+microbiome+under+field+conditions.">Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methoden die worden beschreven in dit manuscript moeten inschakelen wetenschappers om gemakkelijk het gebied van bodem en plant metagenomics. Door de jaren heen, hebben wij onze methodes verfijnd sinds het uitvoeren van het experiment beschreven in dit manuscript. Één verandering is dat we nu vooraf label buizen voor het uitgaan naar het veld te monster. Onze afwerkcentrale gebruikt een barcoding-systeem en een labelprinter. De labelprinter bespaart niet alleen tijd toen labeling buizen, maar ook maakt alles makkelijker bijhouden en monsters zonder de grillen van menselijke hand schrijven correct te herkennen. Een ander belangrijk punt is dat we proberen te verwerken van het materiaal na brengen het terug uit het veld zo spoedig mogelijk. Wij streven ernaar om te bevriezen van de bodem gebruikt voor DNA-analyse, steriliseren en bevriezen van de wortels, en filteren en blokkeren de rizosfeer binnen 12 tot 36 uur na zijn terugkeer uit het veld. De DNA-extractie-procedures zijn langdurig met veel stappen, met name voor de bodem en de rhizosfeer, dus we een robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) die minimaliseert de handen op tijd voor de protocollen van de extractie van DNA kochten, vermindert menselijke fout die kan worden ingevoerd, en verbetert de consistentie in de manier waarop verschillende batches van bodem, wortels of rhizosfeer worden verwerkt. Bij het werken met plantaardig materiaal is het belangrijk om te beslissen over het type root te worden bestudeerd of te nemen van een verscheidenheid van wortel types te krijgen van een "representatief". Behoud van wortels en bladeren in een bevroren toestand bij het uitvoeren van de DNA-extracties zoals is het belangrijk is ervoor te zorgen is er geen kruisbesmetting tussen de monsters bij het invullen van de 96-Wells DNA-extractie-platen. Een andere belangrijke factor die meespeelt is het aantal replicatieonderzoeken moet worden gebruikt wanneer het veld experimenten ontwerpen en gebruiken van een complete gerandomiseerde ontwerp waar mogelijk26. Als gevolg van de variabiliteit van de hoge veld het mogelijk moet zijn een groot aantal wordt gerepliceerd naar het detecteren van kleine verschillen. Tot slot, uit onze ervaring het is essentieel om ervoor te zorgen dat bodems zijn niet te nat. Wanneer het opgraven van de wortels. Als de bodems zijn verzadigd met water het is niet alleen rommelig om mee te werken, maar het is ook zeer moeilijk te bepalen van de rhizosfeer en te verwijderen van de bodem van de wortels.
Een wijziging die werd gemaakt al vroeg tijdens de ontwikkeling van deze methoden is in plaats van het schudden van de buizen met de hand om de rizosfeer die we opgewaardeerd tot vortexers aangedreven door een gas generator om het werk gemakkelijker in het veld en meer gestandaardiseerd in termen van de tijd en de wijze dat elke buis werd geschud. Een beperking van de amplicon rangschikking aanpak is dat de resolutie van de taxonomische van de resultaten vaak beperkt is en vele OTUs onbekende of enige bekende op de familie of een genus niveau zijn. Dit veld van onderzoek evolueert snel dus is het belangrijk op de hoogte van nieuwe en ontwikkelende benaderingen, met name voor data-analyse die de resolutie van de resultaten kan verbeteren.
Deze protocollen zijn alleen voor het studeren niet schimmels, bacteriën en archaea. Het gebruik van verschillende inleidingen voor versterking zal toestaan voor de studie van fungale gemeenschappen met behulp van de dezelfde DNA monsters27,-28. Deze methoden vereisen niet de aankoop van grote hoeveelheden materiaal omdat de methoden kunnen worden vereenvoudigd. De methoden die we beschrijven hier zijn voornamelijk voor het bepalen van de "wie is er", maar het veld snel ontwikkelt zich tot een belangrijke vragen over de functie, die kan worden aangepakt met behulp van shotgun sequencing methoden, isolatie en testen van de functionaliteit van microben, of de hele microbiële genoom sequencing.
De representatieve resultaten benadrukken de verschillen in microbiële gemeenschappen die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de beschreven methoden. Met behulp van een bèta-diversiteit benadering de data analyse22, werden samenstelling verschillen tussen monster types getoond. Deze verschil zijn in de meeste andere studies waar endosphere, rhizosfeer en bodem bevatten unieke microbiële gemeenschappen3duidelijk waargenomen. Het indexcijfer van de diversiteit van de Shannon was berekend de overvloed en de gelijkmatigheid van de microbiële soorten waarvan de aanwezigheid binnen iedere plantensoorten in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem te bepalen. Zoals u in deze studie en vele anderen, is Alfa diversiteit het hoogst in de bodem, licht dalend in de rizosfeer en dan daalt aanzienlijk in de endosphere3,5,29. Deze resultaten wijzen erop dat de hier beschreven methoden geschikt zijn voor het identificeren van compositorische wijzigingen in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem.
De dominantie van de Proteobacteria is een gemeenschappelijke vaststelling in studies over endosphere en bodem30,31,32. Endosphere heeft over het algemeen een lagere diversiteit van microbiële soorten met een hogere relatieve abundantie van de Proteobacteria. Hieruit blijkt opnieuw dat de resultaten hier representatief voor andere bevindingen in de literatuur zijn. De effecten van de behandeling in deze studie waren niet significant verschillend en twee grote redenen daarvoor kunnen worden dat de verschillen die zijn opgelegd door de behandelingen niet groot genoeg is waren voor het genereren van voldoende variatie om op te sporen en dat deze bemonstering werd gedaan aan het einde van de groeiseizoen, wanneer de velden kunnen hebben voldoende tijd gehad om te vestigen beneden de stikstof op vergelijkbare niveaus, die is wat werd gemeten aan het eind van het seizoen. In een andere studie met behulp van soortgelijke bevruchting tarieven over een langere periode van tijd, werden slechts relatief kleine veranderingen in de samenstelling van de microbiome gemeten33. Andere studies hebben aangetoond wijzigingen in zowel schimmel en bacteriële gemeenschappen als gevolg van stikstof kunstmest34,35.
Plantensoorten zijn gekend om te spelen een rol bij het bepalen van hun microbiomes3,32,36 en zelfs kleine verschillen in de variant van de microbiële Gemeenschap zijn aangetoond tussen verschillende plant genotypen binnen een enkele soorten37. In deze studie werd een significant verschil in samenstelling van de microbiële Gemeenschap gevonden tussen plantensoorten. In alle soorten van de steekproef bleek dat switchgrass had de meest verschillende microbiële samenstelling, maar waren de verschillen tussen soorten alleen statistisch significant in de endosphere. Rhizosfeer Gemeenschap samenstelling kan beduidend indien meer replicatieonderzoeken beschikbaar voor analyse waren zijn geworden.
De gecombineerde veld, lab en analytische protocollen beschreven hier bieden een krachtige methode voor het bestuderen van de manier waarop de verschillende factoren invloed de samenstelling van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer, en de endosphere van wortels36. Er is een heleboel werk te doen op het gebied van het bestuderen van de microbiomes, met name in agrarische velden. Belangrijke vragen op over hoe de opbrengsten worden gewijzigd door de microbiome van de bodem moeten nog volledig worden opgehelderd. Zelfs de meest elementaire vragen over hoe vruchtwisseling invloed op de microbiome van de bodem, hoe timing verandert de microbiome, hoe abiotische stress verandert de microbiome, hoe bodemtype interageert met deze factoren te wijzigen van de microbiome, en of er universele microben in bepaalde gewassen of regio's van de VS zijn allemaal open vragen. Deze methoden zullen ook nuttig voor epidemiologisch onderzoek om de aanwezigheid en de persistentie van pathogene en gunstige bacteriën te identificeren. Een andere toekomstige horizon voor deze methoden zullen om te beginnen met de hier beschreven met plant- en microbe RNA- en metaboliet gegevens DNA-methoden te integreren. Extra verbetering en het testen van meer variabelen is belangrijk voor verdere optimalisatie van deze protocollen.

Microbiome onderzoek heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen en manipuleren van ecosysteem processen zoals nutriënten fietsen, organisch materiaal omzet, en de ontwikkeling of remming van de bodem ziekteverwekkers1,2. Dit onderzoeksgebied houdt ook groot potentieel voor het begrijpen van de effecten van bodem-microben op de productiviteit van natuurlijke plantaardige Gemeenschappen en agro-ecosystemen. Hoewel er veel studies die zijn gericht op de microbiome van de bodem in natuurlijke ecosystemen, hebben minder gericht op plant rhizosfeer en endosphere microben in agro-ecosystemen3. In Nebraska domineert landbouw het landschap in grote delen van de staat, de studies van deze bodems maken waar agrarisch belangrijke gewassen een cruciaal onderwerp voor onderzoek worden gekweekt. Het doel van deze paper methoden is om onderzoekers te voorzien van een standaardset van protocollen bij het beschrijven van de microben aanwezig zijn in de agro-ecosystemen, om te bepalen hoe de plantenwortels de microbiële gemeenschappen in de rhizosfeer en endosphere, en uiteindelijk wijzigen begrijp de functies die deze microben in bodem sanitaire en fytosanitaire productiviteit spelen.
De methode die hier wordt gepresenteerd verschilt enigszins van de methoden die worden gebruikt door anderen4,,5 , in dat dit document is gericht op het leren welke microben zijn uitsluitend binnen de wortel en hoe ze verschillen van microben onmiddellijk buiten de root in de rhizosfeer. De volgorde van de amplicon gebruikt in deze studie identificeert de microbiële taxa gevonden in het DNA-monster en laat onderzoekers om te bepalen hoe de gemeenschappen afhankelijk van monster type of behandeling veranderen. Een van de belangrijkste verschillen tussen dit protocol en een zeer vergelijkbaar protocol dat wordt gebruikt door Lundberg et al. 6 is dat in plaats van ultrasoonapparaat, dit protocol oppervlakte sterilisatie met bleekmiddel en ethanol gebruikt om de rizosfeer van de wortels. Anderen hebben ook gebruik gemaakt van oppervlakte sterilisatie effectief7,8,9,10. Deze methoden zijn niet voordeliger dan andere methoden, maar iets anders. Deze methoden zijn bijzonder goed geschikt voor grote veld experimenten, want met genoeg mensen is het mogelijk voor het verwerken van meer dan 150 veld percelen per dag, waardoor maximaal ongeveer 450 monsters als gepartitioneerd in endosphere, rhizosfeer en bodem. Dit manuscript beschrijft in detail de gebruikte methoden voor proeven in het veld, het verwerken van het materiaal in het lab, uittreksel en de DNA-sequentie, en biedt een beknopt overzicht van de stappen om de resulterende rangschikken gegevens te analyseren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit</td>
			<td>Qiagen/MoBio</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>Extraction kit for soil and rhizosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit</td>
			<td>Qiagen/MoBio</td>
			<td>13496-4</td>
			<td>Extraction kit for roots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Handle Digging shovel, 101 cm L</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>9669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Tiller, 40 cm L</td>
			<td>Truper</td>
			<td>34316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash pan</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic bucket</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves (work and lab)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 &#956;m mesh size</td>
			<td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td>
			<td>US8-8FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 &#956;m mesh size</td>
			<td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td>
			<td>US8-4FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>portable generator</td>
			<td>Honda brand works well</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers 100 &#956;m mesh size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Lehman Seeds</td>
			<td>VIS-30</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaves</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>CLOROX - household strength</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice pellets</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 cm precision fine point tweezers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17456209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm Straight point specimen forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.5 cm Pruning Scissors</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>9921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL PP conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL PP conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>C50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>Milli-Q Integral, Q-POD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>For DNA quantification of removed samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td>For DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPNA PCR Blocker</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>PP01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPNA PCR Blocker</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>MP01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>HM782D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive 8 well-strips for plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89134-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads, 3.2 mm dia</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit)</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>3959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere</td>
			<td>TWD Tradewinds, INC</td>
			<td>ASWF1SPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf</td>
			<td>TWD Tradewinds, INC</td>
			<td>ASWFXSCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie 2 Digital Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex adapter for 50 mL tubes</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-H506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar (100 mL) and pestle</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro-spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80071-672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable antistatic microspatulas</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm)</td>
			<td>Duro</td>
			<td>18402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5424 Centrifuge for 2 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96-well plate</td>
			<td>Sigma4-16S</td>
			<td>81510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor for 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma4-16S</td>
			<td>12269 - Biosafe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi DNA polymerase</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments

Plant en bodem microbiome studies zijn steeds belangrijker voor de micro-organismen van de rollen in landbouwproductiviteit spelen begrip. Het doel van dit manuscript moet detail geven over hoe snel genieten van de bodem, de rhizosfeer, en endosphere van gerepliceerde veldproeven en analyseren van wijzigingen voordoen bij de microbiële gemeenschappen als gevolg van monster type, behandeling en plant genotype. Het experiment gebruikt om aan te tonen deze methoden bestaat uit gerepliceerde veld percelen met twee, zuiver, warm-seizoen grassen (Panicum miliaceum en Andropogon Rus) en een lage-diversiteit gras mengsel (A. Rus, Sorghastrum Vogelmelk, en Bouteloua curtipendula). Kort, planten zijn opgegraven, een verscheidenheid van wortels zijn gesneden en geplaatst in fosfaatbuffer en geschud voor het verzamelen van de rizosfeer. Wortels worden gebracht naar het laboratorium op ijs en oppervlak gesteriliseerd met bleekmiddel en ethanol (EtOH). De rizosfeer is gefilterd en geconcentreerd door middel van centrifugeren. Afgegraven grond van rond de wortel bal is geplaatst in plastic zakken en gebracht naar het lab waar een kleine hoeveelheid bodem is genomen voor DNA extracties. DNA is gewonnen uit de wortels en bodem rhizosfeer en vervolgens versterkt met inleidingen voor de V4-regio van het 16S rRNA gen. Waarbij sequenced, dan geanalyseerd met open toegang bioinformatica tools. Deze methoden toestaan van onderzoekers om te testen hoe de microbiële Gemeenschap diversiteit en samenstelling varieert vanwege monster type, behandeling, en plant genotype. Met behulp van deze methoden samen met statistische modellen blijkt de representatieve resultaten er aanzienlijke verschillen in microbiële gemeenschappen van wortels, rhizosfeer en bodem. Methoden die hier gepresenteerd bieden een complete set van stappen voor het verzamelen van veldmonsters, isoleren, uitpakken, kwantificeren, versterken, en DNA-sequentie en analyseren van de microbiële Gemeenschap diversiteit en samenstelling in gerepliceerde veldproeven.

De representatieve resultaten gepresenteerd in dit manuscript komen uit een veld-site opgericht in 2012 op de Universiteit van Nebraska-Lincoln landbouw Research Division boerderij in de buurt van Mead, NE. voorafgaand aan het experiment, de site had beheerd als een rotatie van maïs-soja . De studieplaats bevond zich op drie verschillende soorten bodems, maar de gegevens werd geanalyseerd alsof alle wijzigingen in de bodemeigenschappen van de gemeten als gevolg van de behandelingen opgelegd.
De veld-site bevatte twee, puur, staat van switchgrass (P. miliaceum cv Liberty), evenals grote bluestem (A. Rus) en een mengsel van de lage-diversiteit gras met grote bluestem, indiangrass (S. Vogelmelk) en 'Butte' sideoats grama) B. curtipendula). De drie percelen van de warm-seizoen gras werden in een gerandomiseerde volledige blokontwerp dat driemaal is gerepliceerd. Genest in de drie verschillende gras percelen werden twee bevruchting behandelingen voor stikstof (N), die 56 (N1) en 112 (N2) kg N ha waren-1 van toegepaste ureum. Ten tijde van de bemonstering van de microbiome aan het einde van het groeiseizoen, de bodem opgenomen 8.0 ± 1.1 (gemiddelde ± SD) ppm nitraat in de percelen bevrucht met 112 kg N ha-1 en 6.8 ± 0,7 (mean + SD) ppm nitraat in de percelen bevrucht met 56 kg N ha-1. De percelen had al bevrucht wordt eenmaal per jaar. Het gras van de warm-seizoen percelen werden aangemerkt als de belangrijkste percelen (8000 m2) en N behandelingen waren de split percelen (4000 m2). Grote bluestem als een 50:50 mix van 'Bonanza' en 'Goudmijn' was uitgezaaid en Indiangrass als een 50:50 mix van 'Scout' en 'Warrior' was agarvoedingsbodem. De percelen werden geplant in 2012, en de eerste toepassing van de N opgetreden in het voorjaar van 2013.
De bodem en de wortel bemonstering vond plaats op 15 September 2014. De hieronder beschreven werk vond plaats op een veld dat is opgezet als een split-plot gerandomiseerde ontwerp met drie replicaat-organismen (Figuur 1). De diepte van de gemiddelde sequentiebepaling van alle de monsters voor de endosphere als volgt waren: 4871 ± 5711 (gemiddelde ± SD), rhizosfeer: 40726 ± 14684, bodem: 38184 ± 9043. Een van de grootste bronnen van variatie in deze experimenten, met behulp van de methoden die worden beschreven, is het verschil in microbiële gemeenschappen gevonden tussen monster typen (Figuur 2). In dit representatieve gegevensverzameling, de rhizosfeer en bodem lijken meer qua samenstelling bij elkaar liggen dan de endosphere (figuur 2A). Er waren echter ook veelbetekenend (p = 0,001) verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap rhizosfeer en bodem (figuur 2B). De totale variatie in deze experimenten geanalyseerd door monster type verantwoord was 26%.
Alfa diversiteit analyse toonde aan dat de microbiële gemeenschappen in de endosphere lager in monster diversiteit ten opzichte van de bodem en de rizosfeer (Figuur 3 waren). De enige belangrijke verschillen in verscheidenheid tussen de soorten gras in elk compartiment waren tussen de endosphere monsters van grote bluestem en switchgrass, met switchgrass hebben aanzienlijk hoger microbiële diversiteit (Figuur 3). De relatieve overvloed analyse (Figuur 4) benadrukt de dominantie van de Proteobacteria gevolgd door Straalzwammen in allerlei monster. Bodem en rhizosfeer ook beheerst door Acidobacteria en Chloroflexi de endosphere had een grotere relatieve overvloed van Bacteriodetes.
In dit experiment, planten zijn geteeld met twee verschillende hoeveelheden N-meststof en dus we de gegevens om te bepalen of er effecten van de behandeling waren geanalyseerd. Effecten van de behandeling goed voor 12% van de totale variatie maar waren niet significant verschillend hoewel in de wijding van de twee behandelingen verschillende (Figuur 5 kijken). Dit benadrukt het belang van statistische analyses voor deze datasets in plaats van visuele inspectie of kwalitatieve beslissingen.
Plant-beïnvloed verschillen in de microbiome van plantaardige weefsels en bodem werden gevisualiseerd met behulp van een gebonden methode van coördinatie. Statistische verschillen werden bepaald met behulp van een analyse van de PERMANOVA om te testen of specifieke variabelen, zoals soorten, in sterk afwijkt van de microbiële Gemeenschap samenstelling tussen de monsters resulteren. Wanneer alle monster typen waren samen geanalyseerd, werd een zeer significant verschil gevonden in microbiële Gemeenschap samenstelling als gevolg van plantensoorten (Figuur 6). In dit experiment was het bedrag van de variatie in rekening gebracht door plantensoorten 6,7%. Ten slotte was elk monster type afzonderlijk geanalyseerd om te bepalen welke van de soorten monster kan het effect van belangrijke plant soorten rijden. Alleen in de endosphere was er een zeer groot verschil (p = 0,001) tussen de microbiële Gemeenschap composities van de verschillende plantensoorten (Figuur 7). In de steekproef andersoortige was het soort effect niet significant wanneer afzonderlijk geanalyseerd. In de endosphere was het percentage variatie toe te schrijven aan soorten 27%, terwijl het lager in de rizosfeer (18%) en bodem (15%). Dit benadrukt verder het belang van elk weefseltype afzonderlijk analyseren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> Afbeelding 1: voorbeeld van het experimentele veld ontwerp. Experimentele veld ontwerp ter illustratie van een gerandomiseerde volledige blokontwerp in drievoud van het veld site ligt bij de Universiteit van Nebraska-Lincoln oostelijk Nebraska Research and Extension Center in de buurt van Mead, NE. Zie het gedeelte ' resultaten ' voor de volledige site beschrijving. N1 is de lage (56 kg N ha-1 ureum) en N2 (112 kg N ha-1 ureum) is het hogere tarief van de stikstof die was toegepast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> Figuur 2: Beta diversiteit analyse de microbiële samenstelling in de verschillende monster vormen, met inbegrip van endosphere, rhizosfeer en bodem van de overblijvende gras bemonstering in 2014 vergelijken. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in QIIME1.9.1 voor de productie van de Bray-Curtis volgens matrix. Analyse van de belangrijkste coördinaten (PCoA) op basis van de Bray-Curtis principegeloven matrix was gevisualiseerd in RStudio. PCoA1 en PCoA2 geven de afwijking van de eerste en tweede grootste verklaard door de analyse van de PCoA. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen monster typen, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de cijfers vertegenwoordigen de hele microbiële Gemeenschap voor elk monster. (A) Endosphere, rhizosfeer en bodem monster-typen zijn samen geanalyseerd. Alle 87 monsters werden verheven aan 486 sequenties per monster. (B) rhizosfeer en grond monsters werden geanalyseerd samen. Alle 59 monsters werden verheven met 8231 sequenties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> Figuur 3: Alpha diversiteit analyse met behulp van Shannon index voor elke soort in de endosphere, de rhizosfeer en de bodem. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in de QIIME1.9.1. Rarefaction werd gedaan voor de endosphere, de rhizosfeer, en de bodemtypes monster respectievelijk met 486, 17154 en 8231 sequenties per monster. Vakken geven aan de 25e en 75ste percentiel (eerste en derde kwartielen). De horizontale lijn in het vak geeft de mediaan en de rode plus toont het gemiddelde. Snorharen weergeven het bereik van de gegevens, met uitzondering van uitschieters (die worden weergegeven als zwarte stippen) en dat viel meer dan 1,5-maal de interkwartielafstand (n = 6 voor elk monster behalve voor sideoats grama mix waar n = 5). De Shannon-index van alle vijf soorten in de endosphere waren lager dan zowel de bodem als de rhizosfeer. Niet-parametrische Wilcoxon rangschikking som test werd gebruikt om de betekenis tussen de soorten en alleen significante verschillen tussen soorten werden getoond op de top van de vakken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> Figuur 4: relatieve overvloed op het niveau van de stam in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem. Monsters werden geanalyseerd om te vergelijken de overvloed van microbiële stammen onder verschillende steekproeven (n = 29 voor elk monster-type). De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in QIIME1.9.1 uit de tabel OTU. De verschillende kleuren binnen het cirkeldiagram duiden de stammen. Het percentage geeft de relatieve overvloed van elke stam in elk monster-type. De informatie van de stam was van aantekeningen voorzien met behulp van de Ribosomal databaseproject classificatie (RDP)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> Figuur 5: analyse met behulp van behandeling als beperkende factor tussen allerlei monster. Canonieke analyse van de belangrijkste coördinaten (CAP)-analyse werd uitgevoerd om te bepalen of er verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap tussen behandelingen waren. Voor de behandeling van elke N, n = 42 voor N1 (56 kg N ha-1) en n = 45 voor N2 (112 kg N ha-1). De Bray-Curtis volgens matrix werd gegenereerd met behulp van een python-script in de QIIME1.9.1. CAP analyse op basis van de Bray-Curtis volgens matrix werd gedaan door het beperken van de behandeling als de factor RStudio. PERMANOVA analyse werd uitgevoerd om te bepalen of de behandeling verschillen significant waren, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> Figuur 6: analyse met behulp van plantensoorten als beperkende factor tussen allerlei monster. Analyse werd uitgevoerd om te bepalen of er verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap tussen plantensoorten in allerlei monster waren. Belangrijkste coördinaten wijding en CAP analyse allerhande monster (endosphere, rhizosfeer en bodem) werden gedaan met behulp van een Bray-Curtis volgens matrix. De Bray-Curtis volgens matrix werd gegenereerd met behulp van de Python-script in QIIME1.9.1. CAP analyse op basis van de Bray-Curtis volgens matrix werd gedaan door het beperken van de plantensoorten als de factor RStudio. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen plantensoorten, en de P-waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de cijfers vertegenwoordigt de gehele microbiële Gemeenschap voor dat monster. n = 18 voor elke soort in alle soorten, monster behalve n = 15 voor de sideoats grama mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> Figuur 7: voorbeeld van de CAP analyse met behulp van soorten als beperkende factor voor elk monster type individueel. Belangrijkste coördinaat wijding en CAP analyse van elk monster type (endosphere, rhizosfeer en bodem) met behulp van Bray-Curtis volgens matrix. Elk type monster was verheven 486, 17154 en 8231 leest per monster respectievelijk in endosphere, de rhizosfeer en de bodem. Soorten werd gebruikt als de factor om te beperken de wijding. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen plantensoorten in elk monster type, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de figuur vertegenwoordigt de gehele microbiële Gemeenschap voor elk monster. Steekproefgrootte is n = 29 voor elk monster type, n = 6 voor elke plantensoorten in elk monster type met uitzondering van de sideoats grama mix (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments at JoVE.com

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Opgraving van plantenwortels uit het veld en verwerking van de monsters in endosphere, rhizosfeer en bodem worden in detail, met inbegrip van DNA-extractie en gegevens analysemethoden beschreven. Dit document is bedoeld om andere laboratoria maken gebruik van deze technieken voor de studie van de bodem, endosphere en microbiomes van de rhizosfeer.

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Research

JoVE Journal

Environment

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Techniek voor het bestuderen van geleedpotigen en microbiële gemeenschappen binnen Tree Tissues

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Opzet en werking van een continue<sup&gt; 13</sup&gt; C<sup&gt; 15</sup&gt; N Labeling Kamer voor Uniform of Differentieel, Metabole en structurele, Plant isotooplabelen

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Grondmonstername en isolatie van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidea)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extractie en analyse van Microbiële Phospholipid vetzuren in de bodem

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Een methode voor de extractie en analyse van lipiden voor het karakteriseren van bodemmicrobollen in experimenten met veel monsters

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore DNA rangschikkend voor Metagenomic bodemanalyse

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Microplot Ontwerp en Plant en Bodem Monster Voorbereiding voor 15Stikstof Analyse

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

Tweedimensionale visualisatie en kwantificering van labiele, anorganische plantennutriënten en verontreinigingen in de bodem

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic ...

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Een methode om wetlandwortels en rhizosfeer te behouden voor elementaire beeldvorming

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...