Name: nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00
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Os autores Agradecemos a Prof J. Lebacq edição criticamente o manuscrito. CFTRtm1Eur (homozigotos ratos F508del-CFTR (FVB/129) foram desenvolvidos por Erasmus MC, Rotterdam, Países Baixos, com o apoio da Comunidade Económica Europeia acção de Coordenação Europeia para a investigação no 6º PQ UE de fibrose cística LHHM-CT-2005-018932.

Os estudos e procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética para pesquisas com animais da UCL (2017/UCL/MD/015) e de acordo com as normas da Comunidade Europeia para uso de animais na pesquisa (CEE n º 86/609). Os investigadores estão qualificados para a experimentação animal, seguindo a Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos.
1. pré-teste de avaliação e gestão
<o...

O objetivo deste trabalho é descrever um protocolo adequado para medição PD nasal sob perfusão contínua de soluções em espontaneamente ratos de respirar por um período de tempo necessário para testar a integridade dos transportadores de íons, principalmente CFTR e ENaC. Todas as etapas do protocolo foram cuidadosamente otimizadas para garantir a recuperação completa de animais e de boa qualidade e de dados podem ser reproduzidos. Em particulares, a críticos passos são avaliação de anestesia e de gestão e...

Há quase três décadas, utilizaram-se medições elétricas de diferença (PD) potencial para avaliar o estado funcional de transportadores de íons transmembrana expressado na mucosa nasal, como representante das vias aéreas distais1. Como uma dinâmica multipasso teste2,3, nasal PD permite funcional dissecação de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) e atividade de sódio epitelial canal (ENaC), ambos localizados na membrana apical as células epiteliais e exercendo cargos críticos na superfície hidratação das vias aéreas. A principal aplicação clínica do teste PD nasal é auxiliar no diagnóstico da CF, a doença genética fatal mais comum em populações caucasianas com uma incidência média de 1 de 2.500 nascidos vivos em países europeus. O teste de tempo revelou-se útil no diagnóstico das formas oligo - ou mono-sintomática atenuada, da CF, geralmente diagnosticados mais tarde na vida e de distúrbios relacionados com a CF, tais como ausência bilateral congênita de deferente, pancreatite crónica idiopática, alérgica aspergilose broncopulmonar e bronquiectasias4. Mais recentemente, clinometric avaliação de modulação terapêutica do CFTR básico defeito5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 tem feito uso do PD nasal em ensaios clínicos de novas terapias de CF. Na configuração de pré-clínicos, o teste foi adaptado para o rato17 para permitir a investigação da Bioatividade da nova CF terapias alvo18,19,20,21. Em camundongos, a técnica é delicada, com base em espécies relacionadas com diferenças anatômicas no tamanho da região nasal entre roedores e seres humanos e principalmente sobre o papel essencial de entradas sensoriais da região nasofacial em roedores. Requer operadores treinados e qualificados, equipamentos e suprimentos.
CF é uma desordem sistêmica múltipla das glândulas exócrinas, na qual doença respiratória crônica domina o quadro clínico. A doença é causada por mutações no gene da codificação do adenosina monofosfato cíclica (cAMP)-regulamentado CFTR cloreto canal22. Até à data, mais de 2.000 mutações CFTR foram identificados23. O mais comum mutação24,25, encontrado em quase 90% dos alelos CF, corresponde a uma exclusão da fenilalanina na posição 508 da corrente do polypeptide da proteína (F508del-CFTR). A proteína CFTR é um canal de cloreto puramente ôhmica da condutibilidade. Também há evidência considerável que CFTR regula outros mecanismos de transporte, em particular, ENaC26,27. Transporte de eletrólito defeituosos, incluindo a condutância de cloreto CFTR-dependente reduzida e maior condutância de sódio ENaC-dependente, é uma característica dos epitélios CF. O antigo defeito é refletido por uma repolarização reduzida ou abolida em resposta a um eletroquímico efluxo favorecendo gradiente de cloreto e a adição de isoproterenol (β-adrenérgico agonista que aumenta cAMP intracelular) ou forskolin (um adenilato ciclase agonista, não aprovada para uso clínico). O último defeito é refletido por uma hiperpolarização basal da mucosa nasal (um PD mais negativa) e uma resposta aumentada a amilorida, um medicamento diurético que bloqueia ENaC28.
Modelos de rato CF têm sido frequentemente utilizados na investigação de CF e tem sido inestimáveis em dissecando patologia CF. Hoje em dia, pelo menos quinze modelos têm sido descritos29, três dos quais são homozigotos para a mutação F508del mais clinicamente relevantes30,31,32. Dentre estes três estirpes30, desenvolvido na Universidade de Erasmus em Roterdão, tem sido usado por quase 20 anos no laboratório Université catholique de Louvain (UCL). O modelo detm1Eur de Cftr30 provou para ser muito útil para estudar a dysregulation fisiopatologia da doença CF e para testar a eficácia de novas estratégias terapêuticas18,19,20, 21. Inúmeros problemas podem ocorrer durante ou início após (< 24h) o teste de PD nasal em ratos. Neste trabalho, são descritos a profundidade adequada de anestesia necessária para manter um cateter nasal em situ para perfusão contínua e medidas para evitar Bronco-aspiração de soluções perfundidos no nariz. O cuidado animal no final do teste também é descrito, incluindo a administração de uma combinação de antídotos de drogas anestésicas, levando a inverter rapidamente a anestesia com completa recuperação dos animais. No total, estes procedimentos permitem medições correctas em ratos de respirar espontaneamente, reduzida mortalidade relacionados ao teste e repetir o teste no mesmo animal. Obtidos a partir do teste de PD nasal em um CF e em um rato selvagem-tipo de dados representativos são mostrados e discutidos.
O protocolo de teste PD nasal murino é relatado em três sessões: avaliação e gestão antes, durante e depois do teste. No pré-teste avaliação e gestão, o protocolo de preparação do cateter de lúmen duplo nasal e de soluções usadas para perfusão nasal contínua é descrito em detalhes. Durante a avaliação e gestão porções do teste, a instalação experimental e a manipulação do mouse é minuciosamente dissecado. Finalmente, a gestão do animal no final do teste é descrito para melhorar a recuperação total de animais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1092px;" width="1091">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Portex polyethylene tube&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td>
			<td style="width:225px;">Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td>
			<td style="width:167px;">to prepare capillary tubes for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode cream</td>
			<td style="width:403px;">Parker, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:225px;">Redux cream</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:403px;">Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">JNS BNT131-1,0</td>
			<td>measuring and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amiloride hydrochloride</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">A7410</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">F6886</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knick Portamess voltmeter</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Portavo 904 pH</td>
			<td>to measure potential difference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraly SW 112 Software&#160;</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Paraly SW112 software</td>
			<td>to capture potential difference data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">midazolam&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Mylan, Hoeilaart, Belgium</td>
			<td style="width:225px;">Dormicum 15mg/3ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic premedication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fentanyl</td>
			<td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td>
			<td>Domitor 1 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">droperidol&#160;</td>
			<td>Janssen&#160; Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clonidine&#160;</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td>
			<td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">refernce IV catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td>
			<td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps&#160;</td>
			<td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Dumont #5, Fine science Tools</td>
			<td>to place the nasal catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">naloxone&#160;</td>
			<td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td>
			<td>Narcan, 0.4 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">atipamezole&#160;</td>
			<td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td>
			<td>Antisedan, 5 mg/ml</td>
			<td>to serve as a medetomedine specific antidote&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Heating pads&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td>
			<td>to avoid hypothermia during and after the test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Peristaltic pump P1</td>
			<td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td>
			<td>18111091</td>
			<td>to perfuse solutions in the mouse nose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:403px;">Loctite, Henkel, D&#252;sseldorf, Germany&#160;</td>
			<td style="width:225px;">super glue 3</td>
			<td>to glue together two capillary tubes&#160; for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">NaCl</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0926S-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">M7304</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551128</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551139</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Na gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">S2054</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ca gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">C8231</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0089M-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">BD needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td>
			<td style="width:225px;">BD 26G (0.45x10 mm)</td>
			<td>intraperitoneal injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

O teste de diferença de potencial nasal tem sido usado por quase três décadas para auxiliar no diagnóstico de fibrose cística (CF). Provou ser útil em casos de atenuado, oligo - ou mono-sintomática formas de CF geralmente diagnosticados mais tarde na vida e de distúrbios relacionados com a CF, tais como ausência bilateral congênita de deferente, pancreatite crónica idiopática, alérgica aspergilose broncopulmonar e bronquiectasias. Em contextos clínicos e pré-clínicos, o teste tem sido utilizado como um biomarcador para quantificar respostas para estratégias terapêuticas específicas para adaptação cf. o teste de um rato é um desafio e pode acarretar uma mortalidade associada. Este paper descreve a profundidade adequada de anestesia necessária para manter um cateter nasal em situ para perfusão contínua. Ele enumera as medidas para evitar Bronco-aspiração de soluções perfundidos no nariz. Ele também descreve o cuidado animal no final do teste, incluindo a administração de uma combinação de antídotos das drogas anestésicas, levando a inverter rapidamente a anestesia com recuperação total dos animais. Dados representativos obtidos de um CF e um rato selvagem-tipo mostram que o teste discrimina entre CF e não-CF. No total, o protocolo descrito aqui permite medições correctas do estatuto funcional de trans-epitelial transportadores de cloreto e sódio em ratos de respirar espontaneamente, bem como vários testes no mesmo animal reduzindo relacionados ao teste mortalidade.

A fim de ilustrar as anomalias de transporte do íon característico em CF, foram realizadas medidas de PD nasais seguindo o protocolo descrito acima em um rato F508del-CF e um controle do tipo selvagem do fundo genético FVB/129 da colônia de Bruxelas CFTRtm1Eur ratos30. Este modelo clinicamente relevante, abrigando um dos mais graves F508del-CFTR mutação23,24,25<...

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Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a diferença de potencial nasal em ratos. O teste quantifica a função de transportadores transmembrana de íons como o regulador de condutância transmembranar de fibrose cística e o canal de sódio epitelial. É valioso para avaliar a eficácia de novas terapias para a fibrose cística.

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

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