Name: analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Vi vil gerne takke Karl-Peter Hopfner og Robert Thomas Byrne venligst give HerA og HerA-NurA protein prøver og for deres hjælp med forsøgets udformning. Vi takker også Dr. Eamonn Reading for hans gennemgang af håndskriftet. Vi parlamentsarbejdet vores finansieringsorganer: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] og Royal Society [RG150216 til A.P.].

1. prøveforberedelse til Native MS af proteiner og Protein-Ligand komplekser
Bemærk: For at få en forståelse af det molekylære grundlag af et protein kompleks og ligand bindende ved hjælp af indfødte MS, egnet stikprøve forberedelse er nøglen. Formålet med dette afsnit er at fremhæve de afgørende prøve forberedelsestrin før MS analyse ved hjælp af HerA-NurA komplekset, som binder DNA og nukleotider som eksempel.
<ol><li>Forberede 20 µL delprøver af koncentreret oprenset protein (typisk 15-30 µM) i 1,5 mL rør.</li>
	<li>
Til ATP eller ADP bindende analyse Bemærk: Tilføje stigende koncentrationer af de ikke-hydrolyserbar ATP analog adenosin 5 '-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium salt (ATP-γ-S) eller adenosin 5 '-ud (ADP). Non-hydrolyserbar ATP derivater generere en stabil komplekse, hvilket ville gøre ATP-bundet protein til at blive fanget. Andre ikke-hydrolyserbar ATP analoger, der kunne blive testet omfatte AMP-PNP og ATP-γ-S-Mg2 +.<ol>
<li>For HerA-NurA undersøgelser, mix 5 µM oprenset protein med ATP-γ-S og ADP i koncentrationer fra 0-1 mM.</li>
		<li>For at fange simultan ATP-γ-S og ADP bindende, skal du tilføje begge nukleotider i de samme eller varierende koncentrationer.</li>
		<li>Tilføj 2 mM MgCl2 og inkuberes ved 25 ° C i en tør bad inkubator for 1 h. Bemærk: Analyse af nukleotid bindende ved hjælp af Daniels indfødte MS kan resultere i artefactual bindende i høje koncentrationer, derfor ikke-specifik binding skal tages i betragtning29. For at undersøge ikke-specifik binding, tilføje en højere koncentration af nukleotider mellem 2-5 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
For DNA bindende analyse
	<ol>
<li>Bland proteiner og DNA på en kindtand ratio, der giver mulighed for protein-DNA kompleks dannelse. HerA og HerA-NurA, mix 5 µM oprenset protein med DNA i forholdet 1:1.</li>
		<li>Inkuber HerA-NurA eller HerA - DNA blanding i 30 min. ved 25 ° C i en tør bad inkubator indtil den når ligevægt. Varighed og temperaturen inkubation kan variere afhængigt af protein under undersøgelsen.</li>
		<li>Buffer exchange protein prøver at MS kompatibel buffere. Almindeligt, vandig ammonium acetat løsning mellem 5 mM-1 M ved pH 7-8 er anvendt. Andre MS kompatibel buffere omfatter ethylenediammonium diacetat (EDDA) og Triethylammonium acetat (TEAA)30. HerA-NurA undersøgelser, bruge 200 mM ammonium acetat pH 7. Bemærk: Der er flere metoder til buffer exchange inden analyse af MS som ved hjælp af en spin koncentrator eller kromatografi kolonner. Native MS er for det meste begrænset af kvaliteten af eksemplet som buffere og adukter anvendes under rensningen. Derfor er det vigtigt at udføre tilstrækkelig afsaltning for at få løst toppe.</li>
		<li>For HerA-NurA ligand bindende undersøgelser, buffer exchange prøver 6 - 8 gange i 200 mM ammoniumacetat ved hjælp af en koncentrator. Selvom denne metode er mere tidskrævende, det sikrer at løst toppe er opnået og giver mulighed for masse på nøjagtig bestemmelse af ATP/ADP bundne arter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. indfødt MS erhvervelse og analyse for at undersøge proteinkomplekser og Protein-Ligand komplekser
Bemærk: MS betingelser skal optimeres for at opnå meget løst toppe for at aktivere nøjagtige masse målinger. Dette afsnit beskriver optimeret parametre på en Q-ToF massespektrometer med en 32 k øvre grænse m/z Quadrupol.
<ol><li>Forberede nano-electrospray in-house kapillærer og udføre instrument masse kalibrering for nøjagtige masse målinger som beskrevet af Kirshenbaum et al. 1.</li>
	<li>Vælg følsomhed, positiv ion erhvervelse og mobilitet TOF tilstande.</li>
	<li>Tænd de fælde, API og IMS gasser. IM adskillelse, bruge kvælstof (60 mL/min) og argon (8.4 mL/min. for regionen fælde) som udgangspunkter og derefter justere.</li>
	<li>Sæt en passende m/z erhvervelse rækkevidde. For en ukendt protein, indledende optimering trin skal bruge en bred vifte såsom 500-32,000 m/z.</li>
	<li>Læg 2-3 µL af protein kompleks løsning analyseres i en guld belagt kapillær og indsætte det i en kapillær indehaveren.</li>
	<li>Forsigtigt stramme kapillar og placere kapillar i electrospray source scenen og skubbe fase i position til at starte erhverve data.</li>
	<li>Anvende lav nano-flow gastryk (0,00-0,05 Bar) indtil en dråbe er dannet på spidsen af kapillar. Nano-flow tryk faldt kan derefter, indtil spray bevares.</li>
	<li>Justere kapillær med hensyn til kegle ved at flytte kapillar x, y, z positioner og overvåge den aktuelle at opnå en stabil ion aktuelle ion. Anvende en kapillær spænding i rækken af 0,9-1,6 kV.</li>
	<li>Indstille prøveudtagning kegle (50-120 V), kilde offset (60,0), kilde temperatur (25 ° C) og kegle gasflow (0.0 L/h). Disse foreslog oprindelige betingelser kan justeres.</li>
	<li>Erhverve godt løst massespektrum og maksimere ion transmission, justere MS parametre og overvåge den deraf følgende ændring i spektre. Disse omfatter justere luftstrømmen i Trap (2-8 mL/min), han celle (180 mL/min) og IMS celle (90 mL/min.) at opnå bedste adskillelse på maksimal transmission.</li>
	<li>Justere fælde kollisionen energi, hvis spænding kompensationer er utilstrækkelige. Et optimalt udgangspunkt er mellem 10-50 V. Bemærk: Øge fælde energi kan fjerne ikke-kovalent bundet adukter. Dog passe på at undgå kollision induceret dissociation og udfoldelsen af protein-ligand-komplekset. Udføre ion mobilitet målinger for at kontrollere, hvis instrumentet betingelser beholde protein i den foldede hjemstat (trin 3).</li>
	<li>Forbedre desolvation ved at optimere den fælde bias spænding. Et optimalt udgangspunkt er 20-45 V.</li>
	<li>Optimere bølge hastighed og bølgehøjde at opnå bedste mobilitet adskillelse. En detaljeret forklaring og protokollen kan blive fundet her31. For undersøgelserne, HerA-NurA, bruge bølge velocity 40 (m/s) og bølgehøjde 550-650 (V).</li>
	<li>Bruge alle andre parametre som instrument standardværdier.</li>
	<li>Forberede en ligand-gratis prøve til analyse som en kontrol for hver kørsel (figur 1). Ligand bindende eksperimenter, udføre mindst tre uafhængige målinger.</li>
	<li>Brug programmet Masslynx til at måle masser af genererede arter og identificere ligand bindende, såsom ATP og ADP bindende og oligomere stater (figur 2 og 3). Andre software til rådighed omfatter UniDec32, PULSAR33 og Amphitrite34.</li>
	<li>For at kvantificere den relative forekomst af arter, brug de tilsvarende ionintensiteter observeret i de rå ESI-MS spektre (for eksempel ligand bundet, forskellige oligomerer, osv.). Alternativt kan du udføre kvantificering ved hjælp af specialiseret software som UniDec og Massign35 (figur 1 og 3 ).</li>
</ol>3. erhverve og analysere IM-MS
Bemærk: IM-MS adskiller ioner i gasfasen baseret på deres størrelse (masse), form og ladning. Hver funktion løst i m/z spektrum er forbundet med en drift tid distribution. IM-MS måler den drift-en ion, som kan bruges til at beregne kollision tværsnit (CCS). Drift Tidsværdier målt fra IM-MS data opnået ved hjælp af en drift-rør kan være lineært korreleret til CCS værdier36. For rejser bølge IM-MS (TWIMS) måling, kræver beregning af CCS værdier en kalibreringskurve, fremstillet af protein standarder med kendte CCS værdier37. Kompakt strukturer rejse hurtigere end udvidede eller forlængede strukturer grund reduceret interaktioner med buffer gas i mobilitet celle38. IM-MS kan derfor bruges til at registrere, hvis de indfødte foldede struktur er blevet bevaret i gas fase39,40. Dette afsnit beskriver, hvordan du måler IM-MS og beregne CCS af protein ved hjælp af TWIMS.
<ol><li>Efter optimering instrument betingelser for stabil transmission (trin 2), reducere collisional energi og prøveudtagning kegle så lav som mulig, samtidig bevare gode spectra kvalitet.</li>
	<li>Bruge optimerede bølge hastighed og bølgehøjde for at erhverve IM-MS (trin 2).</li>
	<li>Måle ion drift tid med IM-MS på tre forskellige bølge hastigheder (fx, 650, 550 og 600 m/s) samtidig med at den samme bølgehøjde (f.eks. 40 V).</li>
	<li>For at bestemme protein ioner CCS, foranstaltning protein calibrants på samme betingelser instrument anvendes for protein under undersøgelsen. Optimal drift-tid kalibrering kræver måling af proteiner med kendte CCS.<ol>
<li>Vælg fire calibrants, to med en masse ovenfor og to med en masse nedenfor for protein under undersøgelsen37. Vigtigst af alt, Sørg for, at bølgehøjde og bølge velocity er de samme som dem, der registreres for protein under undersøgelsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregne CCS manuelt41 eller ved hjælp af en specialiseret software som PULSAR33 og Amphitrite34 (figur 5).</li>
	<li>For at kontrollere, om proteinet er indfødt-lignende i gasfasen, Sammenlign eksperimentelle CCS til teoretiske CCS fremstillet af høj opløsning strukturer. HerA-NurA, beregne teoretiske CCS ved hjælp af metoden projektion tilnærmelse (PA) anvendes i MOBCAL42. Andre metoder omfatter bane metode (TM)42 og nøjagtige hårde kugle spredning (EHS)43.</li>
</ol>4. i-løsning afbrydelse af proteinkomplekser for indfødte MS og IM-MS førte struktur bestemmelse
Bemærk: Sub proteinkomplekser kan i nogle tilfælde identificeres fra den samme løsning som intakt complex. Imidlertid yderligere strukturelle oplysninger såsom Inter subunit connectivity og kompleks samling kan nås fra forstyrre protein interaktioner i løsning, form sub komplekser. Dette kan opnås på flere måder som tilsætning af organisk opløsningsmiddel, den ioniske styrke eller manipulere pH. For at få indblik i HerA-NurA komplekse subunit connectivity og komplekse forsamling, blev sub komplekser genereret i løsning ved at tilføje opløsningsmidler som forurolige subunit interaktioner.
<ol><li>Forberede protein buffer og prøve udveksling i ammoniumacetat, som beskrevet i trin 1.</li>
	<li>Tilføje 10-40% af opløsningsmiddel i intervaller på 10%. Opløsningsmidler anvendes typisk er Methanol (MeOH), dimethylsulfoxid (DMSO) eller acetonitril (ACN). Bemærk: Dette kan udføres inden for et polypropylen microcentrifuge rør.</li>
	<li>Inkuber blandingen på køl i 1 time.</li>
	<li>Erhverve en IM-MS spektrum for hver betingelse (trin 2 og 3) (figur 4).</li>
	<li>Bruge topmødet software44 at tildele sub proteinkomplekser og generere protein interaktion netværk. Alternativt kan du manuelt oprette en liste over teoretiske masserne af de forventede arter.</li>
	<li>For at sikre, at subcomplexes er foldet, beregne eksperimentelle CCS værdierne for de underordnede komplekser og sammenligne med teoretiske CCS som beskrevet i trin 3 (tabel 1, figur 5 og figur 6).</li>
</ol>5. undersøge Protein kompleks stabilitet ved hjælp af kollision induceret udfoldelsen (CIU)
Bemærk: CIU kan bruges sonde strukturelle stabilitet af proteiner og deres komplekser ved ligand bindende. Specialist softwarepakker som PULSAR33, Amphitrite34 og CIU suite9 kan derefter bruges til at modellere gas-fase udfoldelsen af protein under undersøgelsen med og uden ligand. Som et eksempel, i dette afsnit beskrives proceduren for overvågning gas-fase udfoldning baner og undersøge den stabiliserende virkning på DNA og ATP bindende på HerA-NurA kompleks.
<ol><li>IM-MS postdataene samtidig øge den fælde acceleration spænding fra 10 V til 200 V i 2-10 V ad gangen til gradvis udfolde protein i gas-fase. Bemærk: Optager mindre intervaller resultater i flere datafiler til at behandle, men denne metode giver mere løst udfoldelsen plot, hvilket er vigtigt til at analysere overgangen point mellem foldet/udfoldede arter.</li>
	<li>Analysere de data, der er erhvervet ved hjælp af PULSAR33, Amphitrite34 eller CIU suite9 og generere to-dimensionelle udfoldelsen parceller i enheder af CCS som en funktion af accelererende spænding (trin 3). For hver afgift tilstand, er det lavet af stabling intensitet-normaliseret CCS distributioner på hver accelererende spænding (figur 7 A-Bi).</li>
	<li>Generere en teoretisk udfoldelsen plot ved hjælp af software-pakker. Dataene vil blive monteret på en udfoldelsen model. Dette gør det muligt at kvantificere den collisional energi hvor udfoldelsen overgange forekomme og bestemme stabilitet af proteiner med og uden bundne ligander33. En udfoldelsen overgang er når en arter overgange fra den ene medlemsstat (baseret på deres eksperimentelle CCS værdier) til en anden stat med en større CCS.</li>
	<li>For at kvantificere overgangene, beregne de midlertidige midpoint(s) mellem stater ved hjælp af algoritmer og software som PULSAR33. Dette er almindeligt rapporteret som CV50, hvilket er værdien kollision (fælde) spænding på som 50% af en bestemt tilstand er forarmet.</li>
	<li>Brug CV50 værdi, beregne den samlede indre energi af en ion, ved hjælp af center for masse kollisionen energi (KECOM)45. KECOM er defineret ved det samlede indre energi til rådighed for udfoldelsen overgangen af en ion og beregnes ud fra den kinetiske energi og masser af kollision partnere (protein ion og neutral gas) som beskrevet i ligning (1)10 KEcom (eV) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57966/57966eq1.jpg"> (ligning 1). Hvor Z er charge ion MN er massen af den neutrale gas og MION er massen af protein ion. Bemærk: Dette er fordi CIU af proteiner er afgift dependent46, 47. Det anbefales at udføre KECOM analyse til mere end én afgift tilstand ( figur 7Aii).</li>
</ol>6. modellering procedurer for Differential Molecular Dynamics simulationer bruges i Integrativ MS
Bemærk: Ved hjælp af modeller af protein-underenheder eller komplekser såsom fra krystal strukturer, kan differential MD simuleringer (protein kompleks, med og uden ligand) bruges til at bestemme virkninger af for eksempel ligand tilstedeværelse på protein struktur og dynamik. Dette afsnit indeholder oplysninger om en arbejdsproces og nødvendige værktøjer til modellering nødvendige til set-up differential molecular dynamics simulationer procedurer.
<ol><li>Identificere de underenheder, som komponerer kompleks (fig. 8A, i trin 2 og 3). Kilde eksisterende modeller af underenheder, fx krystal strukturer fra RCSB database (https://www.rcsb.org). UniProt løsning af protein vil indeholde en liste over ved krystallografiske/NMR strukturer (http://www.uniprot.org). Hvis disse ikke er tilgængelig, kan det teoretiske sekvens input til BLAST at identificere passende skabeloner for homologi modellering (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).</li>
	<li>Samle kompleks i den korrekte topologi (fig. 8A-ii). Dette kan gøres gennem forskellige metoder. De enkelte underenheder kan monteres i tilgængelige elektronmikroskopi maps findes på EMDB at samle intakt komplekset (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). En tutorial om montering udhuling i EM kort ved hjælp af Molekylær dynamik fleksibel montering (MDFF) kan findes her: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.</li>
	<li>Identificere manglende regioner i komplekset (fig. 8A-iii). Udføre flere sequence alignment (MSA) mellem FBF og teoretiske sekvens til at identificere restkoncentrationer, som kan være uegnet til crystal strukturer eller enhver mutationer arvet fra krystallografiske eksperimenter. MSA kan udføres ved hjælp af webservere som T-kaffe (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular).</li>
	<li>Regenerere mangler restkoncentrationer via homologi modellering (fig. 8A-iv). Mangler restkoncentrationer af protein kompleks kan bygges ved hjælp af MODELLØR program (https://salilab.org/modeller/). MODELBYGGER kan udlæse et ensemble af n modeller i forskellige folier konfigurationer. Gode modeller kan identificeres baseret på deres diskrete optimeret Protein energi (DOPE) score. En omfattende tutorial tilbydes på webstedet software (https://salilab.org/modeller/tutorial/).</li>
	<li>Udføre differential molecular dynamics (MD) simuleringer af protein kompleks (figur 8B) for at identificere regioner af proteiner, der reagerer på en bestemt miljøændringer, fx tilstedeværelsen af en ligand. I sådanne simuleringer, adfærdsmæssige parametre fra simulering A (kun protein) som fungerer som reference, er trukket fra simulering B (protein + ligand). Differential kvadratiske udsving (RMSF) beregnes mellem simuleringer A og B kan informere om regioner af protein, som forøge eller formindske i fleksibilitet i en ligand afhængige måde.<ol>
<li>Udføre MD simuleringer og downstream analyse ved hjælp af GROMACS (http://www.gromacs.org). En tutorial kan findes på: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Til elimate model bias, skal af ligand-bundet kompleks struktur oprettes først. Proteinet er derefter kopieret fra dette uden ligand, at give et protein model identisk med ligand-bundet kompleks.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

MS spiller en stadig vigtigere rolle i kendetegner støkiometrisk, interaktioner og subunit arkitektur af proteinkomplekser. IM-MS data kan bruges til at definere topologiske arrangementer af underenheder i stand komplekser. Sammenlignet med andre eksisterende metoder, strukturel biologi, har MS flere fordele. Native MS er en hurtig og meget følsomme teknik og kan bruges til at probe heterogene protein prøver. Når kombineret med i-løsning forstyrrelser eksperimenter, kan dissociation veje af protein forsamlinger overvåges. Sammen med krystal strukturer eller homologi modeller, de oplysninger, der tilbydes af strukturelle MS tilbyder et redskab til at undersøge protein-ligand interaktioner og give nær indfødte modeller og forsamling veje11.
Her beskriver vi de nødvendige eksperimentelle procedurer til at analysere støkiometrisk og sammensætningen af protein-ligand interaktioner, med en eller flere ligander, ved hjælp af Integrativ MS. Dette omfatter MS prøveforberedelse, dataopsamling, analyse af data og integration af MS data ved hjælp af beregningsmæssige redskaber. For at gøre dette, brugte vi den DNA-resektion HerA-NurA hetero-oligomere protein kompleks, bundet til tre ligander (DNA, ATP og ADP), som vores modelsystem. Protokollen viser brugen af den aktuelt tilgængelige software til at støtte dataanalyse og præsentation.
Erhverve høj kvalitet spectra er vigtigt for ligand bindende analyse, derfor forsigtig prøve forberedelsestrin er kritisk, herunder protein oprensning, ligand titrering og buffer exchange. En indskrænkning af Pernilles indfødte MS når man studerer ligand bindende er ikke-specifik binding. Ikke-specifik binding opstår under dråbe desolvation hele electrospray proces. Dette øger ligand koncentrationen og derfor ændrer protein/Ligand forholdet29. Bindingen af nukleotider resulterer i en relativt lille masse forskel mellem apo og nukleotid-bundet protein, der ikke ændrer ionisering effektivitet50,51.
Vi brugte Synapt G2-Si MS system for vores arbejde, men protokollerne, der er gældende for forskellige undersøgelser af andre protein-ligand komplekser ved hjælp af andre kommercielt tilgængelige nano-electrospray massespektrometre. Integrativ strukturelle MS i stigende grad spiller en vigtig rolle i håndteringen af biologiske problemer af større kompleksitet. Arbejdsproces og teknikker beskrevet her er velegnet til at forstå de strukturelle konsekvenser og bygning mekanismer af protein kompleks og protein-ligand dannelse, som ellers er vanskeligt at studere ved hjælp af konventionelle strukturelle teknikker .

Native massespektrometrisk analyse af intakt proteiner og deres komplekser er udført ved hjælp af electrospray og nano-electrospray Ionisation (Petras), som bevarer proteinfoldning og non-kovalente interaktioner under ionisering proces1, 2. I native MS bevares strukturen af proteiner og deres komplekser i en nær-naturlig tilstand i gas-fase3,4. Native MS registrerer flere opladet protein ioner, som er adskilt efter deres masse til at oplade ratio (m/z) giver mulighed for masse af protein eller protein-ligand komplekse skal beregnes. Disse oplysninger gør det muligt for bestemmelse af en intakt proteiner støkiometrisk, subunit sammensætning, ligand bindende og interaktion netværk3,4,5,6. Native MS har flere fordele sammenlignet med andre teknikker disse røntgenkrystallografi og Kernemagnetisk resonans-spektroskopi5. For det første er indfødte MS en hurtig og meget følsomme teknik, der kræver kun et par microliters (2-3 µL) prøve ved relativt lave endelige komplekse koncentrationer i de høje nM til lav µM range6. For det andet, native MS kan bruges til at afhøre heterogene protein prøver at gøre det muligt at analysere flere proteiner og oligomere stater samtidigt. For det tredje, native MS ikke kræver protein prøver skal ændres før analyse af kemiske crosslinking eller protein mærkning. Disse fordele har foretaget strukturelle MS et kraftfuldt værktøj til den strukturelle undersøgelse af proteinkomplekser.
Native MS kan kombineres med ion mobilitet (IM), en teknik, der måler den tid, en protein ion tager for at rejse gennem et elektrisk felt, så collisional tværsnit (CCS) bestemmes. CCS giver lav opløsning strukturelle oplysninger, som muliggør topologi og konformationelle heterogenitet oplysninger af proteiner der skal indhentes. Desuden, det giver mulighed for undersøgelse af protein strukturelle modeller genereret af beregningsmæssige metoder.
Protein gas-fase stabilitet kan undersøges ved hjælp af kollision induceret udfoldning (CIU) målt ved IM-MS. Undervejs CIU er protein ioner accelereres og aktiveret gennem øget accelererende kollisioner med en inert buffer gas inden for et massespektrometer7,8,9. Denne collisional aktiveringsprocessen forårsager protein til delvist udfolde, som udmønter sig i en stigning i CCS. Denne ændring i CCS og energi, der kræves til at udfolde proteinet kan være målt ved IM-MS. ved hjælp af denne fremgangsmåde, effekten af ligand bindende protein stabilitet kan være målt10. Subcomplexes kan genereres i løsning ved hjælp af i-løsning forstyrrelser metoder såsom tilsætning af organiske opløsningsmidler til at overvåge native-lignende topologier af proteinkomplekser. Afbrydelse af proteinkomplekser er hovedsagelig skyldes forstyrrelse af samhandelen ikke-kovalente interaktioner. Sub komplekser opretholde native-lignende topologier og på MS afsløring, afsløre oplysninger om Inter subunit connectivity.
Integrativ tilgange i strukturbiologi kombinere forskellige metoder til at studere strukturen og dynamikken i proteiner og deres komplekser3,4,5,6. Native MS og IM-MS har været brugt til at afdække de molekylære detaljer af udfordrende biologiske systemer. Der har været flere eksempler på anvendelser, herunder undersøgelse af protein forsamling veje11,12,13,14, studerer protein-protein interaktion netværk15 , 16 , 17, membran proteiner6,18,19,20,21, og protein-ligand interaktioner som nukleinsyrer22,23 ,24.
Native MS har imidlertid også sine begrænsninger. Native MS målingerne udføres ofte i flygtige buffere såsom vandig ammoniumacetat hvor nogle proteiner ikke bevarer deres foldede hjemstat3,25. Ikke desto mindre har de seneste arbejde vist, at denne begrænsning kan overvindes ved optimering af sprøjtning nål tip diameter (0.5 mm tips) sådan, at protein og protein kompleks ioner kan dannes direkte fra ikke-flygtig buffere med høj-Ioniske-styrke, der bedre efterligne den fysiologiske miljø26. Desuden bruger native MS electrospray at ionisere og overføre ikke-kovalente assemblies fra løsning til gasfasen; den relative forekomst af detekterede komplekser kan ikke fuldt ud repræsenterer derfor, i løsning5,27. Desuden, i sammenligning med i løsningen, gas fase hydrofobe interaktioner bliver svagere og elektrostatiske interaktioner blive stærkere og dermed begunstiget3,28.
I denne artikel leverer vi protokoller, dataanalyse og fortolkning til protein identifikation og ligand bindende ved hjælp af indfødte MS, IM-MS, CIU, i løsning forstyrrelser, og modellering. DNA reparation kompleks, HerA-NurA, bruges som et modelsystem. DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) er en af de mest cytotoksiske og skadelige former for DNA-skader, hvilket resulterer i genetiske ustabilitet og eventuel udvikling af kræft hos mennesker. Homologe rekombination er reparation mekanisme, som udrydder DSBs, en proces, der er dirigeret af ATP afhænger af helicase-nukleasen komplekse, HerA-NurA22.
Ved at kombinere indfødte MS og IM-MS med funktionelle analyser og modellering tilladt undersøgelse af: i) NurA rolle i forsamlingen, kropsbygning og stabilitet af komplekset, ii) samspillet mellem dsDNA og komplekset og dens indflydelse på samlet stabiliteten i komplekset, og iii) støkiometrisk og virkningen af ATP bindende forsamling22. Alt i alt dette arbejde førte til en bedre forståelse af det molekylære grundlag af HerA-NurA kompleks ved at sammenkæde protein kompleks konformationelle ændringer og stabilitet med nukleotid bindende. Denne protokol er generiske for alle protein complex(es), der interagerer med en eller flere ligand(s) typer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">119120-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">20398-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ammonium acetate solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td style="width:71px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">7326204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vivaspin concentrator</td>
			<td style="width:71px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">Z614041-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Water TraceSelect</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">300060</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry

Proteiner er en vigtig klasse af biologiske makromolekyler, der spiller mange vigtige roller i cellulære funktioner herunder genekspression, katalysere metaboliske reaktioner, DNA reparation og replikeringsdata. Derfor, en detaljeret forståelse af disse processer indeholder vigtige oplysninger om, hvordan celler funktion. Integrativ strukturelle MS metoder giver strukturelle og dynamiske oplysninger om protein kompleks samling, komplekse connectivity, subunit støkiometrisk, protein oligomerisering og ligand bindende. De seneste fremskridt i Integrativ strukturelle MS har tilladt for karakterisering af udfordrende biologiske systemer, herunder store DNA-bindende proteiner og Membranproteiner. Denne protokol beskriver hvordan man kan integrere forskellige MS data såsom indfødte MS og ion mobilitet-massespektrometri (IM-MS) med molecular dynamics simulationer for at få indblik i en helicase-nukleasen DNA reparation proteinkompleks. Den resulterende tilgang giver en ramme for detaljerede undersøgelser af ligand binding til andre proteinkomplekser involveret i vigtige biologiske processer.

Native MS resultater afslørede oligomere stat, sammensætning og topologi af HerA-NurA kompleks (figur 1). Som non-kovalente interaktioner er bevaret i gas-fase, indfødte MS af ATP-γ-S og ADP titreringer eksperimenter bestemmes den parvise nukleotid binding til HerA-NurA (figur 2) og at øge ATP-γ-S koncentrationen øges relative intensiteten af hexameric HerA (figur 3). Strukturelle oplysninger vedrørende underenheder interaktioner stammer fra-løsning forstyrrelser efterfulgt af indfødte MS og var efter aftale med og teoretiske masserne (figur 4 og tabel 1).
De eksperimentelle CCS værdier af proteiner og deres komplekser blev afledt fra IM-MS eksperimenter (figur 5). Disse værdier er rotationsstøbt gennemsnit gasfasen tværsnits beregninger af den molekylære form, og beskrive den dimensional tilstand af protein. CCS værdier sammenholdes med teoretiske målinger fra uorganisk kemi og en god aftale udleder, at den oprindelige figur i bevaret i gas-fase (tabel 1). Dette kontrollerer ved hjælp af CCS værdier for bygning med lav opløsning modeller af protein forsamling48.
Eksperimentelle CCSs kan beregnes for hver opladning stat ion. En indfødt-lignende protein konformer kan give anledning til at oplade stat ioner med lignende CCS værdier. Højere afgift tilstand ioner steg imidlertid coulombic frastødninger, hvilket kan føre til protein gas-fase udfoldelsen og større CCS værdier i forhold til de teoretiske CCSs. CCS værdien af den laveste afgift tilstand ioner er derfor normalt anvendes49. For HerA-NurA, i løsning forstyrrelser eksperimenter på HerA og HerA-NurA med og uden DNA bedt generation af en forsamling pathway begyndt med monomerer så danner den hele hexameric HerA (HerA6)-dimerisk NurA (NurA2) kompleks med DNA (figur 6).
Forskelle i KI'ET udfoldelsen parceller mellem apo (ligand-fri) og ligand bundet definere ændringen i komplekse stabilitet ved ligand bindende. En højere CV50 eller KECOM værdi indebærer en mere stabiliseret ion i gas-fase. CIU og KECOM analyse afslørede DNA-bundet HerA-NurA er mere stabil end DNA-fri komplekset (figur 7Aii). Fra CIU-MS analyse i de respektive stater, ATP-binding, fire-ATP-γ-S bundne staten reduceret komplekse stabilitet i gas-fase og de seks -ATP-γ-S bundet tilstand hvor er alle steder er besat var den mest stabil (figur 7Bii). Native MS kan afsløre den diskrete nukleotid bindende stater af HerA; men det kan ikke skelne hvilke HerA underenheder er bindende ATP og hvor bindingen finder sted. Denne information kan være afledt af eksplicitte opløsningsmiddel MD simuleringer på hexameric HerA og HerA-NurA efter sammenfattet arbejdsprocessen (figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Figur 1. Forhører oligomere stat, sammensætning og topologi af HerA-NurA non-kovalente kompleks. (A) massespektre af HerA, HerA-NurA og HerA-NurA i overværelse af DNA (15,4 kDa 25 bp dobbelt-strenget DNA). HerA sub komplekset findes som både en hexamer og en heptamer. NurA dimer binder og en HerA hexamer at pålægge oligomere konvertering. DNA binder dannede HerA - NurA komplekset (resultater tilpasset fra Z. Ahdash et al., 201722). (B) relative intensiteter af de identificerede arter beregnes ud fra UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Figur 2. Native ESI-MS afslører mekanismen af nukleotid binding til HerA-NurA. Massespektre a HerA-NurA og b HerA-NurA-DNA med stigende koncentrationer af (i) ATP-γ-S og (ii) ADP. Målte masserne er sammenlignet med teoretiske masserne og mængden af ATP-γ-S eller ADP bundet bestemmes. Målte masserne og antallet af bundne nukleotider er vist på spektre. ATP-γ-S og ADP titreringer eksperimenter bestemmes parvise nukleotid bindingen til HerA-NurA alene og når i kompleks med DNA med angivelse af en cyklisk reaktionsmekanisme (resultater tilpasset fra Z. Ahdash et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> Figur 3. Måle effekten af stigende ATP-γ-S koncentrationer på HerA oligomere stat. (A) massespektre af HerA på stigende koncentrationer af ATP-γ-S. (B) graf viser de relative intensiteter af forskellige arter af indfødte MS beregnes UniDec deconvolution software32. Som ATP-γ-S koncentrationen stiger, øges den relative intensitet af hexameric HerA også. Antal ATP-γ-S molekyler bundet er vist på spektre (resultater tilpasset fra Z. Ahdash et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Figur 4. Masse spectra og sub komplekse dissociation produkter a HerA og b HerA-NurA (i) alene og (ii) DNA følgende-løsning forstyrrelser. I-løsning forstyrrelser eksperimenter blev udført ved hjælp af 10-40% af acetonitril, Methanol (MeOH) eller dimethylsulfoxid (DMSO) og resulterede i dannelsen af forskellige subcomplexes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Figur 5. Ion mobilitet ankomst tid distributioner vist på en CCS akse for komplekser og genererede sub komplekser. Ikonet for hver sub komplekse korrelat med dem, der kommenterede på spektre i figur 4. Eksperimenterende og beregnede masserne og CCS værdier af sub komplekser er angivet i tabel 1 som alle viste en aftale mellem eksperimentelle og beregnede værdier (efter at have overvejet de typiske usikkerhed i løsningen af rejser bølge ion mobilitet massespektrometri af ± 5 - 8%37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Figur 6. Forsamling pathway af HerA-NurA komplekset genereret fra-løsning forstyrrelser indfødte MS og IM-MS. farvede cirkler angive betingelser, hvor hver sub kompleks blev observeret: native (grøn, forud for forstyrrelser), Methanol (gul), DMSO (lilla) eller Acetonitril (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Figur 7. Undersøge den stabiliserende virkning af (A) DNA på HerA-NurA og b ATP binding til HerA-NurA-DNA. a gasfasen CIU-MS plots og (ii) center for masse kollisionen energi (KEcom) beregning viser, at tilstedeværelsen af dsDNA stabiliserer HerA-NurA kompleks og at seks ATP-γ-S bundet stat er den mest stabile. Stabilisering for forskellige afgift stater er vist. Parceller blev genereret ved hjælp af PULSAR 33. Resultater fra (A) tilpasset fra Z. Ahdash et al., 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Figur 8. Arbejdsgang for modellering procedurerne for differential molecular dynamics simulationer. (A) generere kompleks under undersøgelsen ved at bygge topologi fra eksisterende subunits og genopbygge mangler restkoncentrationer. (B) arbejdsgang for kører molecular dynamics simulationer på protein kompleks med og uden ligand. Molecular dynamics simulationer er løb for protein kun som fungerer som en reference og som trækkes fra simulering af protein plus ligand. Dette er efterfulgt af beregning af differential kvadratiske udsving (RMSF) mellem simuleringer og fastlægge effekten af ligand bindende. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Komplekse / sub komplekse</td>
			<td>Teoretisk masse (kDa)</td>
			<td>Eksperimentelle masse (kDa)</td>
			<td>Teoretisk CCS (Å2)</td>
			<td>Eksperimentelle CCS (Å2) [gratis]</td>
			<td>Betingelse HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>10% ACN, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40% meth, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% kan, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6 + DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7 + DNA</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Bord 1. Eksperimenterende og beregnede masserne og CCS værdier af HerA-NurA og dens sub komplekser genereret form i-løsning forstyrrelser undersøgelser.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Analysere Protein arkitekturer og Protein-Ligand komplekser af Integrativ strukturelle massespektrometri

Massespektrometri (MS) er opstået som et vigtigt redskab for undersøgelse af strukturen og dynamikken i makromolekylære forsamlinger. Her, integrere vi MS-baserede tilgange til at afhøre protein kompleks dannelse og ligand bindende.

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

I dag massespektrometri spiller en vigtig rolle i strukturel biologi. Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål om vigtige biologiske makromolekyler i deres oprindelige tilstand, især proteiner og proteinkomplekser. Native massespektrometri er bredt anvendelig til en række biomolekylære forsamlinger, herunder multiprotein og nukleinsyre systemer.Den største fordel ved denne teknik er, at det er hurtigt og meget følsomt. Det kan bruges til at afhøre heterogene proteinprøver, gør det muligt at analysere flere proteiner i oligomerisk tilstand samtidigt. At demonstrere proceduren vil være Andy Lau, en ph.d.-studerende i min gruppe.For at indlede denne procedure skal de interne kapillærer forberede nanoelektrospray som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en ligand-fri prøve som et kontrolelement for hvert løb som bufferbytte hver i ammoniumacetat. Vælg derefter tilstandene følsomhed, positiv ionerhvervelse og mobilitets-TOF..Næste sving på fælden, API, og IMS gasser. Til IM-separation anvendes nitrogen- og argonstartpunkterne vist her og justeres efter behov. Angiv et passende m/z-anskaffelsesområde.For et ukendt protein bør de indledende optimeringstrin bruge en bred vifte. Sæt den guldbelagte kapillær i en kapillærholder. Derefter belastning mellem to og tre mikroliter af protein kompleks løsning af interesse i kapillær.Stram kapillæren forsigtigt og læg den på elektrospraykildestadiet. Skub fasen i position for at begynde at hente data. Påfør et lavt nanoflow gastryk, indtil et fald dannes på spidsen af kapillæren.Flyt kapillæren i forhold til keglen, og overvåg ionstrømen for at opnå en stabil ionstrøm. Der påføres en kapillær spænding i området mellem 0,9 og 1,6 kilovolt. Angiv derefter samplingkeningen, kildeforskydningen, kildetemperaturen og keglegasstrømmen som beskrevet i tekstprotokollen.For at opnå et velafsteplet massespektrum og maksimeret iontransmission skal du justere MS-parametrene og overvåge den deraf følgende ændring i spektrene. Indstil fældekollisionsenergien til et indledende udgangspunkt mellem 10 og 50 volt. Hvis spændingsforskydningerne er utilstrækkelige, skal du justere spændingskollisionsenergierne.Indstil fælden via spændingen til et indledende udgangspunkt mellem 20 og 45 volt. Forbedre ødelæggelse ved at optimere denne spænding. Derefter optimeres bølgehastigheden og bølgehøjden som beskrevet i teksten for at opnå den bedste mobilitetsadskillelse.For undersøgelser, der involverer HerA og NurA bruge en bølgehastighed på 40 meter i sekundet og en bølgehøjde mellem 550 og 650 volt. For DNA-bindingsanalyse blandes proteinet og DNA'et i et molære forhold, der giver mulighed for protein-DNA-kompleks dannelse. Tilføj stigende mængder af en af følgende, 5'O-3-thio-tripfosfat, tetralithium salt, eller ADP.Ved hjælp af passende software måle masserne af genererede arter og identificere ligand bindende, såsom ATP og ADP bindende og oligomeric stater. Brug derefter de ionintensiteter, der er observeret i det rå ESI MS-spektre, til at kvantificere den tilsvarende relative forekomst af arter. Efter optimering af instrumentbetingelserne for stabil transmission reduceres kollisionsenergien og prøvetagningskeveen så lavt som muligt, samtidig med at den bevarer en god spektrekvalitet.Brug den tidligere bestemte optimerede bølgehastighed og bølgehøjde til at anskaffe IM MS. Mål iondriftstiden ved tre forskellige bølgehastigheder, samtidig med at den samme bølgehøjde opretholdes. For at bestemme proteinion CCS måle fire protein calibrants, to med massen over det protein, der undersøges, og to med massen nedenfor, ved hjælp af de samme instrumentering betingelser. Først forberede protein prøver og buffer udveksle dem i ammoniumacetat som skitseret i tekstprotokollen.Der tilsættes opløsningsmiddel i intervaller på 10 %, indtil det når den ønskede mængde. Inkuber på is i en time. Derefter skal du anskaffe et IM-MS-spektrum for hver prøve.Brug SUMMIT-softwaren til at tildele proteinunderkomplekser og generere proteininteraktionsnetværk. Alternativt manuelt generere en liste over teoretiske masser for de forventede arter. For at begynde at undersøge protein kompleks stabilitet, registrere IM-MS data og samtidig øge fælden acceleration spænding fra 10 volt til 200 volt, som gradvist vil udfolde sig til protein og gasfasen.Analysér dataene ved hjælp af passende software, og generer todimensionale udfoldelsesområder ved at stable intensiteten normaliserede CCS-distributioner ved hver accelererende spænding for hver opladningstilstand. Native MS resultater afslører oligomeric tilstand, sammensætning, og topologi af HerA og NurA kompleks. Da ikke-kovalerente interaktioner bevares i gasfasen, bruges oprindelige MS for ATP gamma S og ADP-titreringseksperimenter til at bestemme den parvise nukleotidbinding i HerA og NurA.Massespektre af HerA oligomeric stater afslører, at øge ATP gamma S koncentration øger den relative intensitet hexameric HerA. De eksperimentelle CCS-værdier for proteinerne og deres komplekser stammer derefter fra IM-MS-forsøgene. Disse værdier ses at have god enighed med teoretiske målinger fra røntgenkrystallografi, som validerer ved hjælp af CCS-værdier til opbygning af lavopløsningsmodeller for proteinsamling.CIU og KEcom analyse afslører, at DNA bundet HerA-NurA er mere stabil end DNA-fri kompleks. CIU MS-analyse og de respektive ATP-bindingstilstande viser, at de fire ATP gamma S-bundet tilstand reducerer den komplekse stabilitet i gasfasen. Men de seks ATP gamma S bundet tilstand, hvor alle steder er besat, ses at være den mest stabile.Nøjagtige målinger af molekylmassen i et intakt kompleks giver værdifuld indsigt i biomolekylær karakterisering. Vi kan få oplysninger om komplekse samling veje, protein oligomerization, og ligand bindende. Ved at kombinere alle disse oplysninger gør det muligt at generere detaljerede modeller af funktionelle biologiske forsamlinger.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Chemistry

Biology

Molecular Biology

Unit 1

Fundamentals

Protein Function

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Produktion af disulfid-stabiliserede transmembrane peptidkomplekser til strukturelle studier

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Forbedret i-gel Reduktive β-Elimination for Omfattende O-bundne og sulfo-Glykobiologi ved massespektrometri

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

En Undersøgelse af Kompleksdannelse af kviksølv (II) med Dicysteinyl Tetrapeptider af Elektrospraymassespektrometri ionisationsmassespektrometri

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

En HS-MRM analyse til kvantificering af værts-celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals af væskekromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Real-time ånde analyse ved hjælp af sekundære Nanoelectrospray ionisering koblet til høj opløsning massespektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Kapillær elektroforese massespektrometri tilgange til karakterisering af protein og metabolit Corona erhvervet af nanomaterialer

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Kovalent mærkning med Diethylpyrocarbonat til at studere protein højere ordensstruktur ved massespektrometri

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...