Name: nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Авторы благодарят профессор J. Lebacq за критически редактирования рукопись. МВТРtm1Eur (гомозиготных F508del-МВТР (FVB/129) мышах были разработаны Программа Erasmus MC, Роттердам, Нидерланды, при поддержке Европейской координации действий Европейского экономического сообщества для исследований в 6РП ЕС муковисцидоза LHHM-CT-2005-018932.

Исследования и процедуры были утверждены Этический Комитет для исследования животных UCL (2017/UCL/MD/015) и по согласованию с правилами Европейского сообщества для использования животных в научных исследованиях (CEE n ° 86/609). Следователи являются квалифицированными для экспериментов на животн...

Цель этого документа заключается в описания надлежащей протокол для измерения носовой PD под непрерывной перфузии решений в спонтанно дыхание мышей для сколько времени требуется для проверки целостности ионных транспортеров, главным образом МВТР и ENaC. Все шаги протокола были тщательн...

На протяжении почти трех десятилетий Электроизмерения потенциальных разницы (PD) были использованы для оценки функционального состояния трансмембранных ионных транспортеров, выраженных на слизистую оболочку носа, как представитель дистальных дыхательных путей1. Как многоэтапный динамического испытания2,3, носовые, PD позволяет функциональной рассечение муковисцидоз регулятор трансмембранной проводимости (МВТР) и активность канала (ENaC) эпителиальных натрия, оба локализованы в апикальной мембраны эпителиальные клетки и оказывают важную роль в гидратации поверхности сократимость миокарда. Основные клиническое применение носовой PD теста заключается в оказании помощи в диагностике CF, наиболее распространенным смертельным генетическое заболевание в кавказских популяциях с средняя распространенность 1 из 2500 родившихся в европейских странах. Испытание давно оказалась полезной в диагностике ослабленных, олиго - или моно симптоматическое форм CF, обычно диагностируется позднее в жизни и расстройств, связанных с CF, таких как врожденное отсутствие двусторонних семяпроводов, идиопатическим хроническим панкреатитом, аллергические аспергиллез бронхолегочной и бронхов4. Совсем недавно clinometric оценки терапевтических модуляции основных МВТР дефект5,6,,78,9,10,11 ,12,13,14,,1516 сделал использования носовое PD в клинических испытаниях новых терапий CF. В параметре доклинические, тест была адаптирована к мыши17 чтобы расследования отпорности новой CF целевой терапии18,19,,2021. В мышей техника деликатный, основанных на связанных видов анатомические различия в размерах носовой региона между грызунов и людьми и главным образом на важную роль сенсорные входы от регионе носогубные грызунов. Она требует подготовленных и квалифицированных операторов, специального оборудования и предметов снабжения.
CF это мульти системные расстройства экзокринных желез, в котором хронические респираторные заболевания доминирует клинической картины. Заболевание вызвано мутациями в гене кодирования циклический аденозинмонофосфат (лагерь)-регулируется МВТР хлорид канала22. На сегодняшний день, более чем 2000 МВТР мутации были определены23. Наиболее распространенными мутации24,25, в почти 90% CF аллелей, соответствует удаления фенилаланина в положении 508 полипептидной цепи белка (F508del-МВТР). МВТР белок является чисто омического небольшая проводимость хлорид канал. Существует также немало свидетельств того, что МВТР регулирует другие транспортных механизмов, в частности, ENaC26,27. Дефектные электролит транспорта, включая снижение проводимости хлорид МВТР зависимых и увеличение проводимости натрия ENaC зависимых, является отличительной чертой CF эпителия. Бывший дефект отражается уменьшить или ликвидировать реполяризации в ответ на электрохимических градиентов пользу хлорид измеряем и добавлением изопреналин (β-адренергическим агонистом, что увеличивает внутриклеточную лагерь) или форсколин (adenylate циклазы агонист, не разрешены для клинического использования). Последний дефект отражается базальной гиперполяризации слизистой оболочки носа (более негативные PD) и увеличение ответ на амилорид, мочегонный препарат, который блокирует ENaC28.
CF мыши модели часто использовались в исследованиях CF и неоценимое значение в рассекает CF патологии. В настоящее время по крайней мере пятнадцать модели были описаны29, три из которых являются гомозиготных для наиболее клинически значимых F508del мутации30,,3132. Один из этих трех штаммов30, разработанная в Университете Эразма в Роттердаме, был использован для почти 20 лет в лаборатории Лувен (UCL)-де-католический университет. МВТРtm1Eur модель30 оказался весьма полезным для изучения множественная Патофизиология болезни CF и проверить эффективность новых терапевтических стратегий18,19,20, 21. Могут возникнуть многочисленные проблемы, во время или после раннего (< 24 h) носовой PD тест у мышей. В этом документе описаны адекватной глубины анестезии, необходимых для поддержания носовой катетер на месте для непрерывной перфузии и меры во избежание бронхо стремление решений, увлажненную в нос. Также описан ухода за животными в конце теста, включая администрации комбинации антидотов анестетики, ведущих к быстро обратить вспять анестезии с полным восстановлением животных. Вообще эти процедуры позволяют надежных измерений в спонтанно дыхание мышей, снижение смертности, связанной с испытаний и повторяя тест в то же самое животное. Репрезентативных данных, полученных из носовой PD теста в CF и одичал тип мыши отображаются и обсуждены.
Мышиных носовой протокол испытаний на PD сообщается в рамках трех сессий: Оценка и управление до, во время и после испытания. В предварительной оценки и управления подробно описывается протокол подготовки двойной просвет носовой катетер и растворов, используемых для постоянно носовых перфузии. В ходе оценки и управления части теста скрупулезно рассекается экспериментальной установки и обработки мыши. Наконец управление животного в конце теста описано улучшить полный животных восстановления.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1092px;" width="1091">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Portex polyethylene tube&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td>
			<td style="width:225px;">Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td>
			<td style="width:167px;">to prepare capillary tubes for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode cream</td>
			<td style="width:403px;">Parker, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:225px;">Redux cream</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:403px;">Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">JNS BNT131-1,0</td>
			<td>measuring and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amiloride hydrochloride</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">A7410</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">F6886</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knick Portamess voltmeter</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Portavo 904 pH</td>
			<td>to measure potential difference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraly SW 112 Software&#160;</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Paraly SW112 software</td>
			<td>to capture potential difference data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">midazolam&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Mylan, Hoeilaart, Belgium</td>
			<td style="width:225px;">Dormicum 15mg/3ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic premedication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fentanyl</td>
			<td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td>
			<td>Domitor 1 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">droperidol&#160;</td>
			<td>Janssen&#160; Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clonidine&#160;</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td>
			<td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">refernce IV catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td>
			<td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps&#160;</td>
			<td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Dumont #5, Fine science Tools</td>
			<td>to place the nasal catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">naloxone&#160;</td>
			<td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td>
			<td>Narcan, 0.4 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">atipamezole&#160;</td>
			<td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td>
			<td>Antisedan, 5 mg/ml</td>
			<td>to serve as a medetomedine specific antidote&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Heating pads&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td>
			<td>to avoid hypothermia during and after the test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Peristaltic pump P1</td>
			<td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td>
			<td>18111091</td>
			<td>to perfuse solutions in the mouse nose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:403px;">Loctite, Henkel, D&#252;sseldorf, Germany&#160;</td>
			<td style="width:225px;">super glue 3</td>
			<td>to glue together two capillary tubes&#160; for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">NaCl</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0926S-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">M7304</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551128</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551139</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Na gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">S2054</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ca gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">C8231</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0089M-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">BD needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td>
			<td style="width:225px;">BD 26G (0.45x10 mm)</td>
			<td>intraperitoneal injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

Носовые потенциальных разница тест использовался для почти трех десятилетий для оказания помощи в диагностике кистозный фиброз (CF). Оказалось, чтобы быть полезным в случаях ослабленных, олиго - или моно симптоматическое форм CF, обычно диагностируется позднее в жизни и расстройств, связанных с CF, таких как врожденное отсутствие двусторонних семяпроводов, идиопатическим хроническим панкреатитом, аллергические аспергиллез бронхолегочной и бронхоэктазы. В доклинических и клинических параметров был использован тест как биомаркер для количественной оценки ответов на целевых терапевтических стратегий для адаптации CF. тест для мыши является сложной задачей и может повлечь за собой связанные смертности. Этот документ описывает адекватной глубины анестезии, необходимых для поддержания носовой катетер на месте для непрерывной перфузии. В нем перечислены меры во избежание бронхо стремление решений, увлажненную в нос. Он также описывает ухода за животными в конце теста, включая администрации комбинации антидотов анестетики, ведущих к быстро обратить вспять анестезии с полного восстановления животных. Репрезентативных данных, полученных из CF и одичал тип мыши показывает, что тест проводится дискриминация между CF и -CF. В целом протокол, описанные здесь позволяет надежных измерений функционального состояния транс эпителиальных хлорид и натрия транспортеров в спонтанно дыхание мышей, а также несколько тестов, в то же самое животное при одновременном снижении связанных с тест смертности.

Для того чтобы проиллюстрировать характерные ионного транспорта ненормальности в CF, носовые PD измерения проводились после протокол, описанных выше, в мыши F508del-CF и в элементе одичал тип генетический фон FVB/129 от Брюссельской колонии МВТР мышейtm1Eur 30. Э...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Здесь мы представляем протокол для измерения носовой разности потенциалов в мышах. Тест дает количественную оценку функции трансмембранных ионных транспортеров как регулятор трансмембранной проводимости кистозный фиброз и эпителиальных натриевых каналов. Это ценно для оценки эффективности новых терапий для муковисцидоз.

Носовые разности потенциалов для количественного определения транс эпителиальных ионный транспорт в мышей

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Сотовые к клетке высокомолекулярных транспорта Пробирной В Планта Используя Biolistic Бомбардировка

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

Использование СФЕРА для выявления потенциальных регулирования мотивы в Coregulated Гены

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Эффективный метод обвалки Руководство Подготовиться Интактные Мышь носовой ткани с сохранением анатомической организации

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Функциональная характеристика Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Теплообменники внутриклеточных отсеках с помощью Протон-убивает Выбор выразить их в плазматической мембране

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Использование ферментативного биосенсоров для Количественно эндогенного АТФ или H<sub&gt; 2</sub&gt; О<sub&gt; 2</sub&gt; В почках

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Методы индуцируют и Quantify Cellular Старение

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Модифицированные методы загрузки высокой пропускной способности пластин извлечения ДНК снижают потенциал загрязнения

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Первичные эпителиальные клетки носа человека: биобанкинг в контексте прецизионной медицины

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...