Name: nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

המחברים תודה פרופסור ג'יי Lebacq לעריכה באופן ביקורתי את כתב היד. Cftrtm1Eur (homozygous F508del-CFTR (FVB/129) עכברים פותחו על-ידי MC ארסמוס, רוטרדם, הולנד, עם התמיכה של הקהילה הכלכלית האירופית פעולה תיאום האירופית לחקר FP6 האיחוד האירופי סיסטיק פיברוזיס LHHM-CT-2005-018932.

לימודיו ואת הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים של הכיול (2017/UCL MD 015), מסכים עם תקנות הקהילה האירופית לשימוש בבעלי חיים במחקר (CEE n ° 86/609). החוקרים כשירים אליה בבע ח בעקבות הוראה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי ושל המועצה של 22 ספטמבר 2010 בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מד?...

מטרת המאמר היא לתאר את פרוטוקול נאותה למדידת PD באף תחת זלוף רציפה של פתרונות בעכברים באופן ספונטני נשימה עבור משך הזמן הדרוש לבדיקת השלמות של יון מובילים, בעיקר CFTR, ENaC. כל השלבים של הפרוטוקול מוטבו בקפידה כדי להבטיח התאוששות מלאה בבעלי חיים, איכות טובה, לשחזור נתונים. בשלבים מסוים, קריטיים ?...

כמעט שלושה עשורים, מדידות הפרש (PD) פוטנציאל חשמלי שימשו כדי להעריך את המצב פונקציונלי של מובילי יון transmembrane באים לביטוי עם רירית האף, כנציג של דרכי הנשימה דיסטלי1. מאחר דינמי רב-שלבי בוחן2,3, אפי PD מאפשר ניתוח תפקודי של סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR) ופעילות ערוץ (ENaC) נתרן אפיתל, שניהם מקומי על הממברנות הפסגה של תאים אפיתל, מתאמצת לקבל תפקידים חיוניים בהידרציה פני דרכי הנשימה. היישום הקליני העיקריים של הבדיקה PD האף היא לסייע באבחון של CF, הפרעה גנטית קטלנית הנפוץ ביותר באוכלוסיות לבנה עם שכיחות ממוצע של 1 מתוך 2500 לידות חי בארצות אירופה. המבחן הוכיח זמן לעזור באבחון של הקלוש, oligo - או מונו-צורות סימפטומטי של CF מאובחן בדרך כלל בשלב מאוחר בחיים ועל הפרעות הקשורות CF כגון היעדרות הדו-צדדיים מולדות של צינור הזרע, אידיופטית דלקת לבלב כרונית, אלרגיות bronchopulmonary aspergillosis, ברונכיאקטזיס4. לאחרונה, הערכת clinometric אפנון טיפולית של CFTR בסיסי פגם5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 עשה שימוש המשטרה באף בניסויים קליניים של טיפולים חדשים CF. בהגדרה פרה, הותאם במבחן העכבר17 כדי לאפשר חקירה של bioactivity של חדש CF היעד טיפולים18,19,20,21. בעכברים, הטכניקה היא עדינה, בהתבסס על הבדלים אנטומיים הקשורות מינים בגודל של אזור האף, בין מכרסמים ובני אדם, בעיקר את התפקיד החיוני של תשומות חושים אזור nasofacial מכרסמים. זה דורש מפעילי מאומנים ומיומנים, אספקה וציוד ייעודי.
CF היא הפרעה רב מערכתי של בלוטות אקסוקרינית, במחלת נשימה כרונית אשר חולש על תמונה קלינית. המחלה נגרמת על ידי מוטציות בגן קידוד מחזורית של אדנוזין monophosphate (מחנה)-מוסדר CFTR כלוריד ערוץ22. עד כה, כבר יותר מ-2,000 CFTR מוטציות מזוהה23. הנפוץ ביותר מוטציה24,25, שנמצאו כמעט 90% של אללים CF, מקביל מחיקה של פנילאלנין מיקום 508 של פוליפפטיד של החלבון (F508del-CFTR). החלבון CFTR הוא ערוץ כלוריד מוליכות קטן ohmic גרידא. יש גם ראיות רבות CFTR מווסת את התחבורה מנגנונים אחרים, בפרט, ENaC26,27. התחבורה פגומה אלקטרוליט, כולל מופחתת תלויי-CFTR כלוריד מוליכות ומוליכות מוגברת של נתרן תלויי-ENaC, מהווה סימן היכר של CF epithelia. הפגם לשעבר בא לידי ביטוי על ידי רה-מופחתת או ביטל פולריזציה בתגובה אלקטרוכימי בזרימת כלוריד הדרגתיות העדפה וגם תוספת של isoprenaline (אגוניסט β adrenergic המגבירה מחנה תאיים) או forskolin (אדנילאט cyclase אגוניסט, לא אושרה לשימוש קליני). הפגם השני משתקפת של hyperpolarization הבסיס של רירית האף (PD שליליים יותר) והתגובה מוגברת של amiloride, תרופה משתן חוסם ENaC28.
CF העכבר שימשו לעיתים קרובות במחקר CF ומודלים לא תסולא בפז בניתוח CF פתולוגיה. כיום, לפחות 15 דגמים כבר מתואר29, שלושה מהם נמצאים homozygous עבור הרלוונטיות ביותר קלינית F508del מוטציה30,31,32. אחד אלה זנים שלוש30, שפותחה ב אוניברסיטת ארסמוס ברוטרדם, שימש במשך כמעט 20 שנה במעבדות אוניברסיטת catholique דה בלוביין (UCL). Cftrtm1Eur דגם30 הוכיחה להיות שימושי מאוד ללמוד פתופיזיולוגיה multiorgan של מחלות CF, כדי לבדוק את היעילות של אסטרטגיות טיפוליות18,19,החדש20, 21. עלולות להתרחש בעיות רבות במהלך או מוקדם לאחר (< 24 שעות ביממה) הבדיקה PD האף בעכברים. בנייר זה, מתוארים העומק נאותה של הרדמה הדרושה של קטטר האף בחיי עיר זלוף רציפה, אמצעים כדי להימנע broncho-השאיפה של פתרונות perfused באף. הטיפול בבעלי חיים בסוף המבחן הוא גם כמתואר לעיל, כולל ניהול של שילוב של נוגדנים של הרדמה, מובילים במהירות להחזרתם ההרדמה עם התאוששות מלאה של בעלי החיים. בסך הכל, הליכים אלה מאפשרים מדידות אמין באופן ספונטני נשימה עכברים, התמותה הקשורות מבחן מופחתת, חוזרים לבדוק את אותה חיה. נציג נתונים המתקבלים במבחן PD האף ב- CF וב -עכבר פראי-סוג שמוצג ודן.
פרוטוקול מאתר משטרת באף מבחן הוא דיווח בהפעלות 3: הערכת וניהול לפני, במהלך, ואחרי הבדיקה. Pre-test הערכה וניהול, הפרוטוקול של הכנה של הקטטר האף לומן כפול ושל פתרונות לשימוש רציף זלוף האף מתואר בפירוט. במהלך ההערכה ואת ניהול חלקים של הבדיקה, את הגדרת הניסוי והטיפול של העכבר הוא מסוגל גזור. לבסוף, ניהול של בעל, בסוף הבדיקה מתואר לשיפור התאוששות מלאה בבעלי חיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1092px;" width="1091">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Portex polyethylene tube&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td>
			<td style="width:225px;">Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td>
			<td style="width:167px;">to prepare capillary tubes for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode cream</td>
			<td style="width:403px;">Parker, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:225px;">Redux cream</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:403px;">Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">JNS BNT131-1,0</td>
			<td>measuring and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amiloride hydrochloride</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">A7410</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">F6886</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knick Portamess voltmeter</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Portavo 904 pH</td>
			<td>to measure potential difference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraly SW 112 Software&#160;</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Paraly SW112 software</td>
			<td>to capture potential difference data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">midazolam&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Mylan, Hoeilaart, Belgium</td>
			<td style="width:225px;">Dormicum 15mg/3ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic premedication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fentanyl</td>
			<td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td>
			<td>Domitor 1 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">droperidol&#160;</td>
			<td>Janssen&#160; Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clonidine&#160;</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td>
			<td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">refernce IV catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td>
			<td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps&#160;</td>
			<td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Dumont #5, Fine science Tools</td>
			<td>to place the nasal catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">naloxone&#160;</td>
			<td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td>
			<td>Narcan, 0.4 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">atipamezole&#160;</td>
			<td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td>
			<td>Antisedan, 5 mg/ml</td>
			<td>to serve as a medetomedine specific antidote&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Heating pads&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td>
			<td>to avoid hypothermia during and after the test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Peristaltic pump P1</td>
			<td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td>
			<td>18111091</td>
			<td>to perfuse solutions in the mouse nose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:403px;">Loctite, Henkel, D&#252;sseldorf, Germany&#160;</td>
			<td style="width:225px;">super glue 3</td>
			<td>to glue together two capillary tubes&#160; for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">NaCl</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0926S-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">M7304</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551128</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551139</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Na gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">S2054</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ca gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">C8231</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0089M-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">BD needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td>
			<td style="width:225px;">BD 26G (0.45x10 mm)</td>
			<td>intraperitoneal injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

הבדיקה הפרש פוטנציאל האף שימש כמעט שלושה עשורים כדי לסייע באבחון של סיסטיק פיברוזיס (CF). זה הוכיח להיות מועיל במקרים של הקלוש, oligo - או מונו-צורות סימפטומטי של CF מאובחן בדרך כלל בשלב מאוחר בחיים ועל הפרעות הקשורות CF כגון היעדרות הדו-צדדיים מולדות של צינור הזרע, אידיופטית דלקת לבלב כרונית, אלרגיות bronchopulmonary aspergillosis, ברונכיאקטזיס. הגדרות קלינית והן פרה, המבחן שימש סמן כדי לכמת את התגובות יישוב אסטרטגיות טיפוליות עבור עדכון טווח CF. הבדיקה כדי עכבר הוא מאתגר, יכולה להצריך של התמותה המשויך. מאמר זה מתאר את העומק נאותה של הרדמה נדרש לשמור עם קטטר האף בחיי עיר עבור זלוף רציפה. זה פירוט צעדים כדי למנוע broncho-השאיפה של פתרונות perfused באף. הוא גם מתאר את הטיפול בבעלי חיים בסוף הבדיקה, כולל ניהול של שילוב של נוגדנים תרופות הרדמה, מובילים במהירות להחזרתם ההרדמה עם שחזור מלא של בעלי החיים. נציג נתונים שהושגו CF, עכבר פראי-סוג מראים כי המבחן מפלה בין CF ו- CF. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר מדידות אמין למעמד הפונקציונאלי של מובילי הנתרן הכלוריד הטרנס-אפיתל בעכברים נושם באופן ספונטני, כמו גם בדיקות מרובות של אותה חיה תוך צמצום הקשורות מבחן התמותה.

כדי להמחיש את העיוותים תחבורה יון אופיינית ב- CF, בוצעו מדידות PD באף בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל על העכבר F508del-CF, פקד פראי-סוג של FVB/129 רקע גנטי מהמושבה בריסל של Cftrtm1Eur עכברים30. מודל זה הרלוונטית קלינית, מחסה השכיחה ביותר ואחד חמור ביותר F508del-CFTR מוטציה<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את הפרש הפוטנציאלים האף בעכברים. הבדיקה מכמת את הפונקציה של יון transmembrane מובילים כגון המתקן מוליכות transmembrane סיסטיק פיברוזיס, תעלת נתרן אפיתל. זה חשוב כדי להעריך את היעילות של טיפולים חדשניים סיסטיק פיברוזיס.

האף הפרש הפוטנציאלים לכמת תחבורה טרנס-אפיתל יון בעכברים

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

שימוש היקף זהה מוטיבים רגולטוריות פוטנציאלים גנים Coregulated

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; בכליות

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

שיטות ששונו לטעינת לוחות מיצוי DNA בתפוקה גבוהה להפחית את הפוטנציאל לזיהום

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

תאי אפיתל האף האנושיים העיקריים: ביובנקינג בהקשר של רפואה מדויקת

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...