Name: nanosensors to detect protease activity in vivo for noninvasive diagnostics
Uploaded: 2018-07-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por un Director de NIH nuevo innovador Award (premio no. DP2HD091793). Q.D.M. es apoyado por la NSF investigación becas postgrado (Grant no. DGE-1650044). B.A.H es apoyado por el nacional institutos de salud GT BioMAT beca de formación bajo la concesión número 5T32EB006343, así como la beca del Presidente de Tech de Georgia. G.A.K. tiene un premio de carrera en la interfaz científica desde el fondo de la recepción de Burroughs. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Aprobación institucional institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la institución del investigador es necesaria llevar a cabo los siguientes experimentos animales. Además, son necesarios adecuadamente para llevar a cabo estos centros de atención animal estándar (por ejemplo, cámaras, campanas animales estériles, cámaras de isofluorane para anestesia y CO2 cámaras para euthanization ético extremo de la vivienda) experimentos. Entrenamiento especial y ayuda con estas instalacion...

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Este método describe el desarrollo de nanosensores basados en la actividad de proteasa sustratos conjugados a un núcleo de nanopartículas. El evento de clivaje proteolítico es apodado el interruptor"farmacocinético", porque los productos de peptide hendido son más pequeños que el límite de tamaño renal filtración de 5 nm23 y filtro en orina para producir una señal no invasiva. Por lo tanto, es importante utilizar nanopartículas o portadores con un radio hidrodinámico que es más grand...

Las proteasas son enzimas multifuncionales que se especializan en la hidrólisis de enlaces peptídicos y tener un control significativo sobre muchos procesos biológicos, incluyendo homeostasis, Alostasis y enfermedad1. Un estado alterado de la actividad de la proteasa se ha correlacionado a una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades cardiovasculares, que los candidatos atractivos proteasas para desarrollo de biomarcadores clínicos2,3. Por otra parte, actividad de las proteasas es pathogeneses funcionalmente vinculados a distintas, los resultados del paciente y pronóstico de la enfermedad4. En términos generales, se han desarrollado biosensores para detectar varios fenómenos biológicos y procesos de enfermedades, como cáncer, enfermedades neurodegenerativas y transferencia de electrones5,6,7,8 , 9. más específicamente, sensores basados en el sustrato de la proteasa se han desarrollado para detectar la actividad de la proteasa e incluyen sondas fluorógenos para diagnóstico proyección de imagen10 y etiquetados isotópicamente sustratos péptido para in vitro detección por espectrometría de masas11. Además, se han desarrollado sondas basadas en la actividad, que contienen sustrato-como regiones que unen o modificar el destino proteasa12. Con este método, la proteasa destino irreversible es inhibida cuando se modifica el sitio activo, y el análisis requiere la cosecha de tejido, que se limita a aplicaciones en vivo . Sin embargo, es importante sentir proteasa actividad en vivo, porque la regulación de la actividad de las proteasas es pesadamente dependiente en el contexto de otras actividades biológicas como la presencia de inhibidores endógenos.
El objetivo de este trabajo es describir la formulación de nanosensores basados en actividades que detectan actividad proteasa en vivo produciendo una señal medible en orina. Esta plataforma se utiliza como un diagnóstico no invasivo para diferenciar enfermedades complejas como el cáncer mediante el uso de actividad de las proteasas altera como un biomarcador funcional. Nuestra plataforma de nanosensor consiste en óxido de hierro nanopartículas (IONP) conjugadas con sustratos de la proteasa. Estos sustratos son terminados por un reportero fluorescente que se libera cuando las proteasas desdoblan el sustrato. Estos IONPs circulan en vivo, localización sitios de enfermedad y exponen sustratos activos proteasas asociadas a la enfermedad. Después de hendidura, reporteros fluorescentes son liberados y, debido a su pequeño tamaño, se filtran en orina, mientras que sustratos uncleaved en el IONP permanecen en el cuerpo. Por lo tanto, un aumento en las actividades de proteasa en vivo dará como resultado concentraciones más altas del reportero en orina (figura 1). Puesto que nuestra plataforma es una prueba de orina, es necesario no hay plataforma de proyección de imagen y señales de diagnóstico están enriquecidas en la orina.
Esta plataforma puede ser diseñada para detectar una variedad de enfermedades incluyendo cáncer, fibrosis y trombosis13,14. Aquí describimos el diseño de nanosensores para detectar elevaciones en curación de matriz 9 (MMP9) actividad como un biomarcador del cáncer colorrectal. El cáncer colorrectal es la segunda causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos, con un estimado 136.800 nuevos casos y 50.300 muertes en 2014 solo15. Las células del tumor colorrectal producen MMP9, que se ha demostrado para conducir la progresión maligna, degradación de la matriz, así como metástasis16. Además, identificamos un substrato conveniente péptido (PLGVRGK) para MMP9 de la literatura17. Esta plataforma puede usarse para detección temprana de cáncer y el diagnóstico de punto de atención de bajo costo13,14,18,19,20,21.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg"> Figura 1: esquema de Nanosensor actividad en vivo. Nanosensores circulan a través del cuerpo y localización a los sitios de la enfermedad. Entonces, las proteasas relacionadas con la enfermedad cleave sustratos péptido presentados por IONPs. El tamaño de los fragmentos exfoliados permite depuración renal, haciendo que se localiza en la orina. Después de que el animal orina, estos fragmentos de péptido pueden analizarse por su molécula reporter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">4652</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">18G needle</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89134-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">15 mL conicals</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">250 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Stir bar</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">58949-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Hot Plate/Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">97064-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Albumin from Bovine Serum (BSA)</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:233px;">A13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Iron (II) chloride tetrahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">44939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Epichlorohydrin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">45340-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">DMF</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ammonium Hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Hydroxide pellets</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">221465-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Borate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris base</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dextran</td>
			<td style="width:171px;">Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0020 9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:171px;">Malvern Panalytical</td>
			<td style="width:233px;">NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette</td>
			<td style="width:171px;">LifeTech</td>
			<td style="width:233px;">66130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dynabeads MyOne Tosylactivated</td>
			<td style="width:171px;">LifeTech</td>
			<td style="width:233px;">65501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">SIA</td>
			<td style="width:171px;">Life Tech</td>
			<td style="width:233px;">22349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">PEG 20k</td>
			<td style="width:171px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:233px;">MPEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fluorescein Antibody [2A3]</td>
			<td style="width:171px;">GeneTex</td>
			<td style="width:233px;">GTX10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Hiload 16/600 superdex 200</td>
			<td style="width:171px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:233px;">45-002-490</td>
			<td></td>
		</tr>
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			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Plate Reader</td>
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			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BD Insulin Syringes</td>
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			<td style="width:233px;">NC0872854</td>
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</table>

nanosensors to detect protease activity in vivo for noninvasive diagnostics

Las proteasas son enzimas multifuncionales que se especializan en la hidrólisis de enlaces peptídicos y controlan amplios procesos biológicos incluyendo homeostasis y Alostasis. Por otra parte, actividad de las proteasas altera unidades patogenesia y es un biomarcador funcional de enfermedades como el cáncer; por lo tanto, la capacidad de detectar actividad proteasa en vivo puede proporcionar información clínicamente relevante para el diagnóstico biomédico. El objetivo de este protocolo es crear nanosensores que probe para actividad proteasa en vivo produciendo una señal cuantificable en la orina. Estos nanosensores de proteasa consisten en dos componentes: una nanopartícula y sustrato. Las funciones de nanopartículas para aumentar la entrega de Half-Life y el substrato de la circulación a sitios de enfermedad de destino. El sustrato es una secuencia de péptido corto (6-8 AA), que está diseñada para ser específicos de una proteasa de destino o grupo de las proteasas. El substrato se conjuga a la superficie de la nanopartícula y se termina por un reportero, como un marcador fluorescente para la detección. Como existen proteasas desdoblan el sustrato del péptido, el reportero se filtra en orina para cuantificación como un biomarcador de actividad de la proteasa. Adjunto describimos la construcción de un nanosensor de matriz metaloproteinasa 9 (MMP9), que se asocia con progresión del tumor y la metástasis, para detección de cáncer colorrectal en un modelo murino.

La mayoría de la población de las IONPs es alrededor del media de diámetro, que oscila entre 40-50 nm. Después de la pegilación, esta gama del tamaño tiene una vida media de circulación de aproximadamente 6 horas13 en vivo (ver Figura 2a). Si quiere seleccionar un rango de tamaño especial, uno puede utilizar cromatografía por exclusión de tamaño para aislar fracciones IONP con diferentes diámetros. Las nanopartíc...

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Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Las proteasas son fuertemente reguladas las enzimas implicadas en procesos biológicos fundamentales y desajuste proteasa actividad unidades progresión de enfermedades complejas como el cáncer. Este método pretende crear nanosensores que miden actividad proteasa en vivo produciendo una señal de escote que es detectable de la orina de host y discrimina la enfermedad.

Nanosensores para detectar actividad proteasa en Vivo para el diagnóstico no invasivo

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigación

Bioingeniería

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Levitación magnética Junto con Imaging portátil y Análisis para el diagnóstico de enfermedades

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Rígida fijación de fijo y manchados, todo, escala milimétrica muestras para histología sin sección 3D de tomografía Micro computada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

Organoides neuronales humanos para el estudio del cáncer cerebral y las enfermedades neurodegenerativas

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Metilización Específica Multiplex Droplet PCR usando el Dispositivo Generador de Gotas de Polímero para Diagnóstico Hematológico

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...