Name: spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00
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इस कार्य को इंस्टीट्यूट ऑफ बेसिक साइंस (आईबीएल-R015-D1) द्वारा समर्थन और बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित शिक्षा मंत्रालय (2017R1A6A1A03015642) के माध्यम से किया गया ।

सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं Sungkyunkwan विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. नमूना तैयारी
नोट: पशु हैंडलिंग से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों ...

<ol>
	<li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath.">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li><li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction.">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices.">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system?.">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?.</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li><li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath.">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo.">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li></ol>

SpeRe एक नया लेबल-मुक्त इमेजिंग वर्णक्रमीय interferometry है, जो पहली बार के लिए, लाइव myelinated axons में नेनो जानकारी प्रदान करता है पर आधारित मोडल है । वर्तमान अधिग्रहण प्रोटोकॉल में, axon व्यास के लिए स्थानिक संकल्प 10 एनएम क?...

स्तनधारी तंत्रिका तंत्र में, myelin axon multilayered के आवरण के साथ झिल्लीदार फाइबर enwrapping द्वारा तेजी से तंत्रिका चालन और axonal अखंडता प्रदान करता है । इसकी multilayered संरचना बारी नेनो पतली-प्लाज्मा झिल्ली (~ 5 एनएम), cytosol (~ 3 एनएम), और extracellular रिक्त स्थान (~ 7 एनएम)1,2से बना फिल्मों से बना है । हाल ही में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी सहित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी, ऑप्टिकल विवर्तन के कारण उनके अपर्याप्त संकल्प के कारण नेनो myelin गतिशीलता अवलोकन के लिए उपयुक्त नहीं हैं3,4,5. हालांकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी myelin nanostructure के ठीक विवरण प्रदान कर सकते हैं, यह अत्यधिक इनवेसिव नमूना रासायनिक निर्धारण और6ultrasectioning शामिल तैयारियों के कारण रहने वाले जैविक प्रणालियों के साथ संगत नहीं है,7 . हाल ही में जब तक, वहां कोई तकनीक को सीटू मेंmyelinated axons के नेनो गतिशीलता निरीक्षण लागू किया गया है ।
Schain एट अल. पहले बताया गया है कि myelinated axons प्रदर्शन रंगीन प्रकाश चिंतनशील8. परिलक्षित प्रकाश पर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण अपनाने से, हमने myelinated axons के नेनो इमेजिंग के लिए एक नई इमेजिंग मोडल ईजाद की है, जिसका नाम वर्णक्रमीय reflectometry (SpeRe)9है । SpeRe myelin म्यान (चित्रा 1) की बहु स्तरित संरचना में होने वाली पतली फिल्म हस्तक्षेप पर आधारित है । विभिंन axons पर ऑप्टिक सिमुलेशन द्वारा, हमें पता चला है कि चिंतनशील स्पेक्ट्रम wavenumber के आवधिक कार्य है और इसकी आवधिकता (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) axon व्यास (डी) के लिए व्युत्क्रम आनुपातिक है । यह सरल संबंध (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) SpeRe डेटा से axon व्यास के सतही ठहराव प्रदान करता है । इस का उपयोग, हम प्रचलित axon हमारे पूर्व रिपोर्ट में हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के तहत उभार से पता चला ।
SpeRe प्रणाली फोकल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है और एक विशेष लेजर स्रोत और फिल्टर (चित्रा 2) के होते हैं । इनपुट स्रोत एक सफेद प्रकाश लेजर है, अवरक्त क्षेत्रों के लिए दिखाई ब्रॉडबैंड वर्णक्रमीय उत्पादन प्रदान करते हैं । वर्णक्रमीय स्कैन के लिए, प्रणाली दो acousto ऑप्टिक उपकरणों के साथ सुसज्जित है: एक acousto ऑप्टिक स्वरित्र फ़िल्टर (AOTF) इनपुट ब्रॉडबैंड स्रोत और एक acousto ऑप्टिक बीम अलगानेवाला (AOBS) चयनित मार्गदर्शक के लिए से एक चयनित तरंग दैर्ध्य देने के लिए प्रतिबिंबित डिटेक्टर के लिए तरंग दैर्ध्य । hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) क्रमिक रूप से विभिन्न इनपुट तरंग दैर्ध्य पर चिंतनशील छवियों को प्राप्त करने के लिए एक अनुकूलन वर्णक्रमीय स्कैन विकल्प प्रदान करता है. इसके अलावा, रंगीन विचलन गंभीर वर्णक्रमीय माप में हस्तक्षेप कर सकते हैं; इसलिए, एक apochromat उद्देश्य लेंस के उपयोग की सिफारिश की है ।
नोट के, सफेद प्रकाश पराबैंगनीकिरण एक असमान वर्णक्रमीय उत्पादन का उत्पादन और ऑप्टिकल घटक भी वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल को प्रभावित करते हैं । इसलिए, प्राप्त स्पेक्ट्रा अनुवर्ती मात्रात्मक विश्लेषण के लिए तुले होने की जरूरत है । एक संरक्षित चांदी दर्पण आम तौर पर एक संदर्भ है, जो एक लगभग निरंतर चिंतनशील प्रदान करता है के रूप में प्रयोग किया जाता है (> ९७%) पूर्ण दिखाई क्षेत्र पर । अधिग्रहीत स्पेक्ट्रा तो संदर्भ स्पेक्ट्रा द्वारा दर्पण से विभाजित हैं ।
वर्णक्रमीय स्कैन के लिए वर्णक्रमीय चरण आकार अधिग्रहण की गति को निर्धारित करता है; इस प्रकार, यह अनुकूलित करने की जरूरत है । एक बड़ा axon के रूप में एक उच्च वर्णक्रमीय अवधि है, यह महीन वर्णक्रमीय नमूना की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, 10 µm, सबसे बड़ा शारीरिक axons में से एक के एक व्यास के साथ एक axon, ~ 8 एनएम के एक वर्णक्रमीय अवधि है । Nyquist नमूना मानदंड लागू करके, हम 4 एनएम के वर्णक्रम नमूना अंतराल कार्यरत सभी शारीरिक axons माउस तंत्रिका ऊतकों में कवर करने के लिए । इस दृष्टिकोण आम तौर पर एक पूर्ण वर्णक्रमीय स्कैन के लिए कई सेकंड से अधिक लेता है और इस तरह vivo अनुप्रयोगों में के लिए उपयुक्त नहीं है, जहां शारीरिक गति (जैसे श्वसन और दिल की धड़कन) स्थिर वर्णक्रमीय अधिग्रहण हस्तक्षेप. हम पहले एक अनुकूलित ईमानदार खुर्दबीन, एक सरणी स्पेक्ट्रोमीटर (अधिग्रहण गति ≈ पिक्सेल प्रति 30 ms) का उपयोग कर एक बिंदु के लिए पूर्ण स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए डिजाइन साधन द्वारा इस मुद्दे को हल ।
इस रिपोर्ट में, हम एक निश्चित मस्तिष्क स्लाइस पर SpeRe इमेजिंग पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, जो एक वाणिज्यिक hyperspectral माइक्रोस्कोप में प्रदर्शन किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें). इस प्रकार, प्रोटोकॉल ऑप्टिकल इंस्ट्रूमेंटेशन में विशेषज्ञता के बिना प्रयोगकर्ता द्वारा पूरा किया जा सकता है । हम भी संभावित मुद्दों और अधिग्रहण और SpeRe डेटा के विश्लेषण के लिए समस्या निवारण को कवर किया ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apochromat objective 40&#215;, NA 1.1</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>15506357</td>
			<td>Water-immersion type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromyelin Green</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F34651</td>
			<td>Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 TCS microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Refer to the &#34;Configuration of microscope&#34; in Introduction Section for details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-X</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td>Coated with protected silver.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BP031a</td>
			<td>4% v/v in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3306</td>
			<td>Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Muto Pure Chemicals</td>
			<td>5116-20F</td>
			<td>Thickness: ~1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Brainetree Scientific</td>
			<td>BS-8000 DUAL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White-light laser</td>
			<td>NKT photonics</td>
			<td>EXB-6</td>
			<td>EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ

एक स्तनधारी तंत्रिका तंत्र में, myelin एक multilayered सर्पिल में axon फाइबर enwrapping द्वारा एक बिजली के इंसुलेशन प्रदान करता है । इसकी अत्यधिक संगठित सेलुलर वास्तुकला से प्रेरित होकर, हमने हाल ही में एक नई इमेजिंग रूपरेखा विकसित की, जिसका नाम वर्णक्रमीय reflectometry (SpeRe) है, जो सीटू मेंलाइव myelinated axons के अभूतपूर्व लेबल-मुक्त नेनो इमेजिंग को सक्षम बनाता है । अंतर्निहित सिद्धांत multilayered उपसेलुलर संरचना के चिंतनशील स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करके nanostructural जानकारी प्राप्त करने के लिए है । इस अनुच्छेद में, हम एक विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल तंत्रिका ऊतकों का एक बुनियादी SpeRe इमेजिंग प्रदर्शन एक वाणिज्यिक फोकल सूक्ष्म प्रणाली का उपयोग करने के लिए, एक सफेद प्रकाश लेजर और एक स्वरित्र फिल्टर के साथ सुसज्जित का वर्णन । हम नमूना तैयारी की प्रक्रियाओं को कवर, वर्णक्रमीय डेटा के अधिग्रहण, और nanostructural जानकारी प्राप्त करने के लिए छवि प्रसंस्करण.

प्रोटोकॉल के अनुसार, एक निश्चित मस्तिष्क टुकड़ा exogenous धुंधला, एक myelin लक्ष्यीकरण fluorophore ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ तैयार किया गया था । SpeRe इमेजिंग मस्तिष्क टुकड़ा पर फोकल प्रतिदीप्ति ?...

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Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

वर्णक्रमीय Reflectometric माइक्रोस्कोपी पर Myelinated Axons में सीटू

यहां, हम एक निश्चित मस्तिष्क टुकड़ा में इमेजिंग myelinated axons के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत एक लेबल मुक्त नेनो इमेजिंग वर्णक्रमीय reflectometry पर आधारित तकनीक का उपयोग कर ।

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

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