Name: isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments at JoVE.com

Lo sviluppo di questo manoscritto è sostenuto dal National Science Foundation EPSCoR Center per Root e Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. La raccolta dei dati è stata sostenuta dai fondi dalla University of Nebraska-Lincoln, ricerca agricola e lo sviluppo e da una sovvenzione di tratteggio dall'USDA. Riconosciamo anche il supporto dal USDA-ARS e il supporto è stato fornito dall'agricoltura e cibo ricerca iniziativa concorrenziale Grant n ° 2011-68005-30411 dal USDA National Institute di cibo e l'agricoltura a stabilire e gestire questi campi.

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+theory+of+communication.">A mathematical theory of communication.</a> Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).</li><li>Simpson, E. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application.">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Peiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+heritability+of+the+maize+rhizosphere+microbiome+under+field+conditions.">Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi descritti in questo manoscritto dovrebbero consentire agli scienziati di entrare facilmente nel campo della metagenomica del suolo e pianta. Nel corso degli anni, abbiamo affinato i nostri metodi dal condurre l'esperimento descritto in questo manoscritto. Un cambiamento è che abbiamo ora pre-Etichettare provette prima di andare al campo per esempio. Il nostro laboratorio utilizza un sistema di codici a barre e stampante di etichette. La stampante di etichette non solo di risparmiare tempo quando etichettatura tubi, ma anche rende tutto più facile per tenere traccia e identificare correttamente i campioni senza i capricci di scrittura della mano umana. Un altro punto critico è che cerchiamo di elaborare il materiale dopo portarlo indietro dal campo appena possibile. Miriamo a congelare il terreno utilizzato per l'analisi del DNA, sterilizzare e congelare le radici e filtrare e bloccare la rizosfera entro 12-36 ore dopo il ritorno dal campo. Le procedure di estrazione del DNA sono lunghe con molti passaggi, specialmente per suolo e della rizosfera, così abbiamo acquistato un robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) che minimizza le mani in tempo per i protocolli di estrazione del DNA, riduce l'errore umano che può essere introdotte, e migliora l'uniformità in modo diversi lotti di terreno, radici o rizosfera vengono elaborati. Quando si lavora con materiale vegetale che è importante decidere il tipo di radice per essere studiato o prendere una varietà di tipi di radice per ottenere un "campione rappresentativo". Mantenimento di radici e foglie in stato congelato quando conducendo le estrazioni di DNA è importante, in quanto consiste nel garantire non c'è nessuna contaminazione tra campioni durante la compilazione di piastre da 96 pozzetti DNA estrazione. Un altro fattore importante da considerare è il numero delle ripetizioni da utilizzare durante la progettazione di esperimenti sul campo e utilizzando un completo randomizzati progettazione ove possibile26. A causa della variabilità di alto campo può essere necessario disporre di un gran numero di repliche per rilevare piccole differenze. Infine, dalla nostra esperienza è essenziale per assicurarsi che i suoli non sono troppo bagnati quando le radici di scavo. Se i terreni sono saturi d'acqua non è solo disordinato a lavorare con, ma è anche molto difficile definire la rizosfera e togliere la terra dalle radici.
Una modifica che è stata fatta presto durante lo sviluppo di questi metodi è stato invece scuotendo i tubi a mano per rilasciare la rizosfera che ci siamo trasferiti in vortexers alimentato da un generatore di gas per rendere più facile il lavoro in campo e più standardizzata in termini di tempi e nei modi che ogni tubo era agitato. Una limitazione dell'approccio sequenziamento degli ampliconi è che la risoluzione tassonomica dei risultati è spesso limitata e molti OTUs sono conosciuti sconosciuti o solo a livello di famiglia o genere. Questo campo di ricerca è in rapida evoluzione quindi è importante essere consapevoli di approcci nuovi e in via di sviluppo, in particolare per l'analisi di dati che possono migliorare la risoluzione dei risultati.
Questi protocolli sono solo per lo studio di batteri e archaea, non funghi. L'uso di primer diversi per amplificazione permetterà per lo studio delle Comunità fungine utilizzando la stessa DNA campioni27,,28. Questi metodi non richiedono l'acquisto di grandi quantità di attrezzature, perché i metodi possono essere semplificati. I metodi che descriviamo qui sono principalmente per la determinazione di "chi è", ma il campo è in rapida evoluzione in domande importanti sulla funzione, che può essere risolto utilizzando metodi di sequenziamento shotgun, isolamento e controllo della funzionalità dei microbi o genomi interi microbici di sequenziamento.
I risultati rappresentativi evidenziano le differenze nelle comunità microbiche che possono essere identificate utilizzando i metodi descritti. Utilizzando un approccio di beta-diversità per l' analisi di dati22, differenze composizionali sono state indicate tra tipi di campioni. Queste differenze sono state osservate chiaramente nella maggior parte dei altri studi dove endosphere, rizosfera e suolo contengono unica comunità microbiche3. L'indice di diversità di Shannon è stata calcolata per determinare l'abbondanza e la regolarità delle specie microbiche presenti all'interno di ogni specie di pianta endosphere, rizosfera, e suolo. Come mostrato in questo studio e in molti altri, alfa diversità è più alta nel terreno, diminuendo leggermente nella rizosfera e quindi diminuendo significativamente nel endosphere3,5,29. Questi risultati indicano che i metodi descritti qui sono adatti per l'identificazione di cambiamenti composizionali endosphere, rizosfera, e suolo.
La dominanza di Proteobacteria è un'individuazione comune negli studi endosphere e terreno30,31,32. Endosphere ha generalmente una bassa diversità di specie microbiche con una maggiore abbondanza relativa di Proteobacteria. Questo sottolinea ancora una volta che i risultati qui sono rappresentante di altri risultati nella letteratura. Gli effetti del trattamento in questo studio non erano significativamente differenti e due ragioni principali per cui potrebbero essere che le differenze imposte dai trattamenti non erano abbastanza grandi per generare variazione sufficiente per rilevare e che il campionamento è stato fatto alla fine della stagione, quando i campi possono avere avuto tempo sufficiente per trarre verso il basso l'azoto a simili livelli, che è quello che è stata misurata alla fine della stagione di crescita. In un altro studio utilizzando simili tassi di fertilizzazione su un periodo più lungo di tempo, solo relativamente piccoli cambiamenti nella composizione del microbioma sono stati misurati33. Altri studi hanno mostrato cambiamenti nelle comunità fungine e batteriche a causa di azoto fertilizzante34,35.
Specie di piante sono notoriamente giocano un ruolo nel determinare la loro microbiomi3,32,36 e anche piccole differenze nella variazione di comunità microbica sono state dimostrate tra genotipi differenti della pianta all'interno di un singola specie37. In questo studio, una differenza significativa nella composizione della comunità microbica è stata trovata fra specie vegetali. In tutti i tipi di campione sembrava che switchgrass aveva la composizione microbica più distinta, ma le differenze tra le specie erano solo statisticamente significative nella endosphere. Composizione della Comunità rizosfera può diventare significativo se ulteriori repliche erano disponibili per l'analisi.
Il campo combinato, laboratorio e protocolli analitici descritti qui offrono un metodo efficace per studiare come i diversi fattori influenzano la composizione delle comunità microbiche nel suolo, rizosfera e la endosphere di radici36. C'è una grande quantità di lavoro da fare nella zona di studiare microbiomi, specialmente in campi agricoli. Domande importanti su come i rendimenti sono alterati dal microbioma del suolo hanno ancora completamente essere delucidato. Anche le più elementari domande relative a come rotazioni delle colture influenzare il microbioma del suolo, come tempi altera il microbioma, stress abiotici come altera il microbioma, come tipo di suolo interagisce con questi fattori per alterare il microbioma e se ci sono i microbi universali in determinate colture o le regioni degli Stati Uniti sono tutte le questioni aperte. Questi metodi sarà anche utili per studi epidemiologici per identificare la presenza e la persistenza di batteri patogeni e benefici. Un altro orizzonte futuro per questi metodi sarà per iniziare l'integrazione di metodi DNA descritti qui con pianta e microbo RNA e metabolita dati. Ulteriore miglioramento e test di più variabili saranno importanti per un'ulteriore ottimizzazione di questi protocolli.

Microbioma ricerca ha importanti implicazioni per la comprensione e la manipolazione di processi ecosistemici quali nutrienti ciclismo, fatturato di materia organica e sviluppo o inibizione di agenti patogeni del terreno1,2. Questa area di ricerca inoltre ha un grande potenziale per comprendere l'impatto dei microbi del suolo sulla produttività delle comunità vegetali naturali e agroecosistemi. Mentre ci sono molti studi che hanno messo a fuoco sul microbioma del suolo negli ecosistemi naturali, meno si sono concentrati sui microbi di rizosfera ed endosphere pianta in agroecosistemi3. In Nebraska, agricoltura domina il paesaggio attraverso grandi parti dello stato, che gli studi di questi terreni coltivati un argomento vitale per la ricerca sul piano agricolo importanti colture. Lo scopo di questa carta di metodi è quello di fornire ai ricercatori con un set standard di protocolli per descrivere i microbi presenti negli agroecosistemi, per determinare come le radici delle piante modificare le comunità microbiche nella rizosfera ed endosphere e alla fine comprendere le funzioni di che questi microbi giocare nella produttività del suolo e fitosanitarie.
Il metodo presentato qui differisce leggermente dalle tecniche usate da altri4,5 a che il presente documento è finalizzato all'apprendimento quali microbi sono esclusivamente all'interno della radice e come si differenziano dai microbi immediatamente di fuori della radice nella rizosfera. Il sequenziamento degli ampliconi utilizzato in questo studio identifica i taxa microbici trovati il campione di DNA e permette ai ricercatori di determinare come le comunità cambiano a seconda del tipo di campione o trattamento. Una delle differenze chiave tra il presente protocollo e un protocollo molto simile utilizzato da Lundberg et al. 6 è che invece di sonicazione, questo protocollo utilizza sterilizzazione superficiale con candeggina ed etanolo per rimuovere la rizosfera dalle radici. Altri hanno anche utilizzato la sterilizzazione superficiale efficacemente7,8,9,10. Questi metodi non sono più vantaggiosi rispetto ad altri metodi, ma leggermente diversa. Questi metodi sono particolarmente adatti per esperimenti sul campo grande perché con abbastanza gente è possibile elaborare oltre 150 trame di campo al giorno, che aggiunge fino a circa 450 campioni quando partizionato in endosphere, rizosfera e suolo. Questo manoscritto descrive in dettaglio i metodi utilizzati per esempio nel campo, elaborare il materiale in laboratorio, estrarre e il DNA di sequenza e fornisce una breve panoramica dei passaggi per analizzare i dati di sequenziamento risultanti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit</td>
			<td>Qiagen/MoBio</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>Extraction kit for soil and rhizosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit</td>
			<td>Qiagen/MoBio</td>
			<td>13496-4</td>
			<td>Extraction kit for roots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Handle Digging shovel, 101 cm L</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>9669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Tiller, 40 cm L</td>
			<td>Truper</td>
			<td>34316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash pan</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic bucket</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves (work and lab)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 &#956;m mesh size</td>
			<td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td>
			<td>US8-8FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 &#956;m mesh size</td>
			<td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td>
			<td>US8-4FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>portable generator</td>
			<td>Honda brand works well</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers 100 &#956;m mesh size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Lehman Seeds</td>
			<td>VIS-30</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaves</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>CLOROX - household strength</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice pellets</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 cm precision fine point tweezers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17456209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm Straight point specimen forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.5 cm Pruning Scissors</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>9921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL PP conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL PP conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>C50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>Milli-Q Integral, Q-POD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>For DNA quantification of removed samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td>For DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPNA PCR Blocker</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>PP01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPNA PCR Blocker</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>MP01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>HM782D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive 8 well-strips for plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89134-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads, 3.2 mm dia</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit)</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>3959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere</td>
			<td>TWD Tradewinds, INC</td>
			<td>ASWF1SPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf</td>
			<td>TWD Tradewinds, INC</td>
			<td>ASWFXSCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie 2 Digital Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex adapter for 50 mL tubes</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-H506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar (100 mL) and pestle</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro-spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80071-672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable antistatic microspatulas</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm)</td>
			<td>Duro</td>
			<td>18402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5424 Centrifuge for 2 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96-well plate</td>
			<td>Sigma4-16S</td>
			<td>81510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor for 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma4-16S</td>
			<td>12269 - Biosafe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi DNA polymerase</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments

Pianta e terreno microbiome studi stanno diventando sempre più importanti per la comprensione che i microrganismi ruoli giocare nella produttività agricola. Lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire dettagli su come rapidamente del campione di suolo, rizosfera ed endosphere di replicata prove sul campo e analizzare i cambiamenti che possono verificarsi nelle comunità microbica a causa del tipo di campione, il trattamento e pianta genotipo. L'esperimento usato per dimostrare questi metodi consiste di trame di campo replicata contenente due, puro, erbe di stagione calda (Panicum virgatum e Andropogon gerardii) e una miscela di erba bassa-diversità (a. gerardii, Sorghastrum nutans, e Bouteloua curtipendula). Brevemente, piante sono scavati, una varietà di radici tagliati e inseriti in tampone fosfato e poi scosso per raccogliere nella rizosfera. Le radici sono portate al laboratorio su ghiaccio e superficie sterilizzato con candeggina ed etanolo (EtOH). La rizosfera è filtrata e concentrata per centrifugazione. Terreno scavato da intorno alla sfera della radice è messo in sacchetti di plastica e portato al laboratorio dove si è preso una piccola quantità di terreno per le estrazioni di DNA. Il DNA è estratta dalle radici, terreno e rizosfera e poi amplificato con primers per la regione di V4 del gene del rRNA 16S. Ampliconi sono sequenziati, poi analizzati con strumenti di bioinformatica di accesso aperto. Questi metodi permettono ai ricercatori di testare come la diversità della comunità microbica e la composizione varia a causa del tipo di campione, trattamento e genotipo della pianta. Utilizzando questi metodi insieme ai modelli statistici, i risultati rappresentativi dimostrano ci sono differenze significative nelle comunità microbiche di radici, rizosfera e suolo. Metodi presentati qui forniscono un set completo di procedura raccogliere campioni di campo, isolare, estrarre, quantificare, amplificare e sequenza del DNA e analizzano la diversità della comunità microbica e composizione in replicati prove sul campo.

I risultati rappresentativi presentati in questo manoscritto provengono da un sito di campo fondato nel 2012 presso l'University of Nebraska-Lincoln agricoltura ricerca divisione azienda agricola vicino a Mead, Nefi prima dell'esperimento, il sito era stato gestito come una rotazione mais-soia . Il sito di studio era situato su tre diversi tipi di suoli, ma i dati sono stati analizzati come se tutte le modifiche in proprietà del suolo misurati erano dovuto i trattamenti imposti.
Il campo sito conteneva due, puro, basamenti di switchgrass (p. virgatum cv Liberty) e grande bluestem (a. gerardii) così come una miscela di erba bassa-diversità contenente bluestem grande, indiangrass (S. nutans) e 'Butte' sideoats grama ( B. curtipendula). I tre appezzamenti di erba stagione calda erano in un disegno randomizzato blocco completo che è stato replicato tre volte. Annidate in tre appezzamenti di erba differenti erano due trattamenti di fecondazione di azoto (N), che erano 56 (N1) e 112 (N2) kg N ha-1 di urea applicata. Al momento del campionamento microbiome alla fine del periodo della crescita, il nitrato di ppm (media ± SD) 8,0 ± 1.1 suolo contenuto nelle trame fertilizzate con 112 kg N ha-1 e 6,8 ± 0,7 (media + SD) nitrato ppm nelle trame fertilizzate con 56 kg N ha-1. Le trame erano state fecondate una volta all'anno. L'erba di stagione calda appezzamenti sono stati designati come le trame principali (8000 m2) e N trattamenti erano le trame di Spalato (4000 m2). Bluestem grande è stato seminato come una miscela di 50: 50 di 'Bonanza' e 'Goldmine' e Indiangrass è stato seminato come una miscela di 50: 50 di 'Scout' e 'Guerriero'. Le trame sono state piantate nel 2012, e la prima applicazione di N si è verificato nella primavera del 2013.
Il terreno e il campionamento di radice è stato condotto su 15 settembre 2014. Il lavoro descritto di seguito è stato condotto su un campo che è stato istituito come un disegno randomizzato di dividere-trama con tre repliche (Figura 1). La profondità media sequenziamento di tutti i campioni per endosphere erano come segue: 4871 ± 5711 (media ± SD), rizosfera: 40726 ± 14684, terreno: 38184 ± 9043. Una delle maggiori fonti di variazione in questi esperimenti, utilizzando i metodi descritti, è la differenza nella comunità microbiche trovata fra tipi di campione (Figura 2). In questo set di dati rappresentativo, la rizosfera e terreno sembrano essere più simile in composizione a vicenda che il endosphere (Figura 2A). Tuttavia, c'erano anche altamente significativa (p = 0,001) differenze nella composizione della comunità microbica rizosfera e terreno (Figura 2B). La variazione totale hanno rappresentata in questi esperimenti analizzati dal tipo di campione era 26%.
Alfa diversità l'analisi ha mostrato che le comunità microbiche nella endosphere erano più bassi nella diversità del campione rispetto al suolo e della rizosfera (Figura 3). Le uniche differenze significative nella diversità tra le specie di erba in qualsiasi vano erano tra i campioni di endosphere di grande bluestem e switchgrass, con switchgrass avendo significativamente più alta diversità di specie microbiche (Figura 3). L'analisi relativa abbondanza (Figura 4) evidenzia la dominanza di Proteobacteria seguita da Actinobacteria in tutti i tipi di campioni. Suolo e della rizosfera inoltre sono dominati da Acidobacteria e Chloroflexi mentre il endosphere ha avuto una più grande abbondanza relativa di Bacteriodetes.
In questo esperimento, piante sono state coltivate con due diverse quantità di fertilizzante N e pertanto abbiamo analizzato i dati per determinare se c'erano gli effetti del trattamento. Gli effetti del trattamento rappresentavano il 12% della variazione totale ma non erano significativamente differenti anche se nell'ordinazione i due trattamenti aspetto diverso (Figura 5). Ciò evidenzia l'importanza delle analisi statistiche per questi DataSet anziché ispezione visiva o giudizi qualitativi.
Pianta-influenzato differenze nel microbioma di tessuti vegetali e di terreno sono state visualizzate utilizzando un metodo vincolato dell'ordinazione. Le differenze statistiche sono state determinate mediante un'analisi PERMANOVA per verificare se variabili specifiche, come specie, provocare la composizione della comunità microbica significativamente differente tra i campioni. Quando tutti i tipi di campioni sono stati analizzati insieme, una differenza altamente significativa è stata trovata nella composizione della comunità microbica dovuto la specie di pianta (Figura 6). In questo esperimento, la quantità di variazione rappresentata dalle specie vegetali era 6,7%. Infine, ogni tipo di campione è stato analizzato singolarmente per determinare quale dei tipi del campione potrebbe essere guida l'effetto di specie di pianta significativo. Solo nella endosphere c'era una differenza altamente significativa (p = 0,001) tra le composizioni di comunità microbica di diverse specie vegetali (Figura 7). In altri tipi di campione, l'effetto di specie non era significativa quando analizzate singolarmente. In endosphere, la variazione percentuale dovuto la specie era 27%, mentre era più basso nella rizosfera (18%) e terreno (15%). Questo evidenzia ulteriormente l'importanza di analizzare singolarmente ogni tipo di tessuto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> Figura 1: esempio di progettazione campo sperimentale. Progettazione campo sperimentale che illustra un disegno randomizzato blocco completo in triplice copia del sito campo situato presso la University of Nebraska-Lincoln orientale Nebraska ricerca ed Extension Center vicino a Mead, NE. Per la descrizione del sito completo vedere la sezione di risultati. N1 è il basso (56 kg N ha-1 urea) e N2 (112 kg N ha-1 urea) è il più alto tasso di azoto che è stato applicato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> Figura 2: analisi di Beta diversità confrontando la composizione microbica nei tipi differenti del campione tra cui endosphere, rizosfera e suolo dal campionamento erba perenne nel 2014. L'analisi è stata effettuata utilizzando uno script di Python in QIIME1.9.1 per produrre la matrice di dissimilarità di Bray-Curtis. Analisi di coordinate principali (PCoA) basato sulla matrice di dissimilarità di Bray-Curtis è stata visualizzata in RStudio. PCoA1 e PCoA2 indicano la prima e la seconda più grande varianza spiegata dall'analisi PCoA. PERMANOVA analisi statistica è stata eseguita per determinare il significato tra tipi di campioni, e il valore di p è visualizzato nell'angolo superiore destro. Ogni simbolo nelle figure rappresentano l'intera comunità microbica per ciascun campione. (A) Endosphere, rizosfera e suolo tipi di campioni sono stati analizzati insieme. Tutti i 87 campioni erano rarefatto a 486 sequenze per campione. (B) rizosfera e suolo campioni sono stati analizzati insieme. Tutti i 59 campioni erano rarefatte con 8231 sequenze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> Figura 3: analisi di diversità alfa utilizzando indice di Shannon per ciascuna specie nell'endosphere, rizosfera e nel terreno. L'analisi è stata effettuata utilizzando uno script di Python nella QIIME1.9.1. Rarefazione è stato fatto per l'endosphere, rizosfera e tipi di campione di suolo rispettivamente con sequenze 486, 17154 e 8231 per campione. Le caselle indicano i percentili 25 e 75 ° (primi e terzi quartili). La linea orizzontale all'interno della casella denota la mediana e il rosso più Mostra la media. Baffi Visualizza l'intervallo di dati escluse outlier (che appaiono come puntini neri) che è caduto più di 1,5 volte lo scarto interquartile (n = 6 per ogni campione tranne per sideoats grama mix dove n = 5). L'indice di Shannon di tutte le cinque specie del endosphere erano più bassi di rizosfera e il suolo. Non-parametrico Wilcoxon rank sum test è stato utilizzato per determinare il significato tra le specie e solo le differenze significative tra le specie sono state mostrate in cima le caselle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> Figura 4: abbondanza relativa al livello di phylum endosphere, rizosfera, e suolo. I campioni sono stati analizzati per confrontare l'abbondanza dei phyla microbica tra tipi diversi campioni (n = 29 per ogni tipo di campione). L'analisi è stata effettuata utilizzando uno script di Python in QIIME1.9.1 dalla tabella OTU. I diversi colori all'interno del grafico a torta denotano i phyla. La percentuale indica l'abbondanza relativa di ogni phylum in ogni tipo di campione. Le informazioni di phylum è state annotate usando il progetto di Database Ribosomal classificatore (RDP)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> Figura 5: analisi mediante trattamento come fattore vincolante tra tutti i tipi di campioni. Analisi canonica di analisi principali coordinate (CAP) è stato effettuato per determinare se c'erano differenze nella composizione della comunità microbica fra i trattamenti. Per ogni trattamento di N, n = 42 per N1 (56 kg N ha-1) e n = 45 per N2 (112 kg N ha-1). La matrice di dissimilarità di Bray-Curtis è stata generata utilizzando uno script python nella QIIME1.9.1. Analisi CAP basato sulla matrice di dissimilarità di Bray-Curtis è stato fatto vincolando il trattamento come il fattore RStudio. PERMANOVA analisi è stata effettuata per determinare se le differenze di trattamento erano significative, e il valore di p è visualizzato nell'angolo superiore destro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> Figura 6: analisi utilizzando specie vegetali come fattore vincolante tra tutti i tipi di campioni. Analisi è stata condotta per determinare se c'erano differenze nella composizione comunità microbica tra specie di piante in tutti i tipi di campioni. Ordinazione di coordinate principali e analisi di CAP di tutti i tipi di campione (endosphere, rizosfera e suolo) sono stati fatti utilizzando una matrice di dissimilarità di Bray-Curtis. La matrice di dissimilarità di Bray-Curtis è stata generata utilizzando lo script Python in QIIME1.9.1. Analisi CAP basato sulla matrice di dissimilarità di Bray-Curtis è stato fatto vincolando le specie vegetali come il fattore RStudio. PERMANOVA analisi statistica è stata eseguita per determinare il significato tra specie vegetali, e il valore di P è visualizzato nell'angolo superiore destro. Ogni simbolo nelle figure rappresenta l'intera comunità microbica per quel campione. n = 18 per ciascuna specie in tutti i tipi di campione tranne n = 15 per il mix di grama sideoats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> Figura 7: esempio di analisi di CAP utilizzando specie come fattore vincolante per ogni tipo di campione individualmente. Ordinazione delle coordinate principali e l'analisi di CAP di ogni tipo di campione (endosphere, rizosfera e suolo) utilizzando la matrice di dissimilarità di Bray-Curtis. Ogni tipo di campione era rarefatto a 486, 17154 e 8231 letture per campione rispettivamente in endosphere, rizosfera e nel terreno. Specie è stato utilizzato come il fattore per vincolare l'ordinazione. PERMANOVA analisi statistica è stata eseguita per determinare il significato tra specie di piante di ogni tipo di campione, e il valore di p è visualizzato nell'angolo superiore destro. Ogni simbolo di figura rappresenta l'intera comunità microbica per ciascun campione. Dimensione del campione è n = 29 per ogni tipo di campione, n = 6 per ogni specie di piante di ogni tipo di campione tranne che per il mix di grama sideoats (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments at JoVE.com

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Scavo delle radici delle piante dal campo e trattamento dei campioni in endosphere, rizosfera e suolo sono descritte in dettaglio, compresi i metodi di analisi di dati e di estrazione del DNA. Questa carta è progettata per consentire altri laboratori di utilizzare queste tecniche per lo studio del suolo, endosphere e rizosfera microbiomi.

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