Name: spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון בסיסי למדע (IBS-R015-D1), על-ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1A6A1A03015642).

כל הניתוחים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת Sungkyunkwan.
1. הכנת הדוגמא
הערה: תא לחץ כל מכשירי ניתוח לפני לטיפול בבעלי חיים. לנהל את כל הביצועים כירורגית בחדר המוקדש ניתוחים. השמלות כירורגי סטרילי וכפפות לענידה על ידי כל אנשי ?...

<ol>
	<li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath.">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li><li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction.">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices.">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system?.">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?.</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li><li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath.">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo.">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li></ol>

SpeRe הוא חדש ללא תווית הדמיה מודאליות בהתבסס על אינטרפרומטריה ספקטרלי, המציעה בפעם הראשונה, את המידע הננומטרי בשידור חי ו דנדריטים. בפרוטוקול הנוכחי רכישה, הרזולוציה המרחבית עבור קוטר האקסון הוא מסדר 10 ננומטר. יתר על כן, SpeRe מנצל הזמנות-הגודל של ערכים מינון אור נמוך יותר בהשוואה microscopies סופר ?...

במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק גיאן מהירה ותקינות עצב על-ידי enwrapping הסיבים האקסון עם מעילי פרווה עלי הלוואי קרומיים מרובה שכבות. מבנהו מרובה שכבות מורכב לסירוגין הננומטרי דק-סרטים של ממברנות פלזמה (~ 5 nm), ציטוזול (~ 3 ננומטר), ורווחים חוץ-תאית (~ 7 ננומטר)1,2. מיקרוסקופ אופטי, כולל את מיקרוסקופ ברזולוציה-העל האחרונה, אינם מתאימים להתבוננות הדינמיקות המיאלין הננומטרי בשל הרזולוציה שלהן לא מספיק בשל עקיפה אופטי3,4,5. למרות מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לספק פרטים עדינים של ננו-מבנה המיאלין, זה לא תואם עם המערכות הביולוגיות חיים עקב ההכנות מדגם פולשני ביותר מעורבים קיבוע כימי ו ultrasectioning6,7 . עד לאחרונה היו לא טכניקה ישים להתבונן הננומטרי דינמיקת ו דנדריטים באתרו בתוך.
. Schain et al. דיווח בעבר ו דנדריטים התערוכה השתקפות אור צבעוני8. על ידי אימוץ הניתוח spectroscopic על האור המוחזר, אנחנו תכנן מודאליות הדמיה חדשה עבור ננו הדמיה של ו דנדריטים, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe)9. SpeRe מבוסס על ההפרעות סרט דק המתרחשים במבנה רב שכבתית של למעטפת מיאלין (איור 1). על ידי הדמיה אופטיים על אקסונים שונים, נחשפו כי הקשת השתקפות היא פונקציה מחזורית של מספר גל תקופתיות שלה (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) הוא ביחס הפוך ל קוטר האקסון (d). מערכת היחסים הזו פשוטה (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) מציע נתיישב כימות של קוטר האקסון של הנתונים SpeRe. ניצול זה, חשפנו את האקסון ונפוצים בולטות תחת פציעת מוח טראומטית קלה בדוח הקודם שלנו.
מערכת SpeRe מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית מורכב מקור לייזר מיוחדים, מסננים (איור 2). מקור קלט הוא לבן-אור לייזר, מתן הפס הרחב פלט ספקטרלי הגלויים לאזורים אינפרא-אדום. עבור הסריקה ספקטרלי, המערכת הינו מצויד עם שני התקנים אקוסטו אופטי: אקוסטו אופטי tunable מסנן (AOTF) להעברת אורך גל שנבחרו מן המקור פס קלט של הפיצול קרן אקוסטו אופטי (AOBS) עבור המנחה שנבחר משתקפת גל את הגלאי. התוכנה עבור היפרספקטרליות מיקרוסקופיה קונפוקלית (ראה טבלה של חומרים) מספק אפשרות להתאמה אישית סריקה ספקטרלי לרכוש ברצף התמונות השתקפות קלט באורכי גל שונים. בנוסף, אברציה כרומטית יכול להתערב באורח קשה במדידה ספקטרלי; לכן, השימוש העדשה המטרה עדשה אפוכרומטית מומלץ.
ראוי לציין, אור לבן לייזרים לייצר פלט ספקטרלי לא אחידה, רכיבים אופטיים גם להשפיע על הפרופיל ספקטרלי. לכן, ספקטרום רכשה לכייל לניתוח כמותי עוקבות. מראה כסוף מוגן משמש בדרך כלל כנקודת התייחסות, אשר מספק של השתקפות כמעט קבוע (> 97%) השתלטה על האזור מלא גלוי. ספקטרום שנרכשו לאחר מכן מחולקים לפי ספקטרום הפניה מן המראה.
גודל הצעד ספקטרלי עבור הסריקה ספקטרלי קובעת את מהירות הרכישה; לכן, זה צריך להיות מותאם. כמו האקסון גדולים יותר יש תקופה ספקטרלי גבוה יותר, זה דורש עדין ספקטרלי הדגימה. לדוגמה, האקסון בקוטר של 10 מיקרומטר, אחד האקסונים הפיזיולוגיות הגדול, יש תקופה ספקטרלי של ~ 8 nm. על-ידי החלת קריטריונים הדגימה של נייקוויסט, אנחנו מועסקים את מרווח הדגימה ספקטרלי של 4 nm כדי לכסות כל האקסונים הפיזיולוגיות ברקמות העכבר לחוץ. גישה זו נמשכת בדרך כלל במשך מספר שניות לקבלת סריקה מלאה ספקטרלי, ולכן הוא לא מתאים ליישומי ויוו , איפה הפיזיולוגיות תנועה (למשל נשימה ואת קצב לב) משבש את רכישת ספקטרלי יציב. בעבר פתרנו בעיה זו על-ידי instrumenting מיקרוסקופ זקופה המותאמת אישית, שנועדה להשיג את ספקטרום מלא עבור כל נקודה באמצעות ספקטרומטר של המערך (≈ מהירות של רכישת 30 ms לפיקסל).
בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט על ההדמיה SpeRe על פרוסה המוח קבוע, אשר ניתן לבצע במיקרוסקופ היפרספקטרליות המסחרי (ראה טבלה של חומרים). כך, הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי ניסויים ללא התמחות במכשור אופטי. אנחנו גם לכסות את בעיות אפשריות לפתרון בעיות עבור רכישת וניתוח של נתונים SpeRe.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apochromat objective 40&#215;, NA 1.1</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>15506357</td>
			<td>Water-immersion type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromyelin Green</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F34651</td>
			<td>Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 TCS microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Refer to the &#34;Configuration of microscope&#34; in Introduction Section for details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-X</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td>Coated with protected silver.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BP031a</td>
			<td>4% v/v in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3306</td>
			<td>Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Muto Pure Chemicals</td>
			<td>5116-20F</td>
			<td>Thickness: ~1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Brainetree Scientific</td>
			<td>BS-8000 DUAL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White-light laser</td>
			<td>NKT photonics</td>
			<td>EXB-6</td>
			<td>EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ

במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק בידוד חשמלי על-ידי enwrapping הסיבים האקסון ספירלה מרובה שכבות. בהשראת הארכיטקטורה subcellular-מאורגן, לאחרונה פיתחנו מודאליות הדמיה חדשה, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe), המאפשרת הדמיה ננו ללא תווית חסרת תקדים של חיה ו דנדריטים בתוך באתרו. העיקרון הבסיסי הוא לקבל מידע nanostructural על-ידי ניתוח הספקטרום השתקפות של המבנה subcellular מרובה שכבות. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לביצוע של הדמיה SpeRe בסיסיים של רקמות עצבים משתמש מסחרי במערכת מיקרוסקופיים קונאפוקלית, מצוידים לייזר אור לבן, מסנן tunable. אנחנו מכסים את תהליכי הכנת הדוגמא, רכישת נתונים ספקטרלי, עיבוד להשגת מידע nanostructural תמונה.

לפי הפרוטוקול, פרוסה המוח קבוע הוכן עם צביעת אקסוגני, fluorophore של פילוח מיאלין (ראה טבלה של חומרים). הדמיה SpeRe בוצעה על הפרוסה המוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי היפרספקטרליות מסחרי בשיתוף עם פלורסצנטיות קונאפוקלית הדמיה (איור 4a). עבור SpeRe, עוצמת קלט או?...

Watch this Scientific Journal Video about Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ at JoVE.com

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

מיקרוסקופ Reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר

כאן, אנו מציגים עבור הדמיה ו דנדריטים בפרוסה המוח קבוע באמצעות ננו ללא תווית הדמיה הטכניקה מבוססת על reflectometry ספקטרלי פרוטוקול צעד אחר צעד.

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; In vivo</em&lt;הקלטות תאיות

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...