Name: isolation of retinal arterioles for ex vivo cell physiology studies
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
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Développement des protocoles décrits dans le présent document a été soutenu par les subventions accordées par les organismes de financement suivantes : BBSRC (BB/I026359/1), Fight for Sight (1429 et 1822), The Juvenile Diabetes Research Foundation (2003-2-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (4748/STL/13) et CRM (MC_PC_15026).

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	<li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy.">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li><li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients,+ocular+hypertensives,+and+normal+subjects.">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li><li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis.">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791 (2014).</li><li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2+-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle.">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin+1+stimulates+Ca2+-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2++release.">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li><li>Huynh, K. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy.">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li><li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy.">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li><li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. 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P. e. d. e. r. s. e. n., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo.">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li></ol>

Le Dr Joanna Kur est maintenant employé de Medtronic (Twin-Cities, Minnesota, USA), son travail actuel n’est pas incompatible avec celle présentée ici.

Les protocoles décrits ci-dessus nécessitent la pratique mais doivent être réalisables avec un minimum de dépannage. Sur une journée moyenne nous obtenir des artérioles utilisables de 6 à 8 de l’isolement et de réaliser des expériences réussies de 3-4. Si des problèmes surviennent, cependant, il y a quelques mesures qui peuvent être prises pour aider à améliorer le taux de réussite. Parfois nous avons trouvé, en particulier lors de l’utilisation de jeunes rats (< 8 semaines), que le rendement des artérioles peut être faible. Pour contourner ce problème, nous suggérons de centrifugation le tissu rétinien (10-30 s à 500 x g) entre chacun d’eux de la trituration étapes par étapes 1.12-1.14. Souvent, cela permet d’améliorer le rendement des navires mais permettra également d’augmenter la quantité de débris de cellules dans le cadre de la préparation.
Lorsque canulant navires pour études myographie pression, qu'il est important de vérifier les artérioles avec soin pour n’importe quel côté-branches qui peuvent avoir été clivés à proximité du site de bifurcation. Cela représente une cause fréquente de fuite et de perte de pression au cours de l’expérimentation. Le principal problème pouvant survenir avec les [Ca2 +]j’ai protocoles est le niveau de chargement de colorant. Chargement de colorant pauvre mène à faibles rapports signal-bruit, tout en surchargeant les résultats dans la perturbation de l’homéostasie2 + Ca normal. Pour réduire la probabilité d’une de ces questions, une petite aliquote d’homogénat rétinienne peut être enlevée, et vaisseaux isolés vérifié périodiquement pendant le protocole de chargement. Lorsque l’entreprise patch clamp expériences, le taux de réussite de la formation de gigaseal est fortement tributaire de comment bien la lame basale a été digérée. Quand ce protocole d’essai au départ ou à l’aide de nouveaux lots d’enzymes, il peut être nécessaire d’ajuster la concentration/durée de la digestion enzymatique. Attentivement suivi la séparation des couches endothéliales et muscle lisse assurera la digestion suffisante pour enlever assez basale (laminal) pour obtenir l’accès. Un suivi attentif est également nécessaire pour éviter la digestion excessive, qui peut se manifester comme le bateau commence à se contracter. Dans ce cas, les cellules musculaires lisses sont souvent trop fragiles pour enregistrement de patch clamp. Lorsque vous appliquez des enzymes, il est important d’inclure la DNAse I à garantir l’élimination des brins d’ADN libérée de cellules endommagées au cours du processus d’isolement. Fragments d’ADN sont collantes et causer la pince d’adhérer à l’artériole pendant les étapes finales du processus de nettoyage (étape 4.4), ce qui entraîne souvent la perte de navire. Nettoyage des vaisseaux est techniquement difficile et est mieux réalisé à fort grossissement (X 20) avec douces mouvements de balayage de pinces fermées de la plus belle possible diamètre. Entre les balayages, nettoyer la pince avec rouleau de laboratoire.
Comme l’a souligné plus tôt, une clé était motivée par le développement des protocoles décrits dans ce manuscrit afin de mieux comprendre pourquoi la circulation sanguine est perturbée au cours des maladies vasculaires rétiniennes. La plupart de nos travaux à ce jour ont porté sur l’oeil diabétique maladie28,33. Artérioles peuvent être isolées de la rétine des modèles expérimentaux de rongeurs du diabète à l’aide des méthodes décrites à l’article 1. Lors de l’expérimentation sur les artérioles rétiniennes isolées des animaux diabétiques, il est important d’essayer de reproduire étroitement les conditions hyperglycémiques vécues par les navires en vivo. Pour cette raison, nous soulèverions normalement les niveaux de D-glucose dans notre isolement et de la solutions expérimentales à 25 mM. Épaississement des membranes de sous-sol vasculaires est un phénomène bien connu dans les vaisseaux rétiniens au cours du diabète34,35. Lors de l’utilisation des animaux diabétiques prolongée (durée de la maladie > 1 mois), les concentrations de l’enzyme accrue ou digestion fois sont souvent nécessaire pour permettre l’application des méthodes d’enregistrement patch clamp.
Une limitation importante de l’utilisation ex vivo isolé des artérioles rétiniennes pour étudier la physiologie vasculaire rétinienne et la physiopathologie est la perte du neuropile rétinienne environnante. Bien que les cellules neuronales et gliales rétinienne permet un accès facile aux cellules le muscle lisse vasculaire rétinienne pour les études de physiologie cellulaire, la réponse des vaisseaux aux médiateurs vasoactifs peut changer de façon spectaculaire en absence et en présence de la rétine tissus. Les actions de l’adénosine triphosphate (ATP), par exemple, fournissent une bonne illustration de ce point. En isolé rat artérioles rétiniennes, addition d’ATP déclenche une robuste constriction des vaisseaux36, tandis que dans la présence d’un neuropile intact, les vaisseaux dilatent37. Par conséquent, dans la mesure du possible, nous essayons généralement de valider les résultats principaux de nos préparatifs arteriole isolés à l’aide de ex vivo rétinienne ensemble-montages et in vivo des mesures du bateau diamètre et sang écoulement16,37 . À noter, les nouvelles méthodes ont émergé récemment pour l’étude des petites artérioles et capillaires en entier perfusé rétines porcine ex vivo38,,39. Ces préparations sont susceptibles d’améliorer considérablement notre compréhension de comment la rétine neuropile régule la rétine tonus artériolaire et capillaire et comment les changements dans la rétine hémodynamique modulent l’activité neuronale dans la rétine.
Bien que les procédures décrites dans cet article sont axées sur l’utilisation des artérioles rétiniennes isolé du rat pour la physiologie des cellules des muscles lisses des artérioles compréhension, nous développons actuellement des protocoles pour permettre également à l’étude de la fonction des cellules endothéliales ces navires. Dans les travaux préliminaires, nous avons réussi à modifier la digestion enzymatique des segments d’artériolaires rétiniens pour produire des tubes de cellules endothéliales viables qui sont prêtent au Ca2 + imagerie et patchclamp études d’enregistrement. Canulation des artérioles isolés aux deux extrémités, permettant intraluminal fourniture de médicaments, pourrait à l’avenir également activer endothélium-dépendante réponses vasodilatatrice à étudier dans ces vaisseaux.

Comprendre comment contrôle-t-on l’irrigation sanguine de la rétine est un objectif important, étant donné que le débit sanguin anormal a été impliqué dans la pathogénie d’une variété de vue en danger maladies de la rétine1,2,3, 4. La circulation rétinienne, qui approvisionne les neurones de la rétine internes et les cellules gliales, conventionnè fin artère, avec tout le sang des artères rétiniennes et des artérioles en passant par les capillaires aux veinules rétiniennes et enfin les veines5. La circulation sanguine de la rétine est réglementée par le ton des artères rétiniennes et des artérioles ainsi que l’activité contractile de la péricytes situés sur les parois des capillaires rétiniens et veinules post capillaire6,7, 8. le contrôle du tonus vasculaire rétinienne est complex et est modulé par une série d’apports provenant du système circulatoire et le tissu rétinien environnant, y compris les gaz du sang circulant les molécules et les hormones, et substances vasoactives libéré de la rétinienne vasculaire endothélium et macroglia9,10,11. Les artérioles rétiniennes sont les petites branches artérielles de la rétine et sont composées d’une seule couche de cellules musculaires lisses vasculaires et une doublure intérieure de disposés longitudinalement les cellules endothéliales12,13, 14. ces vaisseaux forment le principal site de la résistance vasculaire dans la circulation rétinienne et jouent donc un rôle important dans le contrôle local de débit sanguin rétinien. Artérioles rétiniennes régulent le flux sanguin capillaire dans la rétine en dilatant ou en resserrant leur diamètre luminal, médiée par des changements dans le muscle lisse vasculaire contractilité10,15,16. La compréhension des mécanismes moléculaires par le biais de laquelle rétinienne réglementent les artérioles rétinienne perfusion nécessite donc préparations où les cellules des muscles lisses des artérioles peuvent être consultés et étudiés dans des conditions aussi près de physiologiques que possible.
Ex vivo des préparations des vaisseaux rétiniens isolés permettent d’accéder aux cellules musculaires lisses vasculaires, tout en conservant leur fonctionnalité et leur interconnectivité avec l’endothélium sous-jacent. La plupart des études à ce jour à l’aide de vaisseaux isolés ont mis l’accent sur les gros vaisseaux artériels bovin ou porcin (60 à 150 µm). Ceux-ci peuvent être montés en fil disponible dans le commerce ou systèmes myographe pression pour permettre l’interrogatoire pharmacologique du muscle lisse vasculaire cellule contractile mécanismes17,18. Ces préparations ont grandement contribué à notre connaissance de la physiologie vasculaire rétinienne dans des conditions normales. Peu d’études ont utilisé des artérioles rétiniennes isolés de petits animaux de laboratoire comme leur plus petit diamètre (~ 8-45 µm) empêche leur utilisation dans les systèmes conventionnels de myographie19,20,21,22. Un avantage important, toutefois, de l’utilisation de navires de petits animaux de laboratoire est la grande disponibilité de modèles de maladies génétiquement modifiées, transgéniques et rétiniennes. Petits animaux de laboratoire sont également plus propices pour des études in vivo intervention.
Nous décrivons ici les protocoles simples pour isoler et canulant artérioles rétiniennes rat pour expériences myographie de pression. Ca2 + imagerie et électrophysiologie protocoles à l’aide de ces navires sont également détaillés. Ces peuvent encore donner un aperçu de la réglementation de la contractilité du muscle lisse vasculaire et la circulation sanguine de la rétine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15409083</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-109-3542</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette/ transfer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1174</td>
			<td>6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Brunel Microscopes LTD</td>
			<td></td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Dumont #5 14095</td>
			<td>Any equivalent fine forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11546963</td>
			<td>Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741</td>
			<td>Or any equilavent 10cm product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette teat</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12426180</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified water supply</td>
			<td>Merek</td>
			<td>Milli-Q Integral Water Purification System</td>
			<td>Or any equilavent system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed test tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-958-10 B</td>
			<td>5 mL; any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seratted forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-230</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>Or any pliable surface&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testtube rack</td>
			<td>Fisherbrand Derlin</td>
			<td>10257963</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure myography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-axis mechanical manipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-7&#160;</td>
			<td>x2 (or any equilavent product)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way taps</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UY-30600-02</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation&#160;</td>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software&#160;</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td>
			<td>Free imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis plugin</td>
			<td>Myotraker&#160;</td>
			<td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td>
			<td>Custom plugin for imageJ Freely available for download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulation pipette glass</td>
			<td>World Percision instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7010</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>RS</td>
			<td>206-3722</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Make 1 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Dumont #7 14097</td>
			<td>Any equivalent fine forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Make 1 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottomed recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0759</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helper pipette glass</td>
			<td>World Percision instruments</td>
			<td>IB150F-3</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line heater</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclypse TE 300</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manometer</td>
			<td>Riester</td>
			<td>LF1459</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P97</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge +&#160; Olympus CX 31 microscope</td>
			<td>Glassworks</td>
			<td>Fine Point F-550</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel delivery manifold&#160;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>Perfusion Pencil</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler&#160;</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>1mL</td>
			<td>Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction pump</td>
			<td>Interpet</td>
			<td>AP1</td>
			<td>Converted aeration pump by reversing bellows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>20mL Luer-lok</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Advent</td>
			<td>W558818</td>
			<td>75&#956;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>miscellaneous sizes</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>&#160;Logitech&#160;</td>
			<td>HD Pro Webcam C920</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video capture software</td>
			<td>Hypercam</td>
			<td>version 2.28.01</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>Sub Aqua 12 Plus</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20 lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x/0.40 WD 3.8, &#8734;/0.17</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x4 lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4x/0.10, WD 30, &#8734;/-</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connectors</td>
			<td>World Percision Instruments</td>
			<td>14012</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamping</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way taps</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UY-30600-02</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-axis mechanical manipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-7&#160;</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation&#160;</td>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2411</td>
			<td>3 mg disolved daily in 50 &#956;L of DMSO (sonicate to dissolve)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200a</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analogue digital converter</td>
			<td>Axon</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891&#160;</td>
			<td>0.1mg/mL in LCH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7010</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>RS</td>
			<td>206-3722</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>260913</td>
			<td>Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Any equilavent commerical product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>No. 7</td>
			<td>Any superfine forcep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottomed recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0759</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line heater</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclypse TE 300</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P97</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge +&#160; Olympus CX 31 microscope</td>
			<td>Glassworks</td>
			<td>Fine Point F-550</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel delivery manifold&#160;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>Perfusion Pencil</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patching software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Pclamp v10.2</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler&#160;</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>1mL</td>
			<td>Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Type XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147&#160;</td>
			<td>0.01mg/mL in LCH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipette glass</td>
			<td>World Percision instruments</td>
			<td>IB150F-3</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction pump</td>
			<td>Interpet</td>
			<td>AP1</td>
			<td>Converted aeration pump by reversing bellows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>20mL Luer-lok</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Advent</td>
			<td>W557418</td>
			<td>50&#956;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>miscellaneous sizes</td>
			<td>Any equilavent product to fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>&#160;Logitech&#160;</td>
			<td>HD Pro Webcam C920</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>Sub Aqua 12 Plus</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole cell pipette glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-7.5</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20 lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x/0.40 WD 3.8, &#8734;/0.17</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x4 lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4x/0.10, WD 30, &#8734;/-</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x40 lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x/0.55, WD 2.1, &#8734;/1.2</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connectors</td>
			<td>World Percision Instruments</td>
			<td>14012</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+ imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way taps</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UY-30600-02</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-axis mechanical manipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-7&#160;</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software&#160;</td>
			<td>Cairn Research Ltd.</td>
			<td>Acquisition Engine V1.1.5</td>
			<td>Or any equilavent product; microfluorimetry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation&#160;</td>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software for confocal imaging</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td>
			<td>Free imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7010</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica Geosystems</td>
			<td>SP5&#160;</td>
			<td>Or any equilavent product; confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>RS</td>
			<td>206-3722</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>No. 7</td>
			<td>Any superfine forcep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottomed recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0759</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line heater</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000</td>
			<td>Or any equilavent product; microfluorimetry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator&#160;</td>
			<td>Cairn Research Ltd.</td>
			<td>Optoscan</td>
			<td>Or any equilavent product; microfluorimetry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel delivery manifold&#160;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>Perfusion Pencil</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler&#160;</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>1mL</td>
			<td>Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for confocal microscope</td>
			<td>Leica Geosystems</td>
			<td>LAS-AF version 3.3.</td>
			<td>Or any equilavent product; confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction pump</td>
			<td>Interpet</td>
			<td>AP1</td>
			<td>Converted aeration pump by reversing bellows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>20mL Luer-lok</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Advent</td>
			<td>W557418</td>
			<td>50&#956;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>miscellaneous sizes</td>
			<td>Any equilavent product to fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>Sub Aqua 12 Plus</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x100 lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>x100 N.A. 1.3 oil</td>
			<td>Or any equilavent product; microfluorimetry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20 lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x/0.40 WD 3.8, &#8734;/0.17</td>
			<td>Or any equilavent product; microfluorimetry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20 lens</td>
			<td>Leica Geosystems</td>
			<td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &#8734;/0.17/D</td>
			<td>Or any equilavent product; confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x4 lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4x/0.10, WD 30, &#8734;/-</td>
			<td>Or any equilavent product; microfluorimetry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x4 lens</td>
			<td>Leica Geosystems</td>
			<td>C PLAN, 4x/0.10, &#8734;/-/&#10013;</td>
			<td>Or any equilavent product; confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x63 lens</td>
			<td>Leica Geosystems</td>
			<td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS &#8734;/0.17/E</td>
			<td>Or any equilavent product; confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connectors</td>
			<td>World Percision Instruments</td>
			<td>14012</td>
			<td>Or any equilavent product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helper pipette</td>
			<td>World Percision instruments</td>
			<td>IB150F-3</td>
			<td>Inner diameter: 0.86 mm 
			Ramp: 261 
			Pressure: 300 
			Heat: 280 
			Pull : 0 
			Velocity: 56 
			Time: 250 
			No of cycles: 4 
			Tip diameter: 0.5-2 &#956;m 
			Polishing: yes 
			Final Resistance: &#62;10 M&#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulation pipette</td>
			<td>World Percision instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Inner diameter: 1.17 mm 
			Ramp: 290 
			Pressure: 300 
			Heat: 280 
			Pull : 0 
			Velocity: 58 
			Time: 150 
			No of cycles: 4 
			Tip diameter: 3-10 &#956;m 
			Polishing: no 
			Final Resistance: &#60;1 M&#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-cell patching</td>
			<td>World Percision instruments</td>
			<td>IB150F-3</td>
			<td>Inner diameter: 0.86 mm 
			Ramp: 261 
			Pressure: 300 
			Heat: 280 
			Pull : 0 
			Velocity: 56 
			Time: 250 
			No of cycles: 4 
			Tip diameter: 0.5-2 &#956;m 
			Polishing: yes 
			Final Resistance: &#62;5 M&#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole-cell patching</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-7.5</td>
			<td>Inner diameter: 1.17 mm 
			Ramp: 296 
			Pressure: 200 
			Heat: 287 
			Pull : 0 
			Velocity: 50 
			Time: 250 
			No of cycles: 4 
			Tip diameter: 2-3 &#956;m 
			Polishing: helpful but not necessary 
			Final Resistance: 1-2 M&#937;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of retinal arterioles for ex vivo cell physiology studies

La rétine est un tissu hautement métaboliquement actif nécessitant une irrigation sanguine importante. La circulation rétinienne soutient la rétine interne, tandis que les navires choroïdienne fournissent les photorécepteurs. Altérations rétinienne perfusion contribuer aux nombreux troubles vue en danger, y compris la rétinopathie diabétique, occlusion de la veine glaucome et la direction générale de la rétine. Comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la circulation sanguine à travers la rétine, et comment elles sont modifiées au cours de la maladie oculaire pourrait conduire à l’identification de nouvelles cibles pour le traitement de ces conditions. Artérioles rétiniennes sont les vaisseaux de résistance principaux de la rétine et par conséquent, jouent un rôle clé dans la régulation de rétine hémodynamique à travers des changements de diamètre luminal. Ces dernières années, nous avons développé des méthodes pour isoler les artérioles de la rétine de rat qui conviennent à un large éventail d’applications, y compris les études de physiologie cellulaire. Cette préparation a déjà commencé à produire de nouvelles connaissances sur comment le débit sanguin est contrôlé dans la rétine et nous a permis d’identifier certaines des principaux changements qui se produisent au cours de la maladie oculaire. Dans cet article, nous décrit les méthodes pour l’isolement des artérioles rétiniennes rat et comprennent des protocoles pour leur utilisation en électrophysiologie patch clamp, imagerie calcique et études myographie de pression. Ces bateaux se prêtent également destiné à la PCR-, western blot et immunohistochimie dotés d’études.

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Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

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Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

La Ex vivo Préparation isolé microvaisseaux squelettique pour les enquêtes de la réactivité vasculaire

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de culture à étudier la thyroïde développement

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Cartographie spatio-temporelle de la motilité<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Préparation des intestins

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Visualisation et quantification de la couche acellulaire en artérioles du muscle Cremaster Rat

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Méthode Ex Vivo pour évaluer la motilité spontanée de la mouse Reproductive Tract et un algorithme de suivi des mouvements uterus basé sur MATLAB pour l'analyse des données

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Excroissance glomerulaire en tant qu’essai Ex Vivo pour analyser les voies impliquées dans l’activation des cellules épithéliales pariétales

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...