Name: nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Författarna vill tacka Prof. J. Lebacq för kritiskt redigering manuskriptet. CFTRtm1Eur (homozygot F508del-CFTR (Kandeekane/129) möss har utvecklats av den Erasmus MC, Rotterdam, Nederländerna, med stöd av Europeiska ekonomiska gemenskapen Europeiska samordning åtgärder för forskning om cystisk fibros EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

De studier och förfaranden som godkändes av den etiska kommittén för djurförsök av UCL (2017/UCL/MD/015) och i samförstånd med Europeiska gemenskapens regler för användning av djur i forskning (CEE n ° 86/609). Utredarna är kvalificerade för de djurförsök som efter direktiv 2010/63/EU av Europaparlamentet och rådet av den 22 September 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål.
1. testa före bedömning och hantering
<ol><li>Förbereda dubbel lumen nasal ...

Syftet med denna uppsats är att beskriva ett adekvat protokoll för mätning av nasal PD under kontinuerlig perfusion av lösningar i spontant andning möss för en tidsperiod som krävs för att testa integriteten för ion transportörer, främst CFTR och ENaC. Alla steg i protokollet har noga optimerats för att säkerställa full djur återhämtning och god kvalitet och reproducerbara data. I synnerhet, kritiska steg är anestesi bedömning och hantering och adekvat djur position och hand under och efter provet.
...

I nästan tre decennier, har elektriska potentiella skillnaden (PD) mätningar använts att utvärdera transmembrana ion transportörer uttryckt på nässlemhinnan, som företrädare för den distala luftvägar1funktionella status. Som en utgångsämnet dynamisk prov2,3, nasal PD tillåter funktionella dissektion av cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) och epitelial natrium kanal (ENaC) aktivitet, lokaliserad både till apikala membranen i epitelceller och utövar kritiska roller i airway surface återfuktning. Stora kliniska tillämpningen av nasal PD testet är att bistå vid diagnos av CF, den vanligaste dödlig genetisk sjukdomen hos kaukasiska populationer med en genomsnittlig incidens av 1 av 2500 levande födda i Europeiska länder. Testet har länge visat sig användbart vid diagnos av försvagat, oligo - eller mono-symtomatisk former för CF oftast diagnostiseras senare i livet, och CF-relaterade störningar såsom medfödd bilateral avsaknad av sädesledaren, idiopatisk kronisk pankreatit, allergisk bronkopulmonell aspergillos och bronkiektasi4. Mer nyligen, clinometric utvärdering av den terapeutiska moduleringen av den grundläggande CFTR defekt5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 har utnyttjat den nasala PD i kliniska prövningar av nya CF terapier. I inställningen för prekliniska har test anpassats till mus17 till möjliggöra undersökning av bioaktiviteten av nya CF mål terapier18,19,20,21. Hos möss är tekniken delikat, baserat på arter-relaterade anatomiska skillnader i storlek i regionen nasal mellan gnagare och människa, och främst på den viktiga rollen som sensoriska input från regionen nasofacial hos gnagare. Det kräver välutbildade och kompetenta operatörer, dedikerad utrustning och förnödenheter.
CF är en multi systemisk sjukdom av exokrina körtlar, som kronisk respiratorisk sjukdom dominerar den kliniska bilden. Sjukdomen orsakas av mutationer i den gen som kodar de cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)-reglerade CFTR klorid kanal22. Hittills har mer än 2.000 CFTR-mutationer varit identifierade23. Den vanligaste mutationen24,25, Funna i nästan 90% av CF-alleler, motsvarar en borttagning av fenylalanin i position 508 i kedjan polypeptid av proteinet (F508del-CFTR). Det CFTR-proteinet är en renodlat ohmsk små konduktans klorid kanal. Det finns också betydande bevis att CFTR reglerar andra transportmekanismer, i synnerhet ENaC26,27. Defekt elektrolyt transport, inklusive minskad CFTR-beroende klorid konduktans och ökad ENaC-beroende natrium konduktans, är ett kännetecken för CF epitel. Den tidigare defekten återspeglas genom en sänkta eller avskaffade repolarisering svar på både en elektrokemisk gradient gynnar klorid efflux och tillägg av isoprenalin (en β-adrenerg receptoragonist som ökar intracellulära cAMP) eller forskolin (en hypofysadenylatecyclase cyclase agonist, inte godkänd för klinisk användning). Den sistnämnda defekten reflekteras av en basal hyperpolarisering av nässlemhinnan (en mer negativ PD) och en ökad respons till amilorid, ett urindrivande läkemedel som blockerar ENaC28.
CF musmodeller har ofta används i CF forskning och har varit ovärderliga i dissekera CF patologi. Minst femton modeller har nuförtiden, varit beskrivs29, varav tre är homozygota för den mest kliniskt relevanta F508del-mutationen30,31,32. En av dessa tre stammar30, utvecklat vid Erasmusuniversitetet i Rotterdam, har använts i nästan 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. De Cftrtm1Eur modell30 har visat sig vara mycket användbart att studera leverfunktiontest patofysiologin av CF sjukdom och att testa effekten av nya terapeutiska strategier18,19,20, 21. Många problem kan uppstå under eller tidigt efter (< 24 h) nasal PD testet hos möss. I detta dokument beskrivs tillräckligt djup anestesi krävs för att hålla en nasal katetern i situ för kontinuerlig perfusion och åtgärder för att undvika Bronko-aspiration av lösningar perfusion i näsan. Djurvård i slutet av testet beskrivs också, inklusive administration av en kombination av motgift av bedövningsmedel droger, leder till snabbt vända anestesi med fullständig återhämtning av djuren. Sammantaget tillåta dessa förfaranden pålitliga mätningar i spontant andning möss, minskade test-relaterad mortalitet och upprepa testet i samma djur. Representativa uppgifter som erhållits från nasal PD testet i en CF och en vildtyp mus visas och diskuteras.
Murina nasal PD testprotokollet rapporteras i tre sessioner: bedömning och hantering före, under och efter provet. I pre-test för bedömning och hantering beskrivs protokollet av beredning av dubbel lumen nasal katetern och lösningar som används för kontinuerlig nasal perfusion i detalj. Under bedömning och hantering av delar av testet, är experimentell installationen och hanteringen av musen minutiöst dissekeras. Slutligen, hantering av djur i slutet av testet beskrivs för att förbättra hela djur återhämtning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1092px;" width="1091">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Portex polyethylene tube&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td>
			<td style="width:225px;">Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td>
			<td style="width:167px;">to prepare capillary tubes for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode cream</td>
			<td style="width:403px;">Parker, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:225px;">Redux cream</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:403px;">Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">JNS BNT131-1,0</td>
			<td>measuring and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amiloride hydrochloride</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">A7410</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">F6886</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knick Portamess voltmeter</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Portavo 904 pH</td>
			<td>to measure potential difference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraly SW 112 Software&#160;</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Paraly SW112 software</td>
			<td>to capture potential difference data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">midazolam&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Mylan, Hoeilaart, Belgium</td>
			<td style="width:225px;">Dormicum 15mg/3ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic premedication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fentanyl</td>
			<td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td>
			<td>Domitor 1 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">droperidol&#160;</td>
			<td>Janssen&#160; Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clonidine&#160;</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td>
			<td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">refernce IV catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td>
			<td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps&#160;</td>
			<td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Dumont #5, Fine science Tools</td>
			<td>to place the nasal catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">naloxone&#160;</td>
			<td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td>
			<td>Narcan, 0.4 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">atipamezole&#160;</td>
			<td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td>
			<td>Antisedan, 5 mg/ml</td>
			<td>to serve as a medetomedine specific antidote&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Heating pads&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td>
			<td>to avoid hypothermia during and after the test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Peristaltic pump P1</td>
			<td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td>
			<td>18111091</td>
			<td>to perfuse solutions in the mouse nose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:403px;">Loctite, Henkel, D&#252;sseldorf, Germany&#160;</td>
			<td style="width:225px;">super glue 3</td>
			<td>to glue together two capillary tubes&#160; for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">NaCl</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0926S-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">M7304</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551128</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551139</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Na gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">S2054</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ca gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">C8231</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0089M-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">BD needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td>
			<td style="width:225px;">BD 26G (0.45x10 mm)</td>
			<td>intraperitoneal injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

Nasal potentiella skillnaden testet har använts i nästan tre decennier för att bistå vid diagnos av cystisk fibros (CF). Det har visat sig vara till hjälp i fall av försvagade, oligo - eller mono-symtomatisk former för CF oftast diagnostiseras senare i livet, och CF-relaterade störningar såsom medfödd bilateral avsaknad av sädesledaren, idiopatisk kronisk pankreatit, allergisk bronkopulmonell aspergillos och bronkiektasi. I både kliniska och prekliniska inställningar, har testet använts som en biomarkör att kvantifiera Svaren till riktade behandlingsstrategier för jfr anpassa testet till en mus är utmanande och kan medföra en associerad dödlighet. Detta dokument beskriver tillräcklig djup anestesi krävs för att upprätthålla en nasal katetern i situ för kontinuerlig perfusion. En lista över åtgärder för att undvika Bronko-aspiration av lösningar perfusion i näsan. Här beskrivs också djurvård i slutet av testet, inklusive administration av en kombination av motgift av bedövningsmedel droger, leder till snabbt vända anestesi med fullständig återhämtning av djuren. Representativa uppgifter som erhållits från en CF och en vildtyp mus visar att testet diskriminerar mellan CF och icke-CF. Sammantaget tillåter protokollet beskrivs här tillförlitliga mätningar av trans-epitelial klorid och natrium transportörer i spontant andning möss, liksom flera tester på samma djur samtidigt minska funktionell status test-relaterade mortalitet.

För att illustrera den karakteristiska ion transport avvikelser i CF, utfördes nasal PD mätningar efter det protokoll som beskrivs ovan i en F508del-CF-mus och en vildtyp kontroll av Kandeekane/129 genetiska bakgrunden från Bryssel kolonin CFTRtm1Eur möss30. Denna kliniskt relevant modell, härbärgerat den vanligaste och en av de mest allvarliga F508del-CFTR mutation23,24,<sup cl...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Här presenterar vi ett protokoll för att mäta nasal potentialskillnaden i möss. Testet kvantifierar funktionen av transmembrana ion transportörer såsom cystisk fibros transmembrane conductance regulator och kanalen epitelial natrium. Det är värdefullt att utvärdera effekten av nya behandlingar för cystisk fibros.

Nasal potentialskillnaden att kvantifiera Trans-epitelial Ion Transport i möss

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

En cell-till-cell Macromolecular transport-analys I Planta Använda Biolistic beskjutning

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

Använda utrymme för att identifiera potentiella Regulatory motiv i Coregulated Gener

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

En effektiv Manuell styckning förfarande för framställning av Intakt Mouse Nasal Tissue med bibehållen Anatomical Organization

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Funktionell karakterisering av Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Värmeväxlare av intracellulära Utrymmen Använda Proton-dödande Urval att uttrycka dem på plasmamembranet

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Användning av enzymatisk Biosensors att kvantifiera Endogenous ATP eller H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; I Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Tekniker för att inducera och kvantifiera cellulärt åldrande

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Modifierade metoder för lastning av hög genomströmning DNA extraktionsplattor minska potential för kontaminering

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Primära mänskliga nasala epitelceller: Biobanking i samband med precisionsmedicin

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...