Name: analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

نود أن نشكر هوفنر كارل-بيتر وروبرت توماس بيرن يرجى توفير هيرا ونورا هيرا بروتين العينات ومساعدتهم مع التصميم التجريبي. كما نشكر الدكتور إيمون القراءة لاستعراضه المخطوطة. ونعترف مع الامتنان لدينا هيئات التمويل: مؤسسة ويلكوم ترست [109854/Z/15/Z] والجمعية الملكية [RG150216 إلى أ فب].

وأعلن لا تضارب في المصالح.

مرض التصلب العصبي المتعدد يلعب دوراً متزايد أهمية في وصف ستويتشيوميتري والتفاعلات وبنية وحدة فرعية من البروتين المجمعات. يمكن استخدام البيانات التراسل الفوري--مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد ترتيبات طوبولوجي من وحدات فرعية داخل مجمعات متعددة المكونات. مقارنة بالأساليب الأخرى الأحياء الهيكلية القائمة، مرض التصلب العصبي المتعدد له العديد من المزايا. الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد هو أسلوب السريع وحساسة للغاية، ويمكن استخدامها لسبر عينات البروتين غير متجانسة. عندما يقترن مع تجارب الاضطراب في الحل، يمكن رصد مسارات التفكك للبروتين التجميعات. جنبا إلى جنب مع هياكل الكريستال أو نماذج التماثل، المعلومات التي تتيحها الهيكلي MS يوفر أداة للتحقيق في تفاعلات البروتين-يجند وتقديم نماذج قرب أصلي و مسارات الجمعية11.
هنا، نحن تصف الإجراءات التجريبية اللازمة لتحليل ستويتشيوميتري وتكوين البروتين-يجند التفاعلات، مع يغاندس واحدة أو أكثر، باستخدام MS التكاملية. وهذا يشمل إعداد نموذج MS والحصول على البيانات، وتحليل البيانات وتكامل البيانات MS باستخدام أدوات حسابية. للقيام بذلك، استخدمنا البروتين الحمض النووي-بتر هيرا-نورا هترو oligomeric المعقدة، منضمة إلى ثلاثة يغاندس (الحمض النووي و ATP و ADP)، كنظامنا النموذجي. ويظهر البروتوكول استخدام البرمجيات المتاحة حاليا للمساعدة في تحليل البيانات وعرضها.
الحصول على الأطياف عالية الجودة مهم لتحليل ملزم يجند، ولذلك، خطوات إعداد عينة حذراً الحرجة، بما في ذلك تنقية البروتين ومعايرة يجند exchange المخزن المؤقت. واحد الحد نيسي MS الأصلي عند دراسة ملزم يجند ربط غير محددة. الملزمة الخاصة بعدم حدوث أثناء ديسولفيشن الحبرية طوال عملية اليكتروسبراي. وهذا يزيد تركيزات يجند وذلك يغير نسبة البروتين/يجند29. ويؤدي ربط النيوكليوتيدات فرق جماعية صغيرة نسبيا بين الاشتقاق والبروتين النوكليوتيدات زمنياً الذي لا يغير من50،الكفاءة التأين51.
استخدمنا النظام سينت G2-سي "مرض التصلب العصبي المتعدد" لعملنا، ولكن البروتوكولات قابلة للتطبيق لمختلف التحقيقات الأخرى مجمعات البروتين-يجند استخدام مطيافات الشامل الأخرى المتاحة تجارياً نانو-اليكتروسبراي. التكامل الهيكلي MS متزايدة يلعب دوراً هاما في معالجة المشاكل البيولوجية لدرجة أكبر من التعقيد. سير العمل والأساليب الموصوفة هنا مناسبة تماما لفهم آثار هيكلية وبناء آليات البروتينات المعقدة وتشكيل البروتين-يجند التي يصعب إلا بدراسة استخدام تقنيات الهيكلية التقليدية .

أصلي والمطيافيه الجماعية من البروتينات سليمة وبها مجمعات يجري تحليل استخدام اليكتروسبراي والتاين نانو-اليكتروسبراي (نيسي)، التي تحافظ على طي البروتين والتفاعلات غير التساهمية خلال عملية التأين1، 2. في MS الأصلي، يتم الاحتفاظ ببنية البروتينات وهذه المجمعات في حالة قرب أصلي في3،الغاز-المرحلة4. الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد بالكشف عن أيونات مشحونة بالبروتين متعددة، يتم فصله بحسب كتلتها تهمة نسبة (m/z) يسمح لكتلة البروتين أو البروتين-يجند معقدة حسابها. هذه المعلومات يمكن تحديد ستويتشيوميتري البروتين سليمة وتشكيل وحدة فرعية وملزم يجند والتفاعل شبكات3،4،،من56. MS الأصلي مزايا عديدة مقارنة بتقنيات أخرى مثل هذه البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي الطيفي5. أولاً، الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد تقنية سريعة وحساسة للغاية، تتطلب سوى بضعة ميكروليتيرس (2-3 ميليلتر) من عينة تركيزات المعقدة النهائية منخفضة نسبيا في نانومتر عالية ميكرومتر منخفض النطاق6. ثانيا، يمكن استخدام MS الأصلي استجواب عينات البروتينات غير المتجانسة مما يجعل من الممكن لتحليل البروتينات والدول أوليجوميريك متعددة في وقت واحد. وثالثاً، لا تتطلب الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد عينات البروتين تعديل قبل التحليل بواسطة crosslinking الكيميائية أو وضع العلامات البروتين. جعلت هذه المزايا الهيكلية مرض التصلب العصبي المتعدد أداة قوية للتحقيق الهيكلية في مجمعات البروتين.
يمكن أن يقترن الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد أيون التنقل (IM)، أسلوب الذي يقيس الوقت تحيط أيون بروتين السفر عبر مجال الكهربائي، تمكين المقطع العرضي الاصطدامية (قانون الأحوال المدنية) على أن يحدد. ويوفر احتجاز ثاني أكسيد الكربون منخفضة الدقة من المعلومات الهيكلية، التي تمكن الطوبولوجيا والمعلومات conformational التباين البروتينات الحصول على. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح فحص البروتين النماذج الهيكلية التي تم إنشاؤها بواسطة النهج الحسابية.
البروتين الغاز-مرحلة الاستقرار يمكن أن يحقق استخدام الاصطدام المتعمد التي تتكشف (سو) تقاس إيم--مرض التصلب العصبي المتعدد. أثناء عملية سيو، تسارع أيونات البروتين وتفعيلها من خلال اصطدام تسارع زيادة مع غاز خامل المخزن مؤقت داخل مطياف كتلة7،،من89. يؤدي هذا عملية التنشيط الاصطدامية البروتين تتكشف جزئيا، الذي يترجم إلى زيادة في احتجاز ثاني أكسيد الكربون. يمكن أن يكون هذا التغيير في احتجاز ثاني أكسيد الكربون والطاقة اللازمة تتكشف البروتين يقاس هذا النهج "استخدام" الدردشة-السيدة، أثر ملزم يجند في الاستقرار البروتين يمكن أن يقاس10. يمكن أن تتولد سوبكومبليكسيس في الحل باستخدام أساليب الاضطراب في حل مثل إضافة المذيبات العضوية لرصد أصلي مثل طبولوجيا من البروتين المجمعات. تعطيل لمجمعات البروتين أساسا بسبب تعطل التفاعلات البينية غير التساهمي. والحفاظ على طبولوجيا أصلي مثل المجمعات الفرعية، عند الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، تكشف عن معلومات حول الاتصال بين وحدة فرعية.
النهج التكاملي في علم الأحياء الهيكلية الجمع بين الأساليب المتنوعة لدراسة بنية وديناميات البروتينات وبها مجمعات3،4،،من56. الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد--إيم قد استخدمت للكشف عن تفاصيل تحدي النظم البيولوجية الجزيئية. وكانت هناك عدة أمثلة للتطبيقات بما في ذلك دراسة البروتين الجمعية مسارات11،12،13،14، دراسة شبكات التفاعل البروتين-بروتين15 , 16 , 17والغشاء البروتينات6،،من1819،،من2021، وتفاعلات البروتين-يجند مثل الأحماض النووية22،23 ،24.
ومع ذلك، قد الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد أيضا حدودها. غالباً ما تتم الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد القياسات في مخازن متقلبة مثل خلات الأمونيوم المائية التي لن تحتفظ بعض البروتينات على3،الدولة الأصلية مطوية25. ومع ذلك فقد أظهرت الأعمال الأخيرة أنه يمكن التغلب على هذا التحديد الأمثل للرش إبرة نصيحة قطرها (النصائح 0.5 مم) مثل أن البروتين والبروتين أيونات معقدة يمكن أن تتكون مباشرة من المخازن المؤقتة غير متغير مع عالية القوة الأيونية على أفضل تحاكي البيئة الفسيولوجية26. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم MS الأصلي اليكتروسبراي تتأين ونقل التجميعات غير التساهمية من الحل إلى الطور الغازي؛ ولذلك، الوفرة النسبية لمجمعات المكتشفة قد لا كلياً يمثل أن في حل5،27. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الحل، التفاعلات مسعور المرحلة الغاز تصبح أضعف والتفاعلات الالكتروستاتيكي تصبح أقوى ومن ثم يفضل3،28.
في هذه المقالة، نحن نقدم البروتوكولات وتحليل البيانات وتفسيرها لتحديد البروتين ويجند ملزم باستخدام الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد، مرض التصلب العصبي المتعدد--إيم، سو، اختلال في الحل، ووضع النماذج. ويستخدم المجمع إصلاح الحمض النووي، هيرا-نورا، كنظام نموذجي. الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل فواصل (دسبس) أحد النماذج الأكثر السامة للخلايا وضارة من ضرر الحمض النووي، مما يؤدي إلى عدم الاستقرار الوراثي وتطور السرطان في البشر في نهاية المطاف. جزئ مثلى هو إصلاح الآلية التي تستأصل دسبس، عملية التي هي مدبرة من قبل هيرا-نورا المعقدة، ATP يعتمد هيليكاز-نوكلاس22.
يسمح الجمع بين الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد--إيم الاختبارات الوظيفية ونمذجة التحقيق: ط) دور نورا في الجمعية، والمطابقة، والاستقرار في المجمع، والثاني) التفاعل بين دسدنا والمعقدة وتأثيره على مجمل استقرار المجمع، والثالث) ستويتشيوميتري وأثر ملزم ATP في الجمعية22. عموما، هذا العمل أدى إلى تحسين فهم الأساس الجزيئي لمجمع هيرا-نورا بربط التغييرات البروتين conformational المعقدة والاستقرار مع النوكليوتيدات ملزمة. هذا البروتوكول عام لأي complex(es) البروتين الذي يتفاعل مع واحد أو العديد من أنواع ligand(s).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">119120-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">20398-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ammonium acetate solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td style="width:71px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">7326204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vivaspin concentrator</td>
			<td style="width:71px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">Z614041-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Water TraceSelect</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">300060</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry

البروتينات هي فئة هامة من الجزيئات البيولوجية التي تلعب أدواراً رئيسية كثيرة في الوظائف الخلوية بما في ذلك التعبير الجيني، تحفيز التفاعلات الأيضية وإصلاح الحمض النووي والنسخ المتماثل. ولذلك، فهم مفصل لهذه العمليات يوفر معلومات هامة حول كيفية الخلايا الدالة. أساليب MS هيكلية تكاملية توفر المعلومات الهيكلية والديناميكية في الجمعية البروتين المعقدة والربط المعقدة، stoichiometry وحدة فرعية، أوليجوميريزيشن البروتين وملزم يجند. وأتاحت التطورات الحديثة في التكامل الهيكلي MS توصيف النظم البيولوجية الصعبة بما في ذلك كبير الحمض النووي ملزم البروتينات وبروتينات الغشاء. ويصف هذا البروتوكول كيفية دمج البيانات MS متنوعة مثل الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد وأيون التنقل-قياس الطيف الكتلي (إيم-MS) مع ديناميات الجزيئية المحاكاة اكتساب نظرة ثاقبة الحمض النووي هيليكاز-نوكلاس إصلاح البروتين المعقدة. النهج الناتجة عن ذلك الذي يوفر إطارا لدراسات تفصيلية ليجند ملزمة للمجمعات البروتين الأخرى المشاركة في العمليات البيولوجية الهامة.

وكشفت نتائج MS الأصلي أوليجوميريك الدولة وتكوين طبولوجيا مجمع هيرا-نورا (الشكل 1). كما يتم الحفاظ على التفاعلات غير التساهمي في الطور الغازي، الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد ATP-γ-S وتجارب المعايرة ADP تحديد الربط النوكليوتيدات العشوائية إلى هيرا-نورا (الشكل 2)، وأن زيادة تركيز ATP-γ-S الزيادات النسبية كثافة هيكساميريك هيرا (الشكل 3). المعلومات الهيكلية فيما يتعلق التفاعلات بين وحدة فرعية تم الحصول عليها من اضطراب بالحل تليها الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد، وتم الاتفاق مع والجماهير النظرية (الشكل 4 والجدول 1).
القيم احتجاز ثاني أكسيد الكربون التجريبي من البروتينات وعلى مجمعات مستمدة من تجارب إيم--مرض التصلب العصبي المتعدد (الشكل 5). هذه القيم هي المرحلة الغازية التناوب متوسط حسابات مستعرضة الشكل الجزيئي، وتصف حالة الأبعاد للبروتين. قيم احتجاز ثاني أكسيد الكربون مقارنة بالقياسات النظرية من علم البلورات بالأشعة السينية، وتستدل على اتفاق جيد على الاحتفاظ بالشكل الأصلي في المرحلة الغازية (الجدول 1). وهذا التحقق من صحة استخدام قيم احتجاز ثاني أكسيد الكربون لبناء نماذج ذات الدقة المنخفضة ل البروتين الجمعية48.
ويمكن حساب CCSs التجريبية لكل أيون الدولة المسؤول. قد تثير الامتثال بروتين الأصلي مثل تكليف أيونات الدولة بقيم مماثلة في احتجاز ثاني أكسيد الكربون. غير أن زيادة أيونات الدولة رسوم أعلى ريبولسيونس كولومبيك مما قد يؤدي إلى البروتين المرحلة الغازية التي تتكشف وأكبر احتجاز ثاني أكسيد الكربون القيم CCSs النظرية بالمقارنة. استخدام قيمة تخزينه للدولة مقابل أدنى الأيونات يتم ذلك عادة49. هيرا-نورا، دفعت تجارب الاضطراب في الحل في هيرا ونورا هيرا مع أو بدون الحمض النووي توليد طريقا الجمعية بدءاً من مونومرات ثم تشكيل hexameric كامل هيرا (هيرا6)-ديميريك نورا (نورا2) مجمع مع الحمض النووي (الشكل 6).
تحديد الاختلافات في المؤامرات التي تتكشف سو بين الاشتقاق (خالية من يجند) ويجند ملزمة التغيير في الاستقرار المعقدة عند ملزم يجند. أعلى السيرة الذاتية50 أو قيمة كهكوم يعني أيون أكثر استقرار في الطور الغازي. وكشف تحليلكوم سو وكه ربط الحمض النووي هيرا-نورا أكثر استقرارا من المجمع خالية من الحمض النووي (الشكل 7أخي). من تحليل سو--مرض التصلب العصبي المتعدد في الدول المعنية ملزمة ATP، استقرار الدولة المنضمة أربعة-ATP-γ-S انخفاض الاستقرار المعقدة في الطور الغازي والدولة ملزمة-ATP-γ-S ستة فيها جميع المواقع تشغل أكثر (الشكل 7Bii). يمكن أن تكشف الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد النوكليوتيدات منفصلة الملزمة للدول من هيرا؛ ومع ذلك، لا يمكن التمييز بين مفارز هيرا التي هي ملزمة ATP والتي يحدث فيها هذا الربط. يمكن أن تستمد هذه المعلومات الصريحة المحاكاة MD المذيبات هيكساميريك هيرا وهيرا-نورا بعد سير العمل الموجز (الشكل 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> الشكل 1. استجواب oligomeric الدولة وتكوين طبولوجيا المجمع غير التساهمية هيرا-نورا. (أ) كتلة الأطياف هيرا، هيرا-نورا ونورا هيرا حضور الحمض الخلوي الصبغي (DNA مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل bp كاتشين 15.4 25). مجمع هيرا الفرعي موجود هيكسامير وهيبتامير. يربط ديمر نورا وإلى هيكسامير هيرا فرض التحويل أوليجوميريك. الحمض النووي يربط المجمع هيرا-نورا شكلت (النتائج مقتبس من أهداش Z. et al.، 201722). (ب) تحسب كثافة النسبية للأنواع التي تم تحديدها باستخدام أونيديك32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> الرقم 2. ESI-MS الأصلي يكشف إليه النوكليوتيدات ملزمة لنورا هيرا. الشامل الأطياف (A) هيرا-نورا و (ب) هيرا-نورا-الحمض النووي مع زيادة تركيزات (ط) ATP-γ-S و (ثانيا) ADP. الجماهير يقاس مقارنة بالجماهير النظرية وكمية ATP-γ-S أو مصممون ADP ملزمة. ترد الجماهير المقاسة وعدد النيوكليوتيدات المنضم على الأطياف. تحدد تجارب المعايرة ATP-γ-S وشرطة الربط النوكليوتيدات العشوائية هيرا-نورا وحدها، وعندما تكون في مجمع مع الحمض النووي تشير إلى إليه رد فعل دورية (النتائج مقتبس من أهداش Z. et al.، 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> الشكل 3. قياس أثر زيادة تركيزات ATP-γ-S في هيرا أوليجوميريك الدولة. (أ) كتلة أطياف هيرا في زيادة تركيزات ATP-γ-س. (ب) الرسم البياني عرض الشدة النسبية للأنواع المختلفة من MS الأصلي محسوبة باستخدام البرمجيات deconvolution أونيديك32. كما يزيد من تركيز ATP-γ-S، كما يزيد كثافة نسبية hexameric هيرا. يبين عدد جزيئات ATP-γ-S ملزمة على الأطياف (النتائج مقتبس من أهداش Z. et al.، 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> الشكل 4. الجماعي الأطياف ومنتجات التفكك شبه معقدة من هيرا (أ) و (ب) هيرا-نورا (ط) وحدها وحضور التالية (ثانيا) الحمض النووي من الاضطراب بالحل. أجريت تجارب الاضطراب في الحل باستخدام 10-40% من الاسيتو الانيتريل، والميثانول (ميوه) أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وأسفرت عن تشكيل سوبكومبليكسيس مختلفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> الشكل 5. أيون التنقل توزيعات وقت وصول على محور لاحتجاز ثاني أكسيد الكربون للمجمعات والمجمعات الفرعية التي تم إنشاؤها. رمز لكل ربط شبه معقدة مع أولئك المشروح في الأطياف في الشكل 4. ترد في الجدول 1 التي أظهرت اتفاقا بين القيم التجريبية والمحسوبة (بعد النظر في عدم اليقين نموذجية في قرار السفر أيون موجه الجماهير التجريبية والمحسوبة والقيم احتجاز ثاني أكسيد الكربون من المجمعات الفرعية التنقل الكتلي لدقة ± 5-8%37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> الشكل 6. مسار الجمعية مجمع هيرا-نورا المتولدة من الاضطراب بالحل الأصلية مرض التصلب العصبي المتعدد والدردشة-السيدة الملونة الدوائر تشير إلى الشروط التي لوحظ فيها كل مجمع الفرعية: أصلي (الأخضر، قبل انقطاع)، والميثانول (أصفر)، [دمس] (أرجواني) أو الاسيتو الانيتريل (أحمر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> الشكل 7. وتحقق الاستقرار أثر الحمض النووي (أ) على هيرا-نورا وملزمة (ب (ATP هيرا-نورا-الحمض النووي. (ط) مؤامرات المرحلة الغازية سو--مرض التصلب العصبي المتعدد والاصطدام (ثانيا) مركز للإعلام حساب الطاقات (كيكوم) تبين أن أن وجود دسدنا تستقر مجمع هيرا-نورا وأن ستة ATP-γ-S ملزمة الدولة هو الأكثر استقرارا. ويبين تحقيق الاستقرار للدول رسوم مختلفة. قطع تم إنشاؤها باستخدام نباض 33. النتائج من (أ) مقتبس من أهداش Z. et al.، 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> الرقم 8. سير العمل لنمذجة إجراءات التفاضلية الجزيئية ديناميات المحاكاة. (أ) توليد المجمع قيد التحقيق ببناء الطبولوجيا من القائمة الوحدات الفرعية وإعادة المخلفات مفقود. (ب) سير العمل لتشغيل محاكاة ديناميات الجزيئية على البروتين معقدة مع أو بدون [ليغند]. ركض ديناميات الجزيئية محاكاة للبروتين الذي يعمل كمرجع فقط والذي مطروح من محاكاة للبروتين بالإضافة إلى [ليغند]. وهذا تبعتها حساب تقلبات التفاضلية جذر متوسط مربع (رمسف) بين عمليات المحاكاة وتحديد أثر ملزم يجند. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>مجمع/شبه معقدة</td>
			<td>النظرية الجماهيرية (كاتشين)</td>
			<td>كتلة التجريبية (كاتشين)</td>
			<td>النظرية احتجاز ثاني أكسيد الكربون (Å2)</td>
			<td>التجريبية احتجاز ثاني أكسيد الكربون (Å2) [رسوم]</td>
			<td>شرط حماد</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا6-نورا2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20% تزاول، [دمس] 10-40 ٪، 10 ٪ ميوه</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا6-نورا2-دسدنا</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>تزاول 10 ٪، 10 ٪ ميوه</td>
		</tr>
<tr>
<td>نورا1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% تزاول، ميوه 10%، 20-40 ٪ [دمس]</td>
		</tr>
<tr>
<td>نورا2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40% ميوه، 20-40 ٪ [دمس]</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>10-40% تزاول، 40% [دمس]</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40% المنهجيات، تزاول 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% ميوه، يمكن 10-40%، 40% [دمس]</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا3 + الحمض النووي</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30% تزاول</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40% ميوه، تزاول 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا4 + الحمض النووي</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30% تزاول</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40% تزاول</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% ميوه، تزاول 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا6 + الحمض النووي</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>تزاول 30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% ميوه، تزاول 10-40 ٪، 10-40% [دمس]</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيرا7 + الحمض النووي</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>تزاول 10%</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1- الجماهير التجريبية والمحسوبة والقيم تخزينه هيرا-نورا وفي المجمعات الفرعية التي تم إنشاؤها دراسات الاضطراب في حل النموذج.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

تحليل البروتين أبنية ومجمعات البروتين-يجند بالتكامل الهيكلي الكتلي

الطيف الكتلي (MS) برز كأداة هامة للتحقيق في بنية وديناميات الجزيئات التجميعات. هنا، نحن إدماج النهج المستندة إلى MS استجواب تشكيل البروتين المعقدة وملزم يجند.

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

في الوقت الحاضر ، يلعب قياس الطيف الكتلي دورًا مهمًا في علم الأحياء الهيكلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الجزيئات الحيوية الحيوية الهامة في حالتها الأصلية ، وخاصة البروتينات ومجمعات البروتين. قياس الطيف الكتلي الأصلي ينطبق على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من الجمعيات الجزيئية الحيوية بما في ذلك أنظمة متعددة المواد وحمض النوى.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وحساسة للغاية. ويمكن استخدامه لاستجواب عينات البروتين غير المتجانسة، وجعل من الممكن لتحليل البروتينات متعددة في الدولة القلة في وقت واحد. إثبات الإجراء سيكون (أندي لاو) طالب دكتوراه في مجموعتيلبدء هذا الإجراء، إعداد الشعيرات الدموية في المنزل ل nanoelectrospray كما هو موضح في بروتوكول النص. إعداد عينة خالية من ليجند كتحكم لكل تشغيل كتبادل المخزن المؤقت كل في خلات الأمونيوم. بعد ذلك، حدد الحساسية، اقتناء الأيونات الإيجابية، وسائط TOF للتنقل.بدوره التالي على فخ ، و API ، وغازات IMS. لفصل الدردشة استخدام النيتروجين وargon نقطة البداية هو مبين هنا وضبط حسب الضرورة. تعيين نطاق اقتناء م / ض مناسبة.بالنسبة لبروتين غير معروف يجب أن تستخدم خطوات التحسين الأولية نطاقًا واسعًا. أدخل الشعيرات الدموية المغلفة بالذهب في حامل شعري. ثم تحميل بين اثنين وثلاثة ميكرولترات من محلول البروتين المعقدة من الفائدة في الشعرية.شد بلطف الشعرية ووضعها على مرحلة مصدر رذاذ كهربائي. قم بزلاق المرحلة إلى موضع لبدء الحصول على البيانات. تطبيق ضغط الغاز تدفق نانو منخفضة حتى شكل قطرة في غيض من شعري.نقل الشعرية فيما يتعلق مخروط ورصد التيار أيون لتحقيق تيار أيون مستقرة. تطبيق الجهد الشعري في نطاق يتراوح بين 0.9 و 1.6 كيلوفولت. ثم تعيين مخروط أخذ العينات، إزاحة المصدر، درجة حرارة المصدر، وتدفق الغاز المخروطي كما هو مبين في بروتوكول النص.للحصول على طيف كتلة محسومة وانتقال أيونات مُعظم، قم بضبط معلمات التصلب المتعدد وراقب التغير الناتج في الأطياف. تعيين الطاقة الاصطدام فخ إلى نقطة انطلاق أولية بين 10 و 50 فولت. إذا كانت إزاحات الجهد غير كافية، ضبط الطاقات الاصطدام فخ.تعيين فخ عن طريق الجهد إلى نقطة انطلاق أولية بين 20 و 45 فولت. تحسين desolvation عن طريق تحسين هذا الجهد. بعد ذلك، تحسين سرعة الموجة وارتفاع الموجة كما هو موضح في النص لتحقيق أفضل فصل التنقل.في الدراسات التي تنطوي على HerA و NurA استخدام سرعة الموجة من 40 مترا في الثانية وارتفاع الموج بين 550 و 650 فولت. لتحليل ربط الحمض النووي، اخلط البروتين والحمض النووي بنسبة حورية تسمح بتكوين معقد للحمض النووي البروتيني. إضافة كميات متزايدة من أي من التالية، 5'O-3-thio-ثلاثي الفوسفات، ملح رباعي اليثيوم، أو ADP.باستخدام البرمجيات المناسبة قياس الجماهير من الأنواع المولدة وتحديد ملزمة ليغاند، مثل ATP و ADP ملزمة والدول القلة. ثم استخدام كثافة الأيونات التي لوحظت في أطياف MS ESI الخام لتحديد كمية الوفرة النسبية المقابلة للأنواع. بعد تحسين ظروف الأداة لنقل مستقر، والحد من الطاقة الاصطدامية ومخروط أخذ العينات منخفضة قدر الإمكان، مع الاحتفاظ بجودة الأطياف الجيدة.استخدم السرعة المحسنة للموجة التي تم تحديدها مسبقًا وارتفاع الموجة للحصول على IM MS. قياس الوقت الانجراف الأيون في ثلاث سرعات موجة مختلفة مع الحفاظ على ارتفاع الموجة نفسها. لتحديد البروتين أيون CCS قياس أربعة كاليبرانت البروتين, اثنين مع كتلة فوق البروتين قيد التحقيق واثنين مع كتلة أدناه, باستخدام نفس الشروط الأجهزة. أولاً، إعداد عينات البروتين والتخزين المؤقت تبادلها في خلات الأمونيوم كما هو مبين في بروتوكول النص.إضافة المذيبات في 10٪ زيادات حتى الوصول إلى المبلغ المطلوب. احتضان على الجليد لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، الحصول على طيف IM MS لكل عينة.باستخدام برنامج SUMMIT ، تعيين المكونات الفرعية للبروتين وتوليد شبكات التفاعل البروتين. بدلا من ذلك، توليد يدويا قائمة من الجماهير النظرية للأنواع المتوقعة. للبدء في التحقيق في الاستقرار البروتين المعقد، سجل بيانات IM-MS مع زيادة الجهد تسارع فخ من 10 فولت إلى 200 فولت، والتي سوف تتكشف تدريجيا إلى مرحلة البروتين والغاز.تحليل البيانات باستخدام البرامج المناسبة وتوليد المؤامرات تتكشف ثنائية الأبعاد عن طريق التراص توزيعات CCS تطبيع كثافة في كل الجهد المتسارع لكل دولة تهمة. تكشف نتائج مرض التصلب العصبي المتعدد الأصلي عن حالة القلة وتكوينها وطبولوجيا مجمع HerA و NurA. كما يتم الحفاظ على التفاعلات غير التكافؤ في مرحلة الغاز، MS الأصلي من ATP غاما S و ADP التجارب المعايرة، وتستخدم لتحديد ربط النيوكليوتيدات زوج الحكيمة في HerA و NurA.تكشف الأطياف الكتلية لدول هيرا أوليجومير أن زيادة تركيزات أُكات جاما S تزيد من الكثافة النسبية للهيرا سداسية. ثم تستمد القيم التجريبية CCS للبروتينات ومجمعاتها من تجارب IM-MS. وينظر إلى هذه القيم على أنها تتفق بشكل جيد مع القياسات النظرية من التصوير البلوري بالأشعة السينية، والتي تؤكد صحة استخدام قيم احتجاز ثاني أكسيد الكربون وتخزينه لبناء نماذج منخفضة الدقة لتجميع البروتين.تحليل CIU وKEcom يكشف عن أن الحمض النووي ملزمة HerA-NurA هو أكثر استقرارا من مجمع خالية من الحمض النووي. تحليل CIU MS و حالات ربط ATP المعنية يظهر أن أربعة ATP جاما S دولة ملزمة يقلل الاستقرار المعقدة في مرحلة الغاز. ومع ذلك، فإن الستة ATP غاما S دولة ملزمة التي يتم فيها شغل جميع المواقع، وينظر إلى أن تكون الأكثر استقرارا.توفر القياسات الدقيقة للكتلة الجزيئية لمجمع سليم رؤية قيمة في توصيف الجزيئات الحيوية. يمكننا الحصول على معلومات عن مسارات التجميع المعقدة ، oligomerization البروتين ، وملزمة ليغاند. الجمع بين كل هذه المعلومات يسمح لتوليد نماذج مفصلة من الجمعيات البيولوجية الوظيفية.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Chemistry

Biology

Molecular Biology

Unit 1

Fundamentals

Protein Function

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

تحسن في جل β-القضاء الشامل للO-ربط وسلفو-glycomics الاختزالية التي كتبها الطيف الكتلي

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

دراسة في Complexation من الزئبق (II) مع Dicysteinyl Tetrapeptides التي كتبها Electrospray التأين الطيف الكتلي

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

مقايسة HS-الآلية للتحديد الكمي لبروتينات الخلية المضيفة في صيدلية البروتين اللوني السائل أيون التنقل قطوف الطيف الكتلي

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

تحليل التنفس في الوقت الحقيقي باستخدام التأين نانوليكتروسبراي الثانوية بالإضافة إلى دقة عالية الطيف الكتلي

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

توليف وتحليل الطيف الكتلي اليغو-بيبتويدس

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

وضع العلامات التساهمية مع ديثيلبيروبونات لدراسة بنية البروتين الأعلى ترتيبا حسب قياس الطيف الكتلي

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...