Name: nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Forfatterne takke Prof. J. Lebacq for kritisk redigering håndskriftet. CFTRtm1Eur (homozygote F508del-CFTR (FVB/129) mus blev udviklet af den Erasmus MC, Rotterdam, Nederlandene, med støtte fra EF europæisk koordinering indsats for forskning i cystisk fibrose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Undersøgelser og procedurer blev godkendt af en etisk komité for animalsk forskning af UCL (2017/UCL/MD/015) og i overensstemmelse med Fællesskabets regler for brug af dyr i forskning (CEE n ° 86/609). Efterforskere er kvalificerede til dyreforsøg efter direktiv 2010/63/EU af Europa-Parlamentet og Rådet af 22 September 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål.
1. før test vurdering og styring af
<ol><li>Udarbejde dobbelt lumen nasale kateteret. Bemærk: E...

Formålet med dette papir er at beskrive en passende protokol til måling af nasal PD under kontinuerlig perfusion af løsninger i spontant vejrtrækning mus til en længde af tid, der kræves for at teste integriteten af ion transportvirksomheder, hovedsagelig CFTR og ENaC. Alle trin i protokollen har været grundigt optimeret til at sikre fuld animalske opsving og god kvalitet og reproducerbare data. I særlige, kritisk trin er anæstesi vurdering og styring og tilstrækkelig animalsk holdning og pleje under og efter t...

For næsten tre årtier, blev elektriske potentielle forskel (PD) målinger benyttet til at evaluere den funktionelle status af transmembrane ion transportvirksomheder givet udtryk for på næseslimhinden, som repræsentant for den distale airways1. Som en omstændelig dynamisk test2,3, nasal PD tillader funktionel dissektion af cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator (CFTR) og epitelial natrium kanalen (ENaC) aktivitet, lokaliseret både på de apikale membraner af epitelceller og øve afgørende roller i luftvejene overflade hydrering. Den store klinisk anvendelse af den nasale PD test er at bistå ved diagnosticeringen af CF, den mest almindelige fatal genetisk sygdom i kaukasiske populationer med en gennemsnitlige incidens af 1 ud af 2.500 levendefødte i europæiske lande. Testen har længe vist sig nyttigt ved diagnosticering af svækkede, oligo - eller mono-symptomatisk former for CF normalt diagnosticeres senere i livet, og CF-relaterede lidelser som medfødt bilaterale fravær af sædlederen, idiopatisk kronisk pancreatitis, allergiske Bronchopulmonary aspergillose, og bronchiectasis4. For nylig, clinometric evaluering af den terapeutiske graduering af den grundlæggende CFTR defekt5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 har gjort brug af den nasale PD i kliniske forsøg med nye CF behandlingsformer. I indstillingen prækliniske er testen blevet tilpasset til musen17 at tillade undersøgelse af bioactivity af nye CF target terapier18,19,20,21. I mus er teknikken delikat, baseret på arter-relaterede anatomiske forskelle i størrelsen af det nasale området mellem gnavere og mennesker, og især på den vigtige rolle af sensoriske input fra nasofacial-regionen i gnavere. Det kræver uddannede og dygtige erhvervsdrivende, dedikeret udstyr og forsyninger.
CF er en multi systemisk sygdom i eksokrine kirtler, i hvilke kronisk respiratorisk sygdom dominerer det kliniske billede. Sygdommen er forårsaget af mutationer i det gen, der koder for cyklisk adenosin fra (cAMP)-reguleret CFTR klorid-kanal22. Til dato, har mere end 2.000 CFTR mutationer været identificeret23. Den mest almindelige mutation24,25, fundet i næsten 90% af CF alleler, svarer til en sletning af fenylalanin i polypeptid kæde af protein (F508del-CFTR) stilling 508. CFTR protein er en rent ohmske lille konduktans klorid-kanal. Der er også betydelige beviser at CFTR regulerer andre transportmekanismer, navnlig ENaC26,27. Defekte elektrolyt transport, herunder reduceret CFTR-afhængige chlorid ledningsevne og øget ENaC-afhængige natrium ledningsevne, er kendetegnende for CF epitheler. Den tidligere defekt afspejles af en nedsat eller afskaffet repolarisering svar på både en elektrokemisk gradient favorisere chlorid efflux og tilsætning af isoprenaline (en β-adrenerge agonist, der øger intracellulære cAMP) eller forskolin (en adenylate cyclase agonist, ikke godkendt til klinisk brug). Den sidstnævnte defekt afspejles af en basal hyperpolarisering næseslimhinden (en mere negativ PD) og en øget respons på amilorid, et vanddrivende lægemiddel, der blokerer ENaC28.
CF musemodeller har været hyppigt anvendt i CF forskning og har været uvurderlige i dissekere CF patologi. I dag, har mindst femten modeller været beskrevet29, hvoraf tre er homozygote for den mest klinisk relevante F508del mutation30,31,32. En af disse tre stammer30, udviklet på Erasmus universitetet i Rotterdam, har været brugt i næsten 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. Cftrtm1Eur model30 har vist sig for at være meget nyttige til at studere den multiorgan Patofysiologi af CF sygdom og teste effekten af nye terapeutiske strategier18,19,20, 21. Mange problemer kan opstå under eller tidlig efter (< 24 h) den nasale PD test i mus. I dette papir, den passende dybde af anæstesi kræves for at holde et tilstoppet kateter i situ for kontinuerlig perfusion og foranstaltninger til at undgå bronchopneumoni-aspiration af løsninger perfunderet i næsen er beskrevet. Dyrs pleje i slutningen af testen er også beskrevet, herunder administration af en kombination af modgift af bedøvende stoffer, fører til hurtigt vende anæstesi med fuldstændig genopretning af dyrene. Helt, disse procedurer giver mulighed for pålidelige målinger i spontant vejrtrækning mus, reduceret test-relaterede dødelighed og gentage testen i samme dyr. Repræsentative data indhentet fra den nasale PD test i en CF og i en wild-type mus er vist og diskuteret.
Murine nasal PD forsøgsprotokollen er rapporteret i tre sessioner: vurdering og styring før, under og efter testen. I den præ-test vurdering og forvaltning, er forberedelse af dobbelt lumen nasale kateteret og løsninger, der anvendes til løbende nasal perfusion-protokollen beskrevet i detaljer. Under den vurdering og forvaltning af dele af prøven, er eksperimentel opsætning og håndtering af musen minutiøst dissekeret. Endelig, forvaltning af dyr ved testens afslutning er beskrevet for at forbedre fuld animalske opsving.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1092px;" width="1091">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Portex polyethylene tube&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td>
			<td style="width:225px;">Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td>
			<td style="width:167px;">to prepare capillary tubes for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode cream</td>
			<td style="width:403px;">Parker, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:225px;">Redux cream</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:403px;">Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">JNS BNT131-1,0</td>
			<td>measuring and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amiloride hydrochloride</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">A7410</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">F6886</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knick Portamess voltmeter</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Portavo 904 pH</td>
			<td>to measure potential difference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraly SW 112 Software&#160;</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Paraly SW112 software</td>
			<td>to capture potential difference data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">midazolam&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Mylan, Hoeilaart, Belgium</td>
			<td style="width:225px;">Dormicum 15mg/3ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic premedication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fentanyl</td>
			<td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td>
			<td>Domitor 1 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">droperidol&#160;</td>
			<td>Janssen&#160; Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clonidine&#160;</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td>
			<td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">refernce IV catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td>
			<td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps&#160;</td>
			<td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Dumont #5, Fine science Tools</td>
			<td>to place the nasal catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">naloxone&#160;</td>
			<td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td>
			<td>Narcan, 0.4 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">atipamezole&#160;</td>
			<td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td>
			<td>Antisedan, 5 mg/ml</td>
			<td>to serve as a medetomedine specific antidote&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Heating pads&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td>
			<td>to avoid hypothermia during and after the test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Peristaltic pump P1</td>
			<td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td>
			<td>18111091</td>
			<td>to perfuse solutions in the mouse nose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:403px;">Loctite, Henkel, D&#252;sseldorf, Germany&#160;</td>
			<td style="width:225px;">super glue 3</td>
			<td>to glue together two capillary tubes&#160; for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">NaCl</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0926S-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">M7304</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551128</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551139</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Na gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">S2054</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ca gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">C8231</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0089M-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">BD needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td>
			<td style="width:225px;">BD 26G (0.45x10 mm)</td>
			<td>intraperitoneal injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

Den nasale potentielle forskel test har været brugt i næsten tre årtier til at bistå ved diagnosticeringen af cystisk fibrose (CF). Det har vist sig at være nyttige i tilfælde af svækket, oligo - eller mono-symptomatisk former for CF normalt diagnosticeres senere i livet, og CF-relaterede lidelser som medfødt bilaterale fravær af sædlederen, idiopatisk kronisk pancreatitis, allergiske Bronchopulmonary aspergillose, og bronchiectasis. I både kliniske og prækliniske indstillinger, har prøven været brugt som en biomarkør at kvantificere svar til målrettede terapeutiske strategier jf. tilpasning test til en mus er udfordrende og kan medføre en tilhørende dødelighed. Dette papir beskriver den passende dybde af anæstesi forpligtet til at opretholde et tilstoppet kateter i situ for kontinuerlig perfusion. Det viser en liste over foranstaltninger for at undgå bronchopneumoni-aspiration af løsninger perfunderet i næsen. Det beskriver også de dyrs pleje i slutningen af testen, herunder administration af en kombination af modgift af de bedøvende stoffer, fører til hurtigt vende anæstesi med fuld tilbagebetaling af dyrene. Repræsentative data indhentet fra en CF og et wild-type mus viser, at testen forskelsbehandler CF og ikke-CF. Helt, protokollen beskrevet her giver pålidelige målinger af den funktionelle status af trans-epitelial chlorid og natrium transportvirksomheder i spontant vejrtrækning mus samt flere tests i de samme dyr samtidig reducere test-relaterede dødelighed.

For at illustrere karakteristiske ion transport abnormiteter i CF, blev nasal PD målinger udført efter den protokol, der er beskrevet ovenfor i en F508del-CF-mus og et wild-type kontrol over FVB/129 genetiske baggrund fra Bruxelles koloni CFTRtm1Eur mus30. Denne klinisk relevante model, husly det mest almindelige og en af de mest alvorlige F508del-CFTR mutation23,24,<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Vi præsenterer her, en protokol for at måle nasal spændingsforskel i mus. Testen kvantificerer funktion af transmembrane ion transportvirksomheder som cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator og epitelial natrium-kanal. Det er værdifuldt at evaluere effekten af nye terapier for cystisk fibrose.

Nasal potentielle forskel at kvantificere Trans-epitelial Ion Transport i mus

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

En effektiv Manuel Afbening metode til at forberede Intakt Mouse næsevæv med bevaret Anatomisk Organization

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrkning af human Nasal epithelialceller på Air Liquid grænseflade

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Funktionel karakterisering af Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Exchangers af intracellulære Rum Brug Proton-drab Selection at udtrykke dem på plasmamembranen

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Anvendelse af enzymatiske Biosensorer at kvantificere Endogen ATP eller H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; I Nyre

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikker til at fremkalde og kvantificere cellesenescens

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Modificerede metoder til belastning af høj-throughput DNA ekstraktionsplader reducere risikoen for forurening

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Primære humane nasale epitelceller: Biobanking i forbindelse med præcisionsmedicin

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...