Name: nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

De auteurs bedanken Prof. J. Lebacq voor kritisch bewerken het manuscript. CFTR-tm1Eur (homozygoot F508del-CFTR (FVB/129) muizen werden ontwikkeld door het Erasmus MC, Rotterdam, Nederland, met de steun van de Europese Economische Gemeenschap Europese Coordination Action voor onderzoek naar Cystic Fibrosis EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

De studies en de procedures werden goedgekeurd door het ethisch comité voor dierlijke onderzoek van de UCL (2017/UCL/MD/015) en in overeenstemming met de verordeningen van de Europese Gemeenschap voor dierlijk gebruik in onderzoek (CEE n ° 86/609/EEG). De onderzoekers zijn gekwalificeerd voor de dierproeven na de richtlijn 2010/63/EU van het EuropeesParlement en de Raad van 22 September 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt.
1. vooraf ...

Het doel van deze paper is te beschrijven een voldoende protocol voor het meten van de nasale PD onder continue perfusie van oplossingen in spontaan ademhaling muizen voor een lengte van de tijd die nodig is voor het testen van de integriteit van ion vervoerders, voornamelijk CFTR en ENaC. Alle stappen van het protocol zijn zorgvuldig geoptimaliseerd om ervoor te zorgen volledige dierlijke herstel en goede kwaliteit en reproduceerbare gegevens. In bepaalde, kritische stappen zijn verdoving beoordeling en beheer, en voldo...

Voor bijna drie decennia, zijn elektrische potentiële verschil (PD) metingen gebruikt voor de evaluatie van de functionele status van transmembraan ion vervoerders uitgedrukt op de nasale mucosa, als vertegenwoordiger van de distale airways1. Zoals een meerstaps dynamische test2,3, nasaal PD functionele dissectie van Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) en epitheliale natrium kanaal (ENaC) activiteit maakt, gelokaliseerde zowel in de apicale membraan van epitheliale cellen en belangrijke rol in de luchtweg oppervlakte hydratatie uit te oefenen. De belangrijke klinische toepassing van de nasale PD-test is te helpen bij de diagnose van CF, de meest voorkomende fatale erfelijke aandoening in de Kaukasische bevolking met een gemiddelde incidentie van 1 van 2.500 levendgeborenen in Europese landen. De test heeft lang bewezen nuttig bij het diagnosticeren van verzwakte, oligo - of mono-symptomatische vormen van CF meestal gediagnosticeerd later in het leven, en van CF-gerelateerde aandoeningen zoals congenitale bilaterale afwezigheid van zaadleiders, idiopathische chronische pancreatitis, allergische broncho aspergillose en bronchiëctasie4. Meer recent, clinometric evaluatie van de therapeutische modulatie van de fundamentele CFTR defect5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 gebruik heeft gemaakt van de nasale PD in klinische proeven van nieuwe CF-therapieën. De test is in de instelling van de preklinische aangepast aan de muis17 dat onderzoek van de topicale van nieuwe CF doel therapieën18,19,20,21. De techniek is in muizen, delicaat, gebaseerd op soorten-gerelateerde anatomische verschillen in grootte van de nasale regio tussen knaagdieren en de mens, en vooral op de essentiële rol van sensorische input uit de nasofacial regio in knaagdieren. Het vereist opgeleide en bekwame operatoren, speciale apparatuur en benodigdheden.
CF is een multi-systemische aandoening van exocrine klieren, in welke chronische ademhalingsziekte domineert het klinisch beeld. De ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het gen dat de cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) codering-geregeld CFTR chloride kanaal22. Tot op heden meer dan 2.000 CFTR-mutaties geweest geïdentificeerde23. De meest voorkomende mutatie24,25, gevonden in bijna 90% van CF allelen, komt overeen met een schrapping van de fenylalanine in positie 508 van de polypeptide keten van het eiwit (F508del-CFTR). Het CFTR-eiwit is een zuiver Ohmse kleine huidgeleiding chloride kanaal. Er is ook aanzienlijke bewijs dat CFTR andere vervoer mechanismen, in het bijzonder ENaC26,27 regelt. Defecte elektrolyt vervoer, met inbegrip van verlaagde CFTR-afhankelijke chloride geleidingsvermogen en verhoogde ENaC-afhankelijke natrium geleidingsvermogen, is een kenmerk van CF epitheel. Het voormalige defect wordt weerspiegeld door een verlaagd of afgeschaft repolarisatie in reactie op zowel een elektrochemische gradiënt gunste chloride efflux en de toevoeging van isoprenaline (een β-adrenergic agonist die verhoogt van intracellulaire cAMP) of forskolin (een adenylaat cyclase agonist, niet goedgekeurd voor klinisch gebruik). Het laatste defect wordt weerspiegeld door een basale hyperpolarisatie van de nasale mucosa (een negatiever PD) en een verhoogde reactie op amiloride, een diureticum drug die ENaC28 blokkeert.
CF Muismodellen zijn vaak gebruikt in CF onderzoek en zijn onschatbare waarde bij het ontleden van CF pathologie. Tegenwoordig, zijn ten minste vijftien modellen beschreven29, waarvan er drie homozygoot voor de klinisch meest relevante31,F508del mutatie30,-32 zijn. Een van deze drie stammen30, ontwikkeld aan de Erasmus Universiteit in Rotterdam, is al bijna 20 jaar gebruikt in de Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. De Cftrtm1Eur model30 heeft bewezen zeer nuttig te bestuderen van de multiorgan pathofysiologie van CF ziekte en te testen van de werkzaamheid van nieuwe therapeutische strategieën18,19,20, 21. Talrijke problemen zich voordoen tijdens of na vroege (< 24u) de nasale PD test in muizen. In deze paper, de voldoende diepte van anesthesie nodig voor het houden van een nasale katheter in situ voor continue perfusie, en maatregelen om te vermijden broncho-aspiratie van geperfundeerd in de neus oplossingen worden beschreven. De verzorging van de dieren aan het einde van de test is ook beschreven, met inbegrip van de administratie van een combinatie van antidota van verdoving drugs, leidt tot snel het omkeren van de narcose met volledig herstel van de dieren. Over het geheel genomen is deze procedures kunnen betrouwbare metingen in spontaan ademhaling muizen, verminderde test-gerelateerde sterfte en herhalen de test in hetzelfde dier. Representatieve gegevens verkregen uit de nasale PD-test in een CF en in een wild-type muis worden getoond en besproken.
Het lymfkliertest nasale PD testprotocol wordt gerapporteerd in drie sessies: overstromingsbeoordeling en – beheer vóór, tijdens en na de test. In de voortest overstromingsbeoordeling en -beheer, wordt het protocol van voorbereiding van de dubbele lumen nasale katheter en oplossingen gebruikt voor continue nasale perfusie uitvoeriger beschreven. Tijdens de beoordeling en het beheer van gedeelten van de test, is de experimentele opstelling en de behandeling van de muis minutieus ontleed. Ten slotte, beheer van het dier aan het eind van de test wordt beschreven om het herstel van de volledige dier verbeteren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1092px;" width="1091">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Portex polyethylene tube&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td>
			<td style="width:225px;">Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td>
			<td style="width:167px;">to prepare capillary tubes for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode cream</td>
			<td style="width:403px;">Parker, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:225px;">Redux cream</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:403px;">Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">JNS BNT131-1,0</td>
			<td>measuring and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amiloride hydrochloride</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">A7410</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">F6886</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knick Portamess voltmeter</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Portavo 904 pH</td>
			<td>to measure potential difference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraly SW 112 Software&#160;</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Paraly SW112 software</td>
			<td>to capture potential difference data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">midazolam&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Mylan, Hoeilaart, Belgium</td>
			<td style="width:225px;">Dormicum 15mg/3ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic premedication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fentanyl</td>
			<td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td>
			<td>Domitor 1 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">droperidol&#160;</td>
			<td>Janssen&#160; Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clonidine&#160;</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td>
			<td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">refernce IV catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td>
			<td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps&#160;</td>
			<td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Dumont #5, Fine science Tools</td>
			<td>to place the nasal catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">naloxone&#160;</td>
			<td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td>
			<td>Narcan, 0.4 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">atipamezole&#160;</td>
			<td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td>
			<td>Antisedan, 5 mg/ml</td>
			<td>to serve as a medetomedine specific antidote&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Heating pads&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td>
			<td>to avoid hypothermia during and after the test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Peristaltic pump P1</td>
			<td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td>
			<td>18111091</td>
			<td>to perfuse solutions in the mouse nose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:403px;">Loctite, Henkel, D&#252;sseldorf, Germany&#160;</td>
			<td style="width:225px;">super glue 3</td>
			<td>to glue together two capillary tubes&#160; for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">NaCl</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0926S-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">M7304</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551128</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551139</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Na gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">S2054</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ca gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">C8231</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0089M-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">BD needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td>
			<td style="width:225px;">BD 26G (0.45x10 mm)</td>
			<td>intraperitoneal injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

De nasale potentiële verschil test is gebruikt voor bijna drie decennia om te helpen bij de diagnose van cystic fibrosis (CF). Het heeft bewezen nuttig zijn in gevallen van verzwakt, oligo - of mono-symptomatische vormen van CF meestal gediagnosticeerd later in het leven, en van CF-gerelateerde aandoeningen zoals congenitale bilaterale afwezigheid van zaadleiders, idiopathische chronische pancreatitis, allergische broncho aspergillose en bronchiëctasieën. In zowel klinische en preklinische instellingen, is de test gebruikt als een biomarker te kwantificeren reacties op gerichte therapeutische strategieën voor CF. aanpassing de test een muis uitdagend is en leiden een geassocieerde mortaliteit tot kan. Deze paper beschrijft de voldoende diepte van verdoving nodig om te handhaven een nasale katheter in situ voor continue perfusie. Het somt de maatregelen ter voorkoming van broncho-aspiratie van oplossingen geperfundeerd in de neus. Hierin wordt ook de verzorging van de dieren aan het einde van de test, met vermelding van de administratie van een combinatie van antidota van de verdoving drugs, leidt tot snel het omkeren van de narcose met volledig herstel van de dieren. Representatieve gegevens verkregen uit een CF en een wild-type muis tonen aan dat de test tussen CF en niet-CF discrimineert. Over het geheel genomen kunnen het protocol hier beschreven betrouwbare metingen van de functionele status van trans-epitheliale chloride en natrium vervoerders in spontaan ademhaling muizen, evenals meerdere tests in hetzelfde dier terwijl het verminderen van test-gerelateerde sterfte.

Om te illustreren de karakteristieke ion vervoer abnormaliteiten in CF, werden nasale PD-metingen uitgevoerd volgens de hierboven beschreven in een F508del-CF-muis en een wild-type controle van de genetische achtergrond van FVB/129 van de Brussel kolonie protocol CFTRtm1Eur muizen30. Dit klinisch relevante model, herbergen van de meest voorkomende en één van de ernstigste F508del-CFTR mutatie23,24</s...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de nasale potentiaalverschil in muizen. De test kwantificeert de functie van transmembraan ion vervoerders zoals de cystic fibrosis transmembrane huidgeleiding regelgever en de epitheliale natrium-kanaal. Het is waardevol om te evalueren van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor cystic fibrosis.

Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

Met behulp van SCOPE om potentiële regulatorische motieven in Coregulated genen te identificeren

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Een effectieve Manual Uitbenerij methode om Intact Mouse neusweefsel bereiden met Bewaarde Anatomische Organisatie

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functionele karakterisatie van Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Het gebruik van enzymatische biosensoren te kwantificeren endogene ATP of H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; In de nier

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Gewijzigde methoden voor het laden van DNA-extractieplaten met hoge doorvoer verminderen het potentieel voor verontreiniging

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Primaire menselijke neusepitheelcellen: biobanking in de context van precisiegeneeskunde

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...