Name: analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

ברצוננו להודות. פיטר קארל Hopfner, רוברט תומאס ביירן בחביבות לספק הרה הרה-נורא חלבון דגימות, על עזרתם עם עיצוב ניסיוני. אנו מודים גם ד ר איימון הקריאה שלו לבדיקה של כתב היד. אנו בתודה להכיר את גופנו מימון: טרסט [109854/Z 15 Z] והחברה המלכותית [RG150216 על אקולוגיה].

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

MS משחק תפקיד חשוב יותר ויותר באפיון סטויכיומטריה, אינטראקציות ואדריכלות יחידת משנה של מתחמי חלבון. IM-MS נתונים יכול לשמש להגדרת סידורים טופולוגי של subunits בתוך מתחמי. MS, לעומת שיטות אחרות-ביולוגיה מבנית קיים, יש מספר יתרונות. MS מקורית היא טכניקה מהירה, רגישה מאוד והוא יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגנית. כאשר משולב עם הפרעה בפתרון ניסויים, ניתן לנטר דיסוציאציה מסלולים של חלבון הרכבות. יחד עם מבנים קריסטל או מודלים הומולוגיה, המידע המוצעים על ידי MS מבניים מציע כלי עבור חוקרים אינטראקציות חלבון-ליגנד ומספקים הרכבה מסלולים11ומודלים קרובה לשפת אם.
כאן, אנו מתארים נהלי ניסיוני הצורך לנתח את סטויכיומטריה והרכב של אינטראקציות חלבון-ליגנד, עם ליגנדים אחד או יותר, באמצעות MS אינטגרטיבית. זה כולל הכנת הדוגמא MS, חדרי קירור והקפאה, ניתוח נתונים, השילוב של נתונים MS באמצעות כלים חישוביים. כדי לעשות זאת, השתמשנו החלבון הטרו-oligomeric DNA-כריתה הרה-נורא מורכבת, מאוגדים ליגנדים שלוש (דנ א, ATP ו ADP), כמערכת מודל שלנו. הפרוטוקול מראה את השימוש בתוכנה זמין כעת כדי לסייע לניתוח נתונים והצגה.
רכישת ספקטרה באיכות גבוהה חשוב לניתוח איגוד ליגנד, לכן, צעדים הכנה מדגם זהיר הם קריטיים, כולל טיהור חלבון, ליגנד טיטור מאגר exchange. מגבלה אחת של נאסי MS יליד כשלמדתי ליגנד מחייב הוא מחייב שאינם ספציפיים. איגוד שאינו ספציפי מתרחשת במהלך droplet desolvation לאורך כל התהליך ספקטרומטריית electrospray. זה מגביר ריכוז ליגנד ומשנה ולכן יחס חלבון/ליגנד29. הכריכה של נוקלאוטידים יוצרת הבדל מסה קטנה יחסית בין אפו נוקלאוטיד מכורך חלבון אשר אינו משנה את יעילות יינון50,51.
השתמשנו במערכת Synapt G2-סי MS עבור העבודה שלנו, אבל הפרוטוקולים הינם ישימים עבור חקירות שונים של מתחמי חלבון-ליגנד אחרים באמצעות ספקטרומטרים המונים אחרים זמינים מסחרית ננו-ספקטרומטריית electrospray. MS מבניים אינטגרטיבית יותר ויותר משחק תפקיד חשוב בטיפול בעיות ביולוגיות מורכבות גדולה יותר. זרימת העבודה והטכניקות המתוארים כאן הם מתאים היטב להבנת ההשלכות מבנית, בניית מנגנונים של חלבונים מורכבים, היווצרות חלבון-ליגנד אשר אחרת קשה ללמוד באמצעות טכניקות מבניים קונבנציונלי .

ניתוח המוני spectrometric מקורית של חלבונים שלמים, מתחמי שלהם מתבצעת באמצעות ספקטרומטריית electrospray ו ננו-ספקטרומטריית electrospray יינון (נאסי), המשמרים קיפול חלבונים ואינטראקציות שאינם קוולנטיות במהלך תהליך יינון1, 2. ב- MS מקורית, המבנה של חלבונים, מתחמי שלהם נשמרות במצב קרובה לשפת אם3,גז-שלב4. MS יליד מזהה יונים חלבון טעונה מרובים, אשר מופרדים על-פי מסת לחייב יחס (מ/z) המאפשר את המסה של חלבון או חלבון-ליגנד מורכבים לחשב. מידע זה מאפשר קביעת של חלבון שלם סטויכיומטריה, יחידת משנה הרכב, איגוד ליגנד ו אינטראקציה רשתות3,4,5,6. MS מקורי יש כמה יתרונות לעומת טכניקות אחרות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה5. ראשית, יליד MS הוא טכניקה מהירה, רגישה מאוד, המחייב רק כמה microliters (2-3 µL) מדגם בריכוזים מורכבות נמוכה יחסית הסופי ב- nM גבוהה מיקרומטר נמוכה בטווח6. שנית, יליד MS יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגנית בכך ניתן לנתח מספר חלבונים ומדינות oligomeric בו זמנית. שלישית, יליד MS לא דורשת דגימות חלבון כדי להיות שונה לפני ניתוח על-ידי crosslinking כימי או חלבון תוויות. יתרונות אלה הפכו מבניים MS כלי רב עוצמה עבור החקירה מבנית של מתחמי חלבון.
MS מקורית ניתן לשלב עם יון ניידות (IM), טכניקה המודד את הזמן שיון חלבון לוקח לנסוע דרך שדה חשמלי, המאפשר את חתך collisional (מיליגרם) נקבע. CCS מספקת מידע מבניים ברזולוציה נמוכה, המאפשרת טופולוגיה ומידע הסתגלותי הטרוגניות של חלבונים כדי להתקבל. יתר על כן, היא מאפשרת הבחינה של מודלים מבניים חלבון שנוצר על ידי גישות חישובית.
יציבות גז-פאזי חלבון יכול ייחקרו באמצעות התנגשות המושרה התגלגלות (ciu לקדם) נמדד מאת IM-MS. במהלך תהליך ciu לקדם, חלבון יונים מואצת, מופעלת באמצעות מוגברת מאיץ התנגשויות גז אינרטי מאגר בתוך ספקטרומטר מסה7,8,9. תהליך ההפעלה collisional זה גורם החלבון להתגלות חלקית, אשר מיתרגם עלייה מיליגרם. שינוי זה CCS, האנרגיה הדרושה כדי לגולל את החלבון יכול להיות נמדד באמצעות IM-גב' בגישה זו, ההשפעה של ליגנד מחייב על יציבות חלבון יכול להיות נמדדו10. ניתן להפיק subcomplexes בתמיסה בשיטות הפרעה בפתרונות כגון התוספת של ממיסים אורגניים לפקח טופולוגיות כמו מקורי של מתחמי חלבון. שיבוש מתחמי חלבון הוא בעיקר עקב שיבוש אינטראקציות אי-קוולנטיות "אינטרה". מתחמי משנה לשמור על ילידים דמויי טופולוגיות, זיהוי MS, לחשוף מידע אודות קישוריות בין יחידה משנית.
גישות אינטגרטיבית בביולוגיה מבנית לשלב שיטות מגוונות כדי ללמוד את המבנה ואת הדינמיקה של חלבונים ו שלהם מתחמי3,4,5,6. יליד MS ו- IM-MS שימשו לגלות את הפרטים המולקולרי של מערכות ביולוגיות מאתגר. היו מספר דוגמאות של יישומים כולל המחקר של חלבון הרכבה מסלולים11,12,13,14, לומד רשתות אינטראקציית חלבון-חלבון15 , 16 , 17קרום חלבונים6,18,19,20,21, אינטראקציות חלבון-ליגנד כגון חומצות גרעין22,23 ,24.
עם זאת, יליד MS יש גם המגבלות. יליד MS מדידות מבוצעות לעתים קרובות במאגרי נדיפים כגון אמוניה מימית אצטט שבו כמה חלבונים לא ישמרו שלהם במצב מקופל יליד3,25. בכל זאת, העבודה האחרונה הראו כי מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי אופטימיזציה של ריסוס בקוטר קצה המחט (טיפים 0.5 מ מ) כך חלבון ו יונים מורכבים חלבון יכול להיווצר ישירות מתוך מאגרי לא נדיף עם יונית-חזקה יותר לחקות סביבה פיזיולוגיים26. בנוסף, יליד MS משתמשת ספקטרומטריית electrospray ionize ולהעביר את הרכבות קשרי ערכיות מהפתרון לשלב גז; לכן, שפע יחסי של מתחמי שאותרו לא מלאה מייצג זה פתרון5,27. יתר על כן, לשם השוואה כדי בתמיסה, אינטראקציות הידרופוביות שלב גז הפך חלש יותר, אלקטרוסטאטיות להתחזק, ולכן העדיף3,28.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים, ניתוח נתונים, פרשנות עבור זיהוי חלבונים וליגנד איגוד באמצעות MS מקורית, IM-MS, ciu לקדם, הפרעה בפתרונות, ו דוגמנות. המתחם תיקון ה-DNA, הרה-נורא, משמשת כמערכת מודל. מעברי כפול גדילי הדנ א (DSBs) הם אחת הצורות ביותר ציטוטוקסיות, ברישול של נזק לדנ א, וכתוצאה מכך לחוסר יציבות גנטית, ההתפתחות של סרטן בבני אדם. רקומבינציה הומולוגית היא מנגנון תיקון אשר משורשה DSBs, תהליך אשר הוא בניצוחו של ה ATP הליקאז התלויים-נוקלאז מתחם הרה-נורא22.
שילוב מקורי MS ו- IM-MS עם מבחני פונקציונלי, דגמי מותר החקירה של: i) את התפקיד של נורה הרכבה, קונפורמציה ולאחר היציבות של המתחם, ii) האינטראקציה בין dsDNA לבין המתחם והשפעתו על הכולל יציבות של המתחם, ו- iii) סטויכיומטריה וההשפעה של ATP מחייב מכלול22. בסך הכל, הוביל להבנה משופרת הבסיס המולקולרי של המתחם הרה-נורה על-ידי קישור חלבונים מורכבים שינויים הסתגלותי ויציבות עם נוקלאוטיד מחייב. פרוטוקול זה הוא כללי עבור כל complex(es) חלבון אשר מקיים אינטראקציה עם אחד או מספר סוגי ligand(s).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">119120-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">20398-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ammonium acetate solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td style="width:71px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">7326204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vivaspin concentrator</td>
			<td style="width:71px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">Z614041-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Water TraceSelect</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">300060</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry

חלבונים הם מחלקה חשובה של מקרומולקולות ביולוגיות לשחק תפקידים מרכזיים רבים תאיים כולל ביטוי גנים, ותזרז תגובות חילוף החומרים, תיקון ה-DNA, שכפול. לכן, הבנה מפורטת של תהליכים אלה מספק מידע חיוני על איך תאים פונקציה. שיטות MS מבניים אינטגרטיבית מציע מידע דינמיות מבניים על מכלול מורכבים חלבון, קישוריות מורכבים, יחידת משנה סטויכיומטריה, חלבון oligomerization ואיגוד ליגנד. התפתחויות אחרונות MS מבניים אינטגרטיבית אפשרו עבור אפיון מערכות ביולוגיות מאתגר כולל גדול DNA מחייבת חלבונים וחלבונים ממברנה. פרוטוקול זה מתאר את אופן שילוב נתונים MS מגוונים כגון MS מקורית, יון ניידות-ספקטרומטריית (IM-MS) עם דינמיקה מולקולרית סימולציות לקבלת תובנות לתוך ה-DNA נוקלאז הליקאז תיקון החלבונים. הגישה המתקבלת מספקת מסגרת ללימודי מפורט של ליגנד מחייב מתחמי חלבונים אחרים המעורבים בתהליכים ביולוגיים חשובים.

תוצאות MS מקורי חשף את המדינה oligomeric, הלחנה ו טופולוגיה של המתחם הרה-נורא (איור 1). כפי אינטראקציות אי-קוולנטיות נשמרים בשלב-הגז, MS מקורית של ATP-γ-S ו- ADP titrations ניסויים קבעו האיגוד נוקלאוטיד pairwise כדי הרה-נורא (איור 2) וזה מגביר הגדלת ריכוז ATP-γ-S היחסית עוצמת hexameric הרה (איור 3). מבני מידע לגבי אינטראקציות יחידה משנית, התקבלו בבית-פתרון הפרעה ואחריו MS יליד והיו גשר עם, בגושים התיאורטיים (איור 4 , טבלה 1).
הערכים CCS ניסיוני של חלבונים ומתחמי שלהם היה נגזר ניסויים IM-MS (איור 5). ערכים אלה הם גז rotationally בממוצע-שלב החישובים חתך הרוחב של הצורה המולקולרית, לתאר את המדינה תלת-ממדי של החלבון. CCS ערכים לעומת מדידות תאורטית מ קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, הסכם טוב יסיק כי הצורה המקורית נשמרים ב- גז-פאזי (טבלה 1). זה מאמת באמצעות ערכים CCS לבניית מודלים ברזולוציה נמוכה של חלבון הרכבה48.
CCSs ניסיוני ניתן לחשב עבור כל יון המדינה תשלום. Conformer חלבון כמו מקורי עלול להביא לחייב את המדינה יונים עם ערכי CCS דומים. עם זאת, יונים המדינה תשלום גבוה יותר גדל repulsions coulombic, דבר שעלול להוביל חלבון גז-פאזי התגלגלות גדול CCS וערכי בהשוואה את CCSs תיאורטיים. הערך מיליגרם של המדינה תשלום הנמוך יונים ולכן הם בדרך כלל בשימוש49. עבור הרה-נורא, ניסויים בפתרון הפרעה על הרה ושל הרה-נורא עם או בלי דנ א תתבקש הדור של מסלול הרכבה החל מונומרים ואז להרכיב את כל hexameric הרה (הרה6)-מתחם נורא (נורא2) dimeric עם ה-DNA (איור 6).
הבדלים בין החלקות התגלגלות ciu לקדם בין ליגנד מאוגד apo (חינם ליגנד) להגדיר את השינוי יציבות מורכבים עם איגוד ליגנד. קורות חיים גבוה50 או KECOM ערך מרמז על יון מיוצב יותר הגז-בשלב. Ciu לקדם וניתוחCOM KE התגלה שהדנ א מכורך הרה-נורא יציב יותר המתחם ללא ה-DNA (איור 7כל). מניתוח ciu לקדם-MS במדינות מחייב ATP, המדינה ארבע-ATP-γ-S המאוגדת יציבות מורכבות מופחתת הגז-השלב, 6 -ATP-γ-S המאוגדת המדינה איפה כל האתרים תפוסים היה הכי יציב (איור 7Bii). יליד MS יכול לחשוף את נוקלאוטיד דיסקרטית איגוד מדינות הרה; עם זאת, זה לא יכול להבחין subunits הרה אשר מחייבות ATP, שם איגוד זה מתקיים. מידע זה יכול להיגזר מפורשת סימולציות MD ממס על hexameric את הרה, את הרה-נורא בעקבות זרימת העבודה summarised (איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> איור 1. חוקר את המדינה oligomeric, הרכב ואת הטופולוגיה של המתחם קשרי ערכיות הרה-נורא. (א) ספקטרה המונית של הרה, הרה-נורא הרה-נורא בנוכחות DNA (15.4 kDa 25 bp כפול גדילי DNA). המתחם תת הרה קיימת של hexamer והן של heptamer. דימר נורא נקשר וכדי hexamer הרה הטלת המרה oligomeric. ה-DNA מאגד המתחם בנוי הרה - נורא (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 201722). (ב) עוצמות יחסי המינים שזוהו מחושבים באמצעות UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> באיור 2. ESI-MS מקורי חושף את המנגנון של נוקלאוטיד מחייב הרה-נורא. המוני ספקטרה הרה-נורא (א) ו- (ב) הרה-נורא-DNA עם הגדלת ריכוזי (i) ATP-γ-S ו- (ii) ADP. ההמונים נמדד לעומת בגושים התיאורטיים ואת מידת ATP-γ-S או ADP מאוגד נקבעות. ההמונים נמדד מספר נוקלאוטידים מאוגד מוצגים על הספקטרום. ניסויים titrations ATP-γ-S ו ADP קבעו האיגוד נוקלאוטיד pairwise הרה-נורא לבד, כאשר במתחם עם ה-DNA המציינת את מנגנון התגובה מחזורית (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> איור 3. מדידת השפעת ריכוז ATP-γ-S על מצב oligomeric הרה. (א) מסת ספקטרום של הרה-הגדלת ריכוזים של ATP-γ-S. (ב) גרף המציג את עוצמות היחסי של מינים שונים של MS יליד מחושב באמצעות תוכנה deconvolution UniDec32. ריכוז ATP-γ-S גודלת, שהבוטות היחסית של hexameric הרה גם מגביר. מספר מולקולות ATP-γ-S מאוגד מוצג על הספקטרום (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> באיור 4. המוני ספקטרה ומוצרי דיסוציאציה תת מתחם של הרה (א) ו- (ב) הרה-נורא (i) לבד ובפני הבאים (ii) ה-DNA של שיבוש בבית-פתרון. הפרעה בפתרון הניסויים בוצעו באמצעות 10-40% של Acetonitrile, מתנול (MeOH) או דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) וכתוצאה היווצרות של subcomplexes שונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> איור 5. יון ניידות ההגעה זמן הפצות שמוצג על ציר CCS מתחמי ואת מתחמי משנה שנוצר. סמל עבור כל תת מתחם לתאם עם אלה מוערת על הספקטרום באיור4. ההמונים ניסיוני ומחושב וערכים מיליגרם של מתחמי משנה מפורטים בטבלה 1 אשר הראה הסכם בין ערכים ניסיוני ומחושב (לאחר ששקל הוודאות טיפוסי בהחלטה מטיילים גל יון ניידות ספקטרומטר מסה של ±5 - 8%37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> איור 6. מסלול הרכבה של המתחם הרה-נורא שנוצר מהפרעות בבית-פתרון מקורי עיגולים MS ו- IM-גב' צבעוניים לציין תנאי שבו נצפתה בכל מתחם תת: מקורי (ירוק, לפני כדי הפרעה), מתנול (צהוב), דימתיל סולפוקסיד (סגול) או Acetonitrile (אדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> איור 7. חוקרים את השפעת ייצוב (א) ה-DNA על הרה-נורא ו- ATP (ב) מחייב הרה-נורא-DNA. (i) גז-שלב ciu לקדם-MS חלקות וחישוב אנרגיות (KEcom) (ii) מרכז-של-המונית התנגשות מראים כי הנוכחות של dsDNA מייצבת את מתחם הרה-נורא, ש ATP-γ-S שישה מאוגד המדינה ויש היציב ביותר. מייצב עבור תשלום שונה הברית מוצג. מגרשים נוצרו באמצעות הפולסר 33. תוצאות (א) מ Ahdash צ. et al., 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> איור 8. זרימת עבודה עבור נהלי דינמיקה מולקולרית דיפרנציאלית סימולציות הדוגמנות. (א) יצירת הקומפלקס תחת חקירה על ידי בניית הטופולוגיה מן הקיים subunits ובנייה מחדש של שאריות חסרים. (ב) זרימת עבודה עבור הפעלת דינמיקה מולקולרית סימולציות על החלבונים עם ובלי ליגנד. דינמיקה מולקולרית ההדמיות רץ החלבון רק אילו מעשים כהפניה, אשר הוא המופחת סימולציה של חלבון בתוספת ליגנד. זה מלווה חישוב התנודות דיפרנציאלית שורש ממוצע הריבועים (אולי זאבת) בין ההדמיות וקביעת ההשפעה של ליגנד מחייב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>מורכבות / תת מורכבים</td>
			<td>תאורטית מסה (kDa)</td>
			<td>ניסיוני מסה (kDa)</td>
			<td>CCS תיאורטי (Å2)</td>
			<td>CCS ניסיוני (Å2) [תשלום]</td>
			<td>תנאי, HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה6- נורא2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20% לחצן מצוקה, דימתיל סולפוקסיד 10-40%, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה6- נורא2- dsDNA...</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>לחצן מצוקה 10%, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>נורא1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% לחצן מצוקה, 10% MeOH, 20-40% דימתיל סולפוקסיד</td>
		</tr>
<tr>
<td>נורא2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% דימתיל סולפוקסיד</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>לחצן מצוקה 10-40%, 40% דימתיל סולפוקסיד</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40% מתאמפטמין, לחצן מצוקה 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, פח 10-40%, 40% דימתיל סולפוקסיד</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>לחצן מצוקה 10-30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה4 + DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>לחצן מצוקה 10-30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>לחצן מצוקה 30-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה6 + DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>לחצן מצוקה 30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%, 10-40% דימתיל סולפוקסיד</td>
		</tr>
<tr>
<td>הרה7 + DNA</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>לחצן מצוקה 10%</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1- ההמונים ניסיוני ומחושב וערכים מיליגרם של הרה-נורא, מתחמי משנה שלה שנוצר טופס בפתרון הפרעה מחקרים.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

כיום ספקטרומטריית מסה ממלאת תפקיד חשוב בביולוגיה מבנית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על מקרומולקולים ביולוגיים חשובים במצבם הטבעי, במיוחד חלבונים ותסביך חלבונים. ספקטרומטריית מסה מקומית ישימה באופן נרחב למגוון מכלילים ביומולקולריים כולל מערכות מולטיפרוטאין וחומצת גרעין.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ורגישה מאוד. זה יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגניים, לאפשר לנתח חלבונים מרובים במצב אוליגומרי בו זמנית. מדגים את ההליך יהיה אנדי לאו, דוקטורנט בקבוצה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, הכן את נימי הבית עבור nanoelectrospray כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן מדגם ללא ליגנד כפקד עבור כל ריצה כמו חילופי מאגר כל לתוך אצטט אמוניום. לאחר מכן, בחר את מצבי TOF של רגישות, רכישת יון חיובית וניידות.לאחר מכן הפעל את גזי המלכודת, ה- API וה- IMS. להפרדת הודעות מיידיות השתמש בנקודות ההתחלה של החנקן והארגון המוצגות כאן והתאם לפי הצורך. הגדר טווח רכישה מתאים של m/z.עבור חלבון לא ידוע, שלבי המיטוב הראשוניים צריכים להשתמש במגוון רחב. הכנס את נימי מצופה זהב לתוך מחזיק נימי. לאחר מכן לטעון בין שניים לשלושה microliters של פתרון חלבון מורכב של עניין לתוך נימי.הדק בעדינות את נימי והצב אותו על שלב מקור האלקטרוספריי. החלק את השלב למקומו כדי להתחיל להשיג נתונים. החל לחץ גז ננו-זרימה נמוך עד טיפה נוצרת בקצה נימי.להזיז את נימי ביחס קונוס לפקח על זרם היון כדי להשיג זרם יון יציב. יש למרוח מתח נימי בטווח שבין 0.9 ל-1.6 קילו-וולט. לאחר מכן הגדר את חרוט הדגימה, היסט המקור, טמפרטורת המקור וזרימת גז הקונוס כמפורט בפרוטוקול הטקסט.כדי לרכוש ספקטרום מסה פתור היטב והעברת יון מוגדלת, התאם את הפרמטרים של MS ונטר את השינוי שנוצר בספקטרום. הגדר את אנרגיית התנגשות המלכודת לנקודת התחלה ראשונית בין 10 ל -50 וולט. אם קיזוזי המתח אינם מספיקים, התאימו את אנרגיות התנגשות המלכודת.הגדר את המלכודת באמצעות המתח שלה לנקודת התחלה ראשונית בין 20 ל 45 וולט. לשפר את השממה על ידי אופטימיזציה של מתח זה. לאחר מכן, מטב את מהירות הגל ואת גובה הגל כפי שמתואר בטקסט כדי להשיג את הפרדת הניידות הטובה ביותר.במחקרים הקשורים הרה ונורה להשתמש במהירות גל של 40 מטר לשנייה וגובה הגל בין 550 ל 650 וולט. לניתוח קשירה DNA, מערבבים את החלבון וה- DNA ביחס תבוני המאפשר היווצרות מורכבת של DNA חלבון. הוסף כמויות הולכות וגדלות של כל אחד מהאפשרויות הבאות, 5'O-3-thio-triphosphate, מלח טטרליתיום או ADP.באמצעות תוכנה מתאימה למדוד את ההמונים של מינים שנוצרו ולזהות את קשירה ligand, כגון ATP ו ADP מחייב מצבים אוליגומריים. לאחר מכן השתמשו במפרטורות היונים שנצפו בספקטרום ESI MS הגולמי כדי לכמת את השפע היחסי המתאים של מינים. לאחר אופטימיזציה של תנאי המכשיר להעברה יציבה, הפחת את אנרגיית ההתנגשות ואת חרוט הדגימה נמוך ככל האפשר, תוך שמירה על איכות ספקטרום טובה.השתמש במהירות הגל הממוטבת ובגובה הגל שנקבעו בעבר כדי להשיג הודעות מיידיות MS. למדוד את זמן סחף היונים בשלוש מהויות גל שונות תוך שמירה על אותו גובה גל. כדי לקבוע את יון החלבון CCS למדוד ארבעה כיול חלבון, שניים עם המסה מעל החלבון תחת חקירה ושניים עם המסה למטה, באמצעות אותם תנאי מכשור. ראשית, להכין את דגימות החלבון ואת המאגר להחליף אותם אמוניום אצטט כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.הוסף ממס במרווחים של 10%עד שתגיע לסכום הרצוי. דגירה על קרח במשך שעה אחת. לאחר מכן, רכוש ספקטרום IM-MS עבור כל מדגם.באמצעות תוכנת SUMMIT, הקצו תת-קומפלקסים של חלבונים וייצרו רשתות אינטראקציה עם חלבונים. לחלופין, ליצור באופן ידני רשימה של מסות תיאורטיות עבור המינים הצפויים. כדי להתחיל לחקור את היציבות המורכבת של החלבון, הקליטו נתוני IM-MS תוך הגדלת מתח האצת המלכודת מ-10 וולט ל-200 וולט, שייפתחו בהדרגה לשלב החלבון והגז.נתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה והפיק התוויות מתפתחות דו-ממדיות על-ידי ערימת הפצות CCS מנורמלות בעוצמה בכל מתח מאיץ עבור כל מצב טעינה. תוצאות MS מקוריות חושפות את המצב האוליגומרי, ההרכב והטופולוגיה של מתחם HerA ו- NurA. כמו אינטראקציות noncovalent נשמרים בשלב הגז, MS יליד של ATP גמא S ו ADP titration ניסויים, משמשים כדי לקבוע את מחייב נוקלאוטידים חכם זוג ב HerA ו NurA.ספקטרום מסה של מצבים אוליגומריים HerA לגלות כי הגדלת ריכוז ATP גמא S מגביר את העוצמה היחסית של HerA הקסמרית. ערכי ה- CCS הניסיוניים עבור החלבונים והתסביךים שלהם נגזרים לאחר מכן מניסויי IM-MS. ערכים אלה נתפסים יש הסכמה טובה עם מדידות תיאורטיות מקריסטלוגרפיה רנטגן, אשר מאמת באמצעות ערכי CCS לבניית מודלים ברזולוציה נמוכה של הרכבת חלבון.ניתוח CIU ו- KEcom מגלה כי הדנ"א קשור HerA-NurA הוא יציב יותר מאשר קומפלקס ללא DNA. ניתוח CIU MS והמדינות המחייבות ATP בהתאמה מראים כי ארבעת המצב המאוגד של ATP גמא S מפחיתים יציבות מורכבת בשלב הגז. עם זאת, ששת המדינות המאוגדות ATP gamma S שבהן כל האתרים מאוכלסים, נתפסות כיציבות ביותר.מדידות מדויקות של המסה המולקולרית של קומפלקס שלם מספקות תובנה חשובה על אפיון ביומולקולרי. אנחנו יכולים לקבל מידע על מסלולי הרכבה מורכבים, אוליגומריזציה של חלבונים וקשירת ליגנד. שילוב כל המידע הזה מאפשר ליצור מודלים מפורטים של מכלים ביולוגיים תפקודיים.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Chemistry

Biology

Molecular Biology

Unit 1

Fundamentals

Protein Function

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

השתפר בג&#39;ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

חקר complexation של מרקורי (II) עם Dicysteinyl Tetrapeptides ידי Ionization electrospray ספקטרומטריית המסה

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

תיוג קוולנטי עם דיתילפירוקרבונט לחקר מבנה חלבון מסדר גבוה יותר על ידי ספקטרומטריית מסה

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...