Name: nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Forfatterne takker Prof J. Lebacq for kritisk redigering manuskriptet. Cftrtm1Eur (homozygous F508del-CFTR (FVB/129) mus ble utviklet av Erasmus MC, Rotterdam i Nederland, med støtte fra det europeiske fellesskap europeiske koordinering handling for forskning i cystisk fibrose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Studier og prosedyrer ble godkjent av den etiske komiteen for Forsøksdyrutvalget UCL (2017/UCL/MD/015) og med EU regelverket for dyr bruk i forskning (CEE n ° 86/609). Etterforskerne er kvalifisert for dyr eksperimentering etter direktivet 2010/63/EU av Europaparlamentet og Rådet for 22 September 2010 på beskyttelse av dyr som brukes til vitenskaplige formål.
1. pre test vurdering og ledelse
<ol><li>Forberede den doble lumen nasal kateter. Merk: En nasal kateter er laget som en dobbe...

Formålet med dette dokumentet er å beskrive en tilstrekkelig protokoll for å måle nasal PD under kontinuerlig perfusjon av løsninger i spontant puste mus for lang tid som kreves for å teste integriteten til ion transportører, hovedsakelig CFTR og ENaC. Alle trinn av protokollen har nøye blitt optimalisert for å sikre full dyr og god kvalitet og reproduserbar. I særdeleshet, kritisk trinn er ledelse og anestesi vurdering, og tilstrekkelig dyr posisjon under og etter testen.
Tidligere ...

For nesten tre tiår, har elektriske potensielle forskjellen (PD) målinger blitt brukt til å evaluere funksjonell status transmembrane ion transportører uttrykt på nese mucosa, som representant for den distale airways1. Som en må dynamisk test2,3, nasal PD lar funksjonelle Disseksjon av cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR) og epithelial natrium kanal (ENaC) aktivitet, lokalisert begge på apikale membraner av epitelceller og utøve avgjørende roller i airway overflaten hydration. Den store klinisk anvendelsen av nese PD testen er å bistå i diagnostisering av CF, den vanligste dødelig genetisk lidelsen i kaukasiske populasjoner med en gjennomsnittlig forekomst av 1 av 2500 levendefødte i europeiske land. Testen har lenge vist seg nyttig i diagnostisering av dempes, oligo - eller mono-symptomatisk former for CF vanligvis diagnostisert senere i livet, og CF-relaterte lidelser som medfødt bilaterale fravær av vas deferens, idiopatisk kronisk pankreatitt, allergisk bronkopulmonal aspergillose og bronkiektasier4. Nylig clinometric evaluering av terapeutiske modulering av den grunnleggende CFTR feil5,6,7,8,9,10,11 ,,12,,13,,14,,15,,16 har gjort bruk av nese PD i kliniske forsøk av nye CF terapier. I innstillingen prekliniske har testen blitt tilpasset mus17 tillate undersøkelse av bioactivity nye CF mål terapi18,19,20,21. I mus er teknikken delikat, basert på arter anatomiske forskjeller i størrelse nese regionen mellom gnagere og mennesker, og hovedsakelig på den viktige rollen sensoriske innspill fra nasofacial regionen i gnagere. Det krever trent og dyktig operatører, dedikert utstyr og forsyninger.
CF er en multi systemisk lidelse av exocrine kjertler, i som kronisk luftveissykdom dominerer det kliniske bildet. Sykdommen er forårsaket av mutasjoner i genet koding syklisk adenosin monofosfat (cAMP)-regulert CFTR chloride kanal22. Hittil har mer enn 2000 CFTR mutasjoner vært identifisert23. De vanligste mutasjon24,25, funnet i nesten 90% av CF alleler, tilsvarer en sletting av fenylalanin i posisjon 508 polypeptid kjeden av protein (F508del-CFTR). CFTR protein er en rent ohmsk liten konduktans klorid kanal. Det er også betydelige bevis at CFTR regulerer andre transportmekanismer, spesielt ENaC26,27. Defekt elektrolytt transport, inkludert redusert CFTR-avhengige klorid konduktans og økt ENaC-avhengige natrium ledningsevne, er et kjennetegn på CF epithelia. Tidligere feilen gjenspeiles gjennom en redusert eller avskaffet repolarization svar på både elektrokjemiske gradient favoring klorid middelklasseinnbyggere og tillegg av isoprenaline (en β-adrenerge Agonistiske som øker intracellulær leiren) eller forskolin (en adenylate cyclase Agonistiske, ikke godkjent for klinisk bruk). Den siste feilen gjenspeiles av en basal hyperpolarization av nese mucosa (en mer negativ PD) og en økt respons på amilorid, et vanndrivende stoff som blokkerer ENaC28.
CF musen modeller er ofte brukt i CF forskning og har vært uvurderlig i å dissekere CF patologi. I dag, har minst femten modeller vært beskrevet29, hvorav tre er homozygous den mest klinisk relevante F508del mutasjon30,31,32. En av disse tre påkjenningen30, utviklet ved Erasmus University i Rotterdam, er brukt i nesten 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratoriet. Cftrtm1Eur modell30 har vist seg for å være svært nyttig å studere i multiorgan Patofysiologien ved CF sykdommen og å teste effekten av nye strategier18,19,20, 21. Mange problemer kan oppstå under eller tidlig etter (< 24 h) nasal PD testen i mus. I denne utredningen tilstrekkelig dybden av anestesi nødvendig for å holde en nasal kateter i situ for kontinuerlig perfusjon og tiltak for å unngå broncho-aspirasjon av løsninger parfyme i nesen er beskrevet. Dyr omsorg på slutten av testen er også beskrevet, inkludert administrasjon av en kombinasjon av motgift bedøvende stoffer, fører til raskt snu anestesi med fullstendig gjenoppretting av dyrene. Sammen kan disse prosedyrene pålitelig mål i spontant puste mus, redusert dødelighet, test og Gjenta testen i samme dyret. Representant data fra nese PD testen i en CF og vill-type mus vises og diskutert.
Murine nasal PD testprotokollen rapporteres i tre økter: vurdering og ledelse før, under og etter testen. For pre-test for vurdering og styring, er protokollen for utarbeidelsen av den doble lumen nasal kateter og løsninger brukes for kontinuerlig nasal perfusjon beskrevet i detalj. Under vurdering og ledelse deler av testen, er eksperimentelle oppsett og håndtering av musen minuttbasis dissekert. Til slutt, behandling av dyr på slutten av testen er beskrevet for å forbedre full dyr utvinning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1092px;" width="1091">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Portex polyethylene tube&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td>
			<td style="width:225px;">Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td>
			<td style="width:167px;">to prepare capillary tubes for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode cream</td>
			<td style="width:403px;">Parker, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:225px;">Redux cream</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:403px;">Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">JNS BNT131-1,0</td>
			<td>measuring and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amiloride hydrochloride</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">A7410</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">F6886</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knick Portamess voltmeter</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Portavo 904 pH</td>
			<td>to measure potential difference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraly SW 112 Software&#160;</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Paraly SW112 software</td>
			<td>to capture potential difference data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">midazolam&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Mylan, Hoeilaart, Belgium</td>
			<td style="width:225px;">Dormicum 15mg/3ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic premedication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fentanyl</td>
			<td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td>
			<td>Domitor 1 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">droperidol&#160;</td>
			<td>Janssen&#160; Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clonidine&#160;</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td>
			<td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">refernce IV catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td>
			<td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps&#160;</td>
			<td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Dumont #5, Fine science Tools</td>
			<td>to place the nasal catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">naloxone&#160;</td>
			<td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td>
			<td>Narcan, 0.4 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">atipamezole&#160;</td>
			<td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td>
			<td>Antisedan, 5 mg/ml</td>
			<td>to serve as a medetomedine specific antidote&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Heating pads&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td>
			<td>to avoid hypothermia during and after the test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Peristaltic pump P1</td>
			<td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td>
			<td>18111091</td>
			<td>to perfuse solutions in the mouse nose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:403px;">Loctite, Henkel, D&#252;sseldorf, Germany&#160;</td>
			<td style="width:225px;">super glue 3</td>
			<td>to glue together two capillary tubes&#160; for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">NaCl</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0926S-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">M7304</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551128</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551139</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Na gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">S2054</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ca gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">C8231</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0089M-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">BD needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td>
			<td style="width:225px;">BD 26G (0.45x10 mm)</td>
			<td>intraperitoneal injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

Nasal potensielle forskjellen testen har blitt brukt i nesten tre tiår for å bistå i diagnostisering av cystisk fibrose (CF). Det har vist seg å være nyttig i tilfeller av dempes, oligo - eller mono-symptomatisk former for CF vanligvis diagnostisert senere i livet, og CF-relaterte lidelser som medfødt bilaterale fravær av vas deferens, idiopatisk kronisk pankreatitt, allergisk bronkopulmonal aspergillose og bronkiektasier. I både kliniske og prekliniske har testen blitt brukt som en biomarkør å kvantifisere Svar å målrettet strategier for jf Adapting testen til en mus er utfordrende og kan medføre en tilknyttet dødelighet. Dette dokumentet beskriver tilstrekkelig dybden av anestesi forpliktet til en nasal kateter i situ for kontinuerlig perfusjon. Den viser tiltak for å unngå broncho-aspirasjon av løsninger parfyme i nesen. Den beskriver også dyr omsorg på slutten av testen, inkludert administrasjon av en kombinasjon av motgift av bedøvende narkotika, fører til raskt snu anestesi med full gjenoppretting av dyrene. Representant data fra en CF og vill-type mus viser at testen diskriminerer mellom CF og ikke-CF. Helt, protokollen beskrevet her kan pålitelig målinger av funksjonell status for trans-epitelial klor og natrium transportører i spontant puste mus, samt flere tester i samme dyr samtidig redusere test-relaterte dødelighet.

For å illustrere de karakteristiske ion transport unormalt i CF, ble nasal PD målinger utført følger protokollen beskrevet ovenfor i en F508del-CF mus og en vill-type kontroll av FVB/129 genetisk bakgrunn fra Brussel kolonien Cftrtm1Eur mus30. Dette klinisk relevante modell, skjuler de vanligste og en av de mest alvorlige F508del-CFTR mutasjon23,24,25, er be...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Her presenterer vi en protokoll for å måle nasal potensielle forskjellen i mus. Testen kvantifiserer funksjon transmembrane ion transportører som cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator og epithelial natrium kanalen. Det er verdifullt å evaluere effekten av romanen terapi for cystisk fibrose.

Nasal potensiell forskjell å kvantifisere Trans-epitelial Ion Transport i mus

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

En effektiv Manuell utbeining metode for å forberede Intakt Mouse Nasal Tissue med bevart Anatomisk Organization

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrking av menneskelig Nasal Epitelceller på Air Flytende Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Funksjonell Karakterisering av Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Vekslere av intracellulære Bruke Proton-drapet Selection å uttrykke dem på plasmamembranen

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Bruk av Enzymatisk Biosensors å kvantifisere Endogent ATP eller H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; I Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikker for å indusere og kvantifisere Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Modifiserte metoder for lasting av DNA-ekstraksjonsplater med høy gjennomstrømning reduserer potensialet for kontaminering

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Primære humane neseepitelceller: Biobanking i sammenheng med presisjonsmedisin

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...