Name: analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Karl-Peter Hopfner og Robert Thomas Byrne vennlige gi HerA og HerA-NurA protein prøver og deres hjelp med eksperimentell design. Vi takker også Dr. Eamonn Reading for sin gjennomgang av manuskriptet. Vi erkjenner takknemlig finansiering kroppen: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] og Royal Society [RG150216 til A.P.].

1. sample forberedelse til innfødte MS av Protein og Protein-Ligand komplekser
Merk: For å få en forståelse av molekylære grunnlaget for et protein kompleks og ligand binding med innfødt MS, egnet eksempel forberedelser er nøkkelen. Målet med denne delen er å markere viktige eksempel forberedelsene før MS analyse ved hjelp av HerA-NurA komplekset som binder DNA og nukleotider som et eksempel.
<ol><li>Forberede 20 µL dele konsentrert renset protein (vanligvis 15-30 µM) i en 1,5 mL tube.</li>
	<li>
For ATP eller ADP bindende analyse Merk: Legge til økende konsentrasjoner av ikke-hydrolyzable ATP analoge adenosine 5 '-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium salt (ATP-γ-S) eller 5 '-adenosindifosfat (ADP). Non-hydrolyzable ATP derivater generere en stabil komplekse ville aktivere ATP-bundet protein overføres. Andre ikke-hydrolysable ATP analoger som kan testes inkluderer AMP-PNP og ATP-γ-S-Mg2 +.<ol>
<li>HerA-NurA studier, blande 5 µM renset protein med ATP-γ-S og ADP i konsentrasjonene varierer fra 0-1 mM.</li>
		<li>For å fange samtidige ATP-γ-S og ADP bindende, Legg begge nukleotider i de samme eller ulike konsentrasjonene.</li>
		<li>Legg 2 mM MgCl2 og ruge ved 25 ° C i en tørr bad inkubator 1t. Merk: Analyse av nukleotid bindingen bruker het nESI innfødte MS kan resultere i artefactual bindende på høye konsentrasjoner, derfor uspesifisert bindende må tas i kontoen29. For å undersøke ikke-spesifikk binding, legger du en høyere konsentrasjon av nukleotider mellom 2-5 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
For DNA bindende analyse
	<ol>
<li>Bland protein og DNA i molar forholdet som gir protein-DNA komplekse formasjon. HerA og HerA-NurA, blande 5 µM renset protein med DNA på en 1:1 ratio.</li>
		<li>Inkuber HerA-NurA eller HerA - DNA blanding i 30 min ved 25 ° C i en tørr bad inkubator til den når likevekt. Varighet og temperatur med inkubering kan variere avhengig av protein under etterforskning.</li>
		<li>Buffer exchange protein prøver å MS kompatibel buffere. Vanligvis brukes vandig ammonium acetate løsning mellom 5 mM-1 M ved pH 7-8. Andre MS kompatibel buffere inkluderer ethylenediammonium diacetate (EDDA) og Triethylammonium acetate (TEAA)30. HerA-NurA studier, bruke 200 mM ammonium acetate pH 7. Merk: Det finnes flere metoder for bufferen exchange før analyse av MS som benytter en spinn konsentrator eller kromatografi kolonner. Native MS er stort sett begrenset av kvaliteten på prøven som buffere og addukter brukt under renselsen. Derfor er det nødvendig å utføre tilstrekkelig avsalte for å få løst topper.</li>
		<li>For HerA-NurA ligand binding studier, bufferen exchange prøver 6 - 8 ganger i 200 mM ammonium acetate bruker en konsentrator. Selv om denne metoden er mer tidkrevende, det sikrer at løst topper er oppnådd og gir nøyaktig masse bestemmelse av ATP/ADP bundet arter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. innfødt MS oppkjøp og analyse for å undersøke Protein komplekser og Protein-Ligand komplekser
Merk: MS forholdene skal være optimalisert for å oppnå svært løst toppene for å aktivere nøyaktig masse målinger. Denne delen detaljer optimalisert parametere på en Q-ToF masse spectrometer med en 32 k øvre grense m/z quadrupole.
<ol><li>Forberede in-house kapillærene nano-electrospray og utføre instrument masse kalibrering for nøyaktig masse målinger som beskrevet av Kirschenbaum et al. 1.</li>
	<li>Velg følsomhet, positivt ion ervervelse og mobilitet TOF moduser.</li>
	<li>Slå på overlapping, API og IMS gasser. For IM separasjon, bruke nitrogen (60 mL/min) og argon (8.4 mL/min for regionen trap) som utgangspunkt og deretter justere.</li>
	<li>Angi en passende m/z oppkjøpet. En ukjent protein, første optimering skritt bør bruke en rekke som 500-32 000 m/z.</li>
	<li>Legg 2-3 µL av protein kompleks løsningen analyseres i en gull belagt kapillære og sett den inn kapillær innehaver.</li>
	<li>Forsiktig skru av kapillær og sted av kapillær electrospray kilde Stadium og skyv scenen på plass å starte henter.</li>
	<li>Bruke nano-monsunsirkulasjon gasstrykket (0,00 0.05 Bar) til en dråpe dannes på spissen av av kapillær. Nano-flyt press kan deretter slippes til spray opprettholdes.</li>
	<li>Justere av kapillær forhold til membran av bevegelse av kapillær i x, y, z posisjoner og overvåke ion strøm for å oppnå en stabil ion gjeldende. Bruke en kapillær spenning mellom 0,9-1.6 kV.</li>
	<li>Angi prøvetaking membran (50-120 V), kilde forskyvning (60.0), kilde temperatur (25 ° C) og kjegle gasstrømmen (0.0 L/h). Dette foreslo innledende forhold kan justeres.</li>
	<li>Kjøpe et godt løst masse spekter og maksimere ion overføring, justere MS parametere og overvåke den resulterende forandringen i til spectra. Disse omfatter justering gasstrømmen i Trap (2-8 mL/min), han celle (180 mL/min) og IMS-cellen (90 mL/min) å oppnå beste separasjon på maksimal overføringshastighet.</li>
	<li>Juster felle kollisjon energiene hvis spenning forskyvninger er utilstrekkelig. Et optimalt utgangspunkt er mellom 10-50 V. Merk: Øker felle energi kan fjerne ikke-covalently bundet addukter. Men ta vare for å unngå kollisjon indusert dissosiasjon og unfolding av protein-ligand komplekset. Utføre ion mobilitet mål å sjekk hvis apparatet forhold beholde proteinet i native foldet staten (trinn 3).</li>
	<li>Forbedre desolvation ved å optimalisere felle bias spenning. Et optimalt utgangspunkt er 20-45 V.</li>
	<li>Optimalisere bølge hastighet og bølgehøyde å oppnå beste mobilitet separasjon. En detaljert forklaring og protokollen kan grunnleggeher over31. HerA-NurA studiene, bruke bølge hastighet 40 (m/s) og bølgehøyde på 550-650 (V).</li>
	<li>Bruke alle andre parametere som instrument standardverdier.</li>
	<li>Forberede en ligand-gratis prøve analyse som en kontroll for hvert løp (figur 1). Ligand binding eksperimenter, utføre minst tre uavhengige målinger.</li>
	<li>Bruk programmet Masslynx til å måle massene av genererte arter og identifisere den ligand bindingen, som ATP og ADP bindende og oligomeric stater (figur 2 og 3). Andre programvare tilgjengelig inkluderer UniDec32, PULSAR33 og Amphitrite34.</li>
	<li>For å kvantifisere den relative overfloden av arter, bruke tilsvarende ion intensiteten i de rå ESI-MS spectra (for eksempel ligand bundet, ulike oligomers, etc.). Du kan også utføre kvantifisering bruker spesialisert programvare som UniDec og Massign35 (figur 1 og 3 ).</li>
</ol>3. å anskaffe og analysere IM-MS
Merk: IM-MS skiller ioner i gassform basert på størrelse (masse), form og kostnad. Hver funksjon løst i m/z spekteret er forbundet med en drift tid distribusjon. IM-MS måler drift-tidspunktet for et ion som kan brukes til å beregne tverrsnittet kollisjon (CCS). Drift verdier målt av IM-MS data ervervet en drift-rør kan være lineært korrelert CCS verdier36. Reiser bølge IM-MS (TWIMS) mål, krever beregne CCS verdiene en kalibreringskurven fra protein standarder med kjente CCS verdier37. Kompakt strukturer reise raskere enn utvidet eller langstrakt strukturer grunn redusert interaksjon med buffer gass i mobilitet celle38. IM-MS kan derfor brukes til å oppdage hvis den opprinnelige brettet strukturen har blitt beholdt på gass fase39,40. Denne delen beskriver hvordan du måle IM-MS og beregne CCS protein bruker TWIMS.
<ol><li>Etter optimalisere instrument betingelser for stabile overføringer (trinn 2), redusere collisional energi og prøvetaking kjegle så lavt som mulig samtidig beholde gode spectra kvalitet.</li>
	<li>Bruke optimalisert bølge hastighet og bølgehøyde for å erverve IM-MS (trinn 2).</li>
	<li>Måle den ion drift tid med IM-MS på tre ulike bølge hastigheter (f.eks 550, 600 og 650 m/s), samtidig som den samme bølgehøyde (f.eks 40 V).</li>
	<li>Å bestemme protein ioner CCS, måle protein calibrants instrument oppstiller brukt for protein under etterforskning. Optimal drift-tid kalibrering krever måling av proteiner med kjente CCS.<ol>
<li>Velg fire calibrants, to med en masse ovenfor og to med en masse som protein under etterforskning37. Viktigst, kontroller at bølgehøyde og bølge hastighet er de samme som registrert for protein under etterforskning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregne CCS manuelt41 eller bruke en spesialisert programvare som PULSAR33 og Amphitrite34 (figur 5).</li>
	<li>For å sjekke om protein er native-lignende i gassform, sammenligne eksperimentelle CCS til teoretisk CCS Hentet fra høy oppløsning strukturer. HerA-NurA, beregne teoretisk CCS med metoden projeksjon tilnærming (PA) brukt i MOBCAL42. Andre metoder inkluderer banen metoden (TM)42 og nøyaktig vanskelig sfære spredning (EHS)43.</li>
</ol>4. i-løsning avbrudd av Protein komplekser for Native MS og IM-MS ledet proteinstrukturer
Merk: Protein sub komplekser kan i noen tilfeller identifiseres fra den samme løsningen som intakt komplekset. Men kan ytterligere strukturinformasjon som Inter delenhet komplekse samlingen oppnås avbryter protein interaksjoner i løsningen til skjemaet sub komplekser. Dette kan oppnås på flere måter som tillegg av organisk løsemiddel, øke ioniske styrke eller manipulere pH. For å få innsikt i HerA-NurA komplekse delenhet tilkobling og komplekse samlingen, ble sub komplekser generert i løsningen ved å legge løsemidler som forurolige delenhet interaksjoner.
<ol><li>Forberede protein utvalg og buffer utveksling i ammonium acetate som beskrevet i trinn 1.</li>
	<li>Legge til 10-40% løsemiddel i trinn på 10%. Løsemidler brukes vanligvis er metanol (MeOH), dimethyl sulfoxide (DMSO) eller acetonitrile (ACN). Merk: Dette kan utføres i en polypropylen microcentrifuge tube.</li>
	<li>Inkuber blandingen på is 1t.</li>
	<li>Få en IM-MS spektrum for hver tilstand (trinn 2 og 3) (Figur 4).</li>
	<li>Bruke SUMMIT programvare44 tilordne protein sub komplekser og generere protein samhandling nettverk. Alternativt, manuelt generere en liste over teoretiske massene av forventet arter.</li>
	<li>For å sikre subcomplexes brettes, beregner eksperimentelle CCS verdiene for sub komplekser og sammenligne teoretisk CCS som beskrevet i trinn 3 (tabell 1, figur 5 og figur 6).</li>
</ol>5. undersøker Protein kompleks stabilitet med kollisjon indusert Unfolding (CIU)
Merk: CIU kan brukes sonde strukturelle stabiliteten av proteiner og deres komplekser på ligand binding. Spesialist programvarepakker som PULSAR33, Amphitrite34 og CIU suite9 kan deretter brukes til å modellere gassfase-unfolding av protein undersøkes med og uten ligand. Som et eksempel, denne delen beskriver fremgangsmåten for overvåking gassfase-Utfolding baner og undersøke stabiliserende effekten av DNA og ATP bindende for HerA-NurA komplekset.
<ol><li>IM-MS postdataene mens økende felle akselerasjon spenningen fra 10 V til 200 V i 2-10 V trinn å gradvis utfolde protein i gassform. Merk: Innspilling mindre intervaller resultater i flere datafiler til prosessen, men dette gir mer løst unfolding tomten, noe som er viktig for å analysere overgangspunkt mellom foldet inn/ute arter.</li>
	<li>Analysere dataene anskaffes ved hjelp av PULSAR33, Amphitrite34 eller CIU suite9 og generere todimensjonal unfolding tomter i enheter av CCS som en funksjon av akselererende spenning (trinn 3). For hver anklagen tilstanden opprettes dette ved stabling intensitet-normalisert CCS distribusjonene på hver akselererende spenning (figur 7 A-Bi).</li>
	<li>Generere en teoretisk unfolding plott ved hjelp av en av programvarepakker. Dataene skal monteres en etterfølgende modellen. Dette gjør det mulig å kvantifisere collisional energi som utspiller seg overganger skjer og bestemme stabiliteten av proteiner med og uten bundet ligander33. En unfolding overgang er når en arter overganger fra én tilstand (basert på eksperimentell CCS verdiene) til en annen tilstand med en større CCS.</li>
	<li>For å quantitate overganger, beregne overgangsreglene midpoint(s) mellom algoritmer og programvare som PULSAR33. Dette rapporteres vanligvis som CV50, som er kollisjon (trap) spenning verdien som 50% av en bestemt tilstand er oppbrukt.</li>
	<li>Bruke CV50 verdien, beregne den totale indre energien av en ion bruker center-av-masse kollisjon energi (KECOM)45. KECOM er definert av den totale indre energien tilgjengelig for unfolding overgangen til et ion og beregnes fra kinetisk energi og massene av kollisjon (protein ion og nøytrale gass) som beskrevet i ligningen (1)10 KEcom (eV) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57966/57966eq1.jpg"> (formel 1). Hvor Z er ion kostnader, MN er massen av nøytrale gassen og MION er massen av protein ion. Merk: Dette er fordi CIU proteiner er gratis dependent46, 47. Det anbefales å utføre KECOM analysen til flere anklagen tilstanden ( figur 7Aii).</li>
</ol>6. modellering prosedyrer for differensial molekylære dynamikk simuleringer i Integrative MS
Merk: Bruker modeller av protein underenheter eller komplekser som fra crystal strukturer, kan differensial MD simuleringer (protein kompleks med og uten ligand) brukes til å fastslå effekten av for eksempel ligand tilstedeværelse på protein strukturen og dynamikken. Denne delen viser en arbeidsflyt og verktøyene som trengs for modellering prosedyrer nødvendig å sette opp differensial molekylære dynamikk simuleringer.
<ol><li>Identifisere underenheter som utgjør komplekset (Figur 8A, i trinn 2 og 3). Kilde eksisterende modeller av underenheter, f.eks krystall strukturer fra RCSB databanken (https://www.rcsb.org). UniProt oppføringen av protein inneholder en liste over vet krystallografisk/NMR strukturer (http://www.uniprot.org). Hvis dette ikke er tilgjengelig, kan teoretisk sekvensen være innspill til BLAST å identifisere egnet maler for homologi modellering (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).</li>
	<li>Samle komplekset i riktig topologi (Figur 8A-ii). Dette kan gjøres gjennom ulike metoder. De personlige underenheter kan monteres inn i tilgjengelig elektronmikroskop kart på EMDB å montere intakt komplekset (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). En tutorial for å feste pdb i EM kart bruker Molecular Dynamics fleksibel montering (MDFF) kan bli funnet her: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.</li>
	<li>Identifisere mangler områder av komplekset (Figur 8A-iii). Utføre flere sekvens justering (MSA) mellom PDB og teoretisk sekvens å identifisere rester som kan være unfitted i crystal strukturer, eller noen mutasjoner arvet fra krystallografisk eksperimenter. MSA utføres med webservere som T-kaffe (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular).</li>
	<li>Generere mangler rester via homologi modellering (Figur 8A-iv). Mangler rester av proteinet kan bygges med programmet MODELLER (https://salilab.org/modeller/). MODELLER kan generere et ensemble av n modeller i forskjellige Spartments konfigurasjoner. Gode modeller kan identifiseres basert på poengsummen deres diskret optimalisert Protein energi (dop). En omfattende opplæringen tilbys på webområdet programvare (https://salilab.org/modeller/tutorial/).</li>
	<li>Utføre differensial molekylære dynamikk (MD) simuleringer av proteinet (Figur 8B) for å identifisere områder av proteiner som svarer til en bestemt miljøproblemene, f.eks tilstedeværelsen av en ligand. I slike simuleringer, atferdsmessige parametere fra simulering A (bare protein) som fungerer som en referanse, trekkes fra simulering B (protein + ligand). Differensial root-betyr-torget svingninger (RMSF) beregnes mellom simuleringer A og B kan informere på områder av proteinet som øker eller reduserer fleksibilitet på en ligand avhengige måte.<ol>
<li>Utføre MD simuleringer og nedstrøms analyse ved hjelp av GROMACS (http://www.gromacs.org). En tutorial kan finnes på: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Til elimate modell bias, skal strukturen i ligand binding anlegget genereres først. Protein blir deretter kopiert fra dette uten ligand, å gi en protein modell lik ligand binding komplekset.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

MS spiller en stadig viktigere rolle i karakteriserer støkiometri, samhandling og delenhet arkitektur av protein komplekser. IM-MS data kan brukes til å definere topologisk arrangementer av underenheter innen multicomponent komplekser. Sammenlignet med andre eksisterende strukturell biologi metoder, har MS flere fordeler. Native MS er en rask og svært følsom teknikk og kan brukes å undersøke heterogene protein prøver. Når kombinert med i-løsning avbrudd eksperimenter, kan dissosiasjon veier av protein samlinger overvåkes. Crystal strukturer eller homologi modeller, informasjonen som tilbys av strukturelle MS tilbyr et verktøy for å undersøke protein-ligand interaksjoner og gir nær-innfødt modeller og montering trasé11.
Her beskriver vi de nødvendige eksperimentelle prosedyrene for å analysere støkiometri og sammensetningen av protein-ligand samhandling, med én eller flere ligander, med integrerende MS. Dette inkluderer MS utvalg forberedelse, datainnsamling, analyse og integrering av MS data ved hjelp av beregningsorientert verktøy. Dette gjør brukte vi DNA-resection HerA-NurA hetero-oligomeric protein kompleks, bundet til tre ligander (DNA, ATP og ADP), som vår modell. Protokoll viser bruken av tilgjengelig programvare for å hjelpe analyse og presentasjon.
Anskaffe høykvalitets spectra er viktig for ligand binding analyse, derfor nøye utvalg forberedelsene er kritisk, inkludert protein rensing, ligand titrering og buffer exchange. En begrensning av het nESI innfødte MS når studere ligand binding er uspesifisert bindende. Non-spesifikke bindingen skjer under dråpe desolvation gjennom hele electrospray prosessen. Dette øker ligand konsentrasjonen og derfor endrer protein/Ligand forholdet29. Binding av nukleotider resulterer i en relativt liten masse forskjell mellom Oslo og nukleotid-bundet protein som ikke endrer ionisering effektivitet50,51.
Vi brukte Synapt G2-Si MS systemet for vårt arbeid, men protokollene gjelder for ulike undersøkelser av andre protein-ligand komplekser bruker andre tilsvarede nano-electrospray masse spektrometre. Integrerende strukturelle MS spiller stadig en viktig rolle i å håndtere biologiske problemer av større kompleksitet. Arbeidsflyt og teknikker som er beskrevet her er velegnet for å forstå de strukturelle konsekvensene og bygge mekanismer av protein kompleks og protein-ligand formasjon som er vanskelig å studere med konvensjonelle strukturelle teknikker .

Opprinnelige masse spectrometric analyse av intakt proteiner og deres komplekser er utført med electrospray og nano-electrospray ionization (het nESI), som bevare proteinfolding og ikke-kovalente interaksjoner under ionisering prosessen1, 2. I native MS, proteiner og deres komplekser beholdes i en nær-innfødt stat i gassfase-3,4. Native MS oppdager flere ladet protein ioner, som skilles etter masse deres å lade forholdet (m/z) slik at massen av protein- eller protein-ligand komplekse skal beregnes. Denne informasjonen kan fastsettelse av en intakt protein støkiometri, delenhet komposisjon, ligand binding og samhandling, nettverk,3,,4,,5,,6. Native MS har flere fordeler sammenlignet med andre teknikker slik Røntgenkrystallografi og kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi5. Først er innfødt MS en rask og svært følsom teknikk, krever bare noen microliters (2-3 µL) eksempel på relativt lav siste komplekse konsentrasjoner i den høye nM lav µM utvalg6. Dernest kan innfødt MS brukes til å forhøre heterogene protein prøver gjør det mulig å analysere flere proteiner og oligomeric USA samtidig. For det tredje, krever ikke innfødt MS protein prøver endres før analyse av kjemiske crosslinking eller protein merking. Disse fordelene har gjort strukturelle MS et kraftig verktøy for strukturelle etterforskningen av protein komplekser.
Native MS kan kombineres med ion mobilitet (IM), en teknikk som måler tiden et protein ion tar reise gjennom et elektrisk felt, slik at det collisional tverrsnittet (CCS) skal fastsettes. CCS gir lav strukturinformasjon, som muliggjør topologi og conformational heterogenitet informasjon proteiner innhentes. Videre tillater undersøkelse av protein strukturelle modeller generert av computational tilnærminger.
Protein gassfase-stabilitet kan undersøkes med kollisjon indusert unfolding (CIU) målt av IM-MS. Under CIU prosessen, er protein ioner akselerert og aktivert via økt akselererende kollisjoner med en inert buffer gass i en masse spectrometer7,8,9. Denne collisional aktiveringsprosessen fører protein til delvis utfolder seg, noe som resulterer i en økning i CCS. Denne endringen i CCS og energien som kreves for å utfolde protein kan være målt IM-MS. med denne tilnærmingen, effekten av ligand binding på protein stabilitet kan være målt10. Subcomplexes kan genereres i løsning ved hjelp av i-løsning avbrudd metoder som tillegg av organiske løsemidler for å overvåke native-lignende topologier av protein komplekser. Avbrudd av protein komplekser er hovedsakelig på grunn av avbrudd i intra ikke-kovalente interaksjoner. Sub komplekser opprettholde native-lignende topologier og på MS gjenkjenning, avslører informasjon om Inter delenhet tilkobling.
Integrerende tilnærminger i strukturell biologi kombinere ulike metoder for å studere strukturen og dynamikken i proteiner og deres komplekser3,4,5,6. Native MS og IM-MS har blitt brukt til å avdekke molekylær detaljer om utfordrende biologiske systemer. Det har vært flere eksempler på programmer inkludert studiet av protein montering trasé11,12,13,14, studere protein-protein samhandling nettverk15 , 16 , 17og membran proteiner6,18,19,20,21protein-ligand interaksjoner som nukleinsyrer22,23 ,24.
Native MS har imidlertid også sine begrensninger. Native MS målinger er ofte utført i flyktige buffere som vandig ammonium acetate der noen proteiner ikke beholde sine foldet opprinnelig tilstand3,25. Likevel har nylig arbeid vist at denne begrensningen kan overvinnes ved optimalisering av sprøyting nål tuppens diameter (0,5 mm tips) slik at protein og protein kompleks ioner kan dannes direkte fra permanente buffere med høy-ioniske-styrke som bedre etterligne den fysiologiske miljø26. I tillegg bruker innfødt MS electrospray ionisere og overføre ikke-kovalente samlinger fra løsning til gassform; Derfor kan den relative overfloden av oppdaget komplekser ikke helt representere som i løsning5,27. Videre i forhold til i løsningen, gass fase hydrofobe samhandlingene bli svakere og elektrostatiske interaksjoner bli sterkere og dermed foretrakk3,28.
I denne artikkelen gir vi protokoller, dataanalyse og tolkning for protein identifikasjon og ligand binding bruke native MS, IM-MS, CIU, i-løsning avbrudd, og modellering. DNA reparasjon komplekset, HerA-NurA, brukes som et modellsystem. DNA double-strandet bryter (DSBs) er en av de mest cytotoksiske og skadelige formene for DNA skade, genetisk ustabilitet og en eventuell utvikling av kreft hos mennesker. Homologe rekombinasjon er reparasjon mekanismen som eradicates DSBs, en prosess som er organisert av ATP avhengige helicase-nuclease komplekset, HerA-NurA22.
Kombinere innfødt MS og IM-MULTIPLE Sclerosis med funksjonell analyser og modellering tillatt etterforskningen av: i) rollen Nura i samlingen, konformasjon og stabilitet av komplekset, ii) samspillet mellom dsDNA og komplekset og dens innflytelse på samlet stabilitet i komplekset og iii) støkiometri og virkningen av ATP bindende montering22. Samlet dette arbeidet førte til en bedre forståelse av molekylære grunnlaget for HerA-NurA komplekset ved å koble protein kompleks conformational endringer og stabilitet med nukleotid binding. Denne protokollen er generiske for noen protein complex(es) som samhandler med en eller flere ligand(s).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">119120-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">20398-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ammonium acetate solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td style="width:71px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">7326204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vivaspin concentrator</td>
			<td style="width:71px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">Z614041-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Water TraceSelect</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">300060</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry

Proteiner er en viktig biologiske makromolekyler spiller mange viktige roller i cellulære funksjoner inkludert genuttrykk, utløse metabolske reaksjoner, DNA-reparasjon og replikering. Derfor en grundig forståelse av disse prosessene gir viktig informasjon om hvordan celler funksjon. Integrerende strukturelle MS metoder tilbyr strukturelle og dynamiske informasjon om protein kompleks sammenstilling, komplekse tilkobling, delenhet støkiometri, protein oligomerization og ligand binding. Nylige fremskritt innen integrerende strukturelle MS har tillatt for karakterisering av utfordrende biologiske systemer inkludert store DNA bindende proteiner og membran proteiner. Denne protokollen beskriver hvordan å integrere ulike MS data som opprinnelig MS og ion mobilitet-massespektrometri (IM-MS) med molekylære dynamikk simuleringer å få innsikt i en helicase-nuclease DNA reparasjon protein kompleks. Den resulterende tilnærmingen gir et rammeverk for detaljerte studier av ligand binding til andre protein komplekser involvert i viktige biologiske prosesser.

Native MS resultatene viste oligomeric staten, komposisjon og topologi av HerA-NurA komplekset (figur 1). Som ikke-kovalente interaksjoner er bevart i gassform-, innfødt MS ATP-γ-S og ADP titrations eksperimenter bestemt parvis nukleotid bindingen til HerA-NurA (figur 2), og det øker ATP-γ-S konsentrasjonen øker relative intensiteten av hexameric HerA (Figur 3). Strukturell informasjon angående delenhet interaksjoner ble innhentet fra-løsning avbrudd etterfulgt av innfødte MS og ble enighet og teoretisk massene (Figur 4 og tabell 1).
Eksperimentell CCS verdiene av proteiner og deres komplekser ble avledet fra IM-MS eksperimenter (figur 5). Disse verdiene er rotasjons gjennomsnitt gassfase-cross-sectional beregninger av molekylære figuren, og beskriver dimensjonale delstaten protein. CCS verdier sammenlignes teoretisk mål fra Røntgenkrystallografi og en god avtale angir at den opprinnelige figuren i beholdt i gassfase- (tabell 1). Dette validerer bruker CCS verdier for bygging av lav modeller av protein montering48.
Eksperimentell CCSs kan beregnes for hver avgift staten ion. En native-lignende protein conformer kan gi opphav å lade staten ioner med lignende CCS-verdier. Men økt høyere avgift staten ionene coulombic repulsions som kan føre til protein gassfase-utspiller seg og større CCS verdier sammenlignet med de teoretiske CCSs. CCS verdien av laveste anklagen tilstanden ioner er derfor vanligvis brukt49. HerA-NurA, i-løsning avbrudd eksperimenter på HerA og HerA-NurA med og uten DNA bedt om generering av en samling veien starter med monomerer deretter danner den hele hexameric HerA (HerA6)-dimeric NurA (NurA2) kompleks med DNA (figur 6).
Forskjeller i CIU unfolding tomter mellom apo (ligand-ledig) og ligand bundet definere endringen i komplekse stabilitet på ligand binding. Et høyere CV50 eller KECOM verdi innebærer en mer stabilisert ion i gassform. CIU og KECOM analyse viste DNA-bundet HerA-NurA er mer stabil enn DNA-fri komplekset (figur 7Aii). Fra CIU-MS analyse i de respektive ATP-bindende landene, fire-ATP-γ-S bundet staten redusert komplekse stabilitet i gassform- og seks -ATP-γ-S bundet staten hvor er alle områder er opptatt var mest stabil (figur 7Bii). Native MS kan avsløre den diskrete nukleotid bindende statene HerA; men kan ikke det skille som HerA underenheter binder ATP og hvor denne bindingen skjer. Denne informasjonen kan være avledet fra eksplisitt løsemiddel MD simuleringer hexameric HerA og HerA-NurA etter oppsummerte arbeidsflyten (Figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Figur 1. Forhøre oligomeric staten, komposisjon og topologi av HerA-NurA ikke-kovalente komplekset. (A) mass spektra av HerA, HerA-NurA og HerA-NurA i nærvær av DNA (15,4 kDa 25 bp double-strandet DNA). HerA sub komplekset finnes både en praktiske og en heptamer. NurA dimer binder og en HerA praktiske imponerende oligomeric konvertering. DNA binder dannet HerA - NurA komplekset (resultater tilpasset fra Z. Ahdash et al., 201722). (B) relative intensiteter av identifiserte arter beregnes ved hjelp av UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Figur 2. Native ESI-MS avslører mekanismen av nukleotid binding til HerA-NurA. Masse spectra (A) HerA-NurA og (B) HerA-NurA-DNA med økende konsentrasjoner av (i) ATP-γ-S og (ii) ADP. Målt massene er i forhold til teoretisk massene og hvor mye ATP-γ-S eller ADP bundet bestemmes. Målt massene og antall bundne nukleotider vises til spectra. ATP-γ-S og ADP eksperimenter titrations parvis nukleotid bindingen HerA-NurA alene og i komplekset med DNA som indikerer en syklisk mekanisme (resultater tilpasset fra Z. Ahdash et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> Figur 3. Måle effekten av økende ATP-γ-S konsentrasjoner på HerA oligomeric staten. (A) mass spektra av HerA på økende konsentrasjoner av ATP-γ-S. (B) graf som viser relative intensiteten av ulike arter fra innfødte MS ved hjelp UniDec deconvolution programvare32. Som ATP-γ-S konsentrasjonen øker, øker også den relative intensiteten av hexameric HerA. Antall ATP-γ-S molekyler bundet vises til spectra (resultater tilpasset fra Z. Ahdash et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Figur 4. Masse spectra og sub komplekse dissosiasjon produkter av HerA (A) og (B) HerA-NurA (i) alene og i nærvær av (ii) DNA følgende-løsning avbrudd. I-løsning avbrudd eksperimenter ble utført med 10-40% av Acetonitrile, metanol (MeOH) eller dimethyl sulfoxide (DMSO) og resulterte i dannelsen av ulike subcomplexes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Figur 5. Ion mobilitet ankomst tid utdelinger vist på en CCS akse for komplekser og genererte sub komplekser. Ikon for hver sub komplekse relatere til de kommenterte på spectra i Figur 4. Eksperimentelle og beregnede massene og CCS verdier av sub komplekser er oppført i tabell 1 som viste en avtale mellom eksperimentelle og beregnede verdier (etter vurderer typisk usikkerheten i løsningen av reiser bølge ion mobilitet massespektrometri på ±5 - 8%37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Figur 6. Montering sti HerA-NurA komplekset generert fra-løsning avbrudd innfødt MS og IM-MS. farget sirkler indikerer der hver sub komplekset ble observert: native (grønn, før avbrudd), metanol (gul), DMSO (lilla) eller Acetonitrile (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Figur 7. Undersøker stabiliserende effekten av (A) DNA på HerA-NurA og (B) ATP binding til HerA-NurA-DNA. (i) gassfase CIU-MS plott og (ii) center-av-masse kollisjon energier (KEcom) beregning viser at at tilstedeværelsen av dsDNA stabiliserer HerA-NurA komplekset, og at seks ATP-γ-S bundet state er det mest stabile. Stabilisering for ulike kostnader stater vises. Tomter ble generert ved hjelp av PULSAR 33. Resultater fra (A) tilpasset fra Z. Ahdash et al., 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Figur 8. Arbeidsflyt for modellering prosedyrer differensial molekylære dynamikk simuleringer. (A) generering komplekset under etterforskning av bygge topologien fra eksisterende underenheter og ombygging mangler rester. (B) arbeidsflyt for kjøring molekylære dynamikk simuleringer på protein kompleks med og uten ligand. Molekylære dynamikk simuleringer er løp for protein bare som fungerer som en referanse og som blir trukket fra simulering av protein pluss ligand. Dette etterfølges av beregning differensial root-betyr-torget svingninger (RMSF) mellom simuleringene og å bestemme effekten av ligand binding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Komplekse / sub komplisert</td>
			<td>Teoretisk masse (kDa)</td>
			<td>Eksperimentell masse (kDa)</td>
			<td>Teoretisk CCS (Å2)</td>
			<td>Eksperimentell CCS (Å2) [kostnad]</td>
			<td>Tilstand HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20% ACN, 10-40% DMSO 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>10% ACN, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40% meth, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% kan 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6 + DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7 + DNA</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Eksperimentelle og beregnede massene generert CCS verdier av HerA-NurA og dens sub komplekser skjemaet i-løsning avbrudd studier.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Analysere Protein arkitekturer og Protein-Ligand komplekser av integrerende strukturelle massespektrometri

Massespektrometri (MS) har dukket opp som en viktig verktøy for å undersøke strukturen og dynamikken i macromolecular samlinger. Her integrere vi-baserte tilnærminger til å forhøre protein kompleks dannelse og ligand binding.

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

I dag spiller massespektrometri en viktig rolle i strukturell biologi. Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om viktige biologiske makromolekyler i hjemstaten, spesielt proteiner og proteinkomplekser. Native massespektrometri er allment aktuelt for en rekke biomolekylære samlinger, inkludert multiprotein og nukleinsyresystemer.Den største fordelen med denne teknikken er at den er rask og svært følsom. Den kan brukes til å avhøre heterogene proteinprøver, gjøre det mulig å analysere flere proteiner i oligomerisk tilstand samtidig. Å demonstrere prosedyren vil være Andy Lau, en ph.d.-student i gruppen min.For å starte denne prosedyren, forberede interne kapillærene for nanoelektrospray som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en ligand-fri prøve som en kontroll for hver kjøring som bufferutveksling hver til ammoniumacetat. Deretter velger du følsomhets-, positivionanskaffelse og tof-moduser for mobilitet.Deretter slår du på felle-, API- og IMS-gassene. For IM separasjon bruk nitrogen og argon startpunkter vist her og justere etter behov. Angi et passende m/z-anskaffelsesområde.For et ukjent protein bør de første optimaliseringstrinnene bruke et bredt spekter. Sett den gullbelagte kapillæren inn i en kapillærholder. Deretter laster du mellom to og tre mikroliter av den proteinkomplekse løsningen av interesse inn i kapillæren.Stram kapillæren forsiktig og plasser den på elektrospraykildestadiet. Skyv fasen på plass for å begynne å anskaffe data. Påfør et lavt nanostrømningsgasstrykk til et fall dannes på spissen av kapillæren.Flytt kapillæren med hensyn til kjeglen og overvåk idestrømmen for å oppnå en stabil idestrøm. Påfør en kapillærspenning i området mellom 0,9 og 1,6 kilovolt. Angi deretter prøvetakingskjegle, kildeforskyvning, kildetemperatur og kjeglegassstrøm som beskrevet i tekstprotokollen.For å skaffe seg et godt løst massespektrum og maksimert imasjonsoverføring, juster MS-parametrene og overvåk den resulterende endringen i spektra. Sett fellekollisjonsenergien til et startpunkt mellom 10 og 50 volt. Hvis spenningsforskyvningene ikke er tilstrekkelige, justerer du fellekollisjonsenergiene.Sett fellen via spenningen til et startpunkt mellom 20 og 45 volt. Forbedre oppløsningen ved å optimalisere denne spenningen. Etter dette optimaliserer du bølgehastigheten og bølgehøyden som beskrevet i teksten for å oppnå best mulig mobilitetsseparasjon.For studier som involverer HerA og NurA bruke en bølgehastighet på 40 meter per sekund og en bølgehøyde mellom 550 og 650 volt. For DNA-bindingsanalyse, bland proteinet og DNA med et molarforhold som muliggjør protein-DNA-kompleks dannelse. Tilsett økende mengder av følgende, 5'O-3-tio-trifosfat, tetralithium salt, eller ADP.Ved hjelp av riktig programvare måle massene av genererte arter og identifisere ligand binding, for eksempel ATP og ADP bindende og oligomeriske tilstander. Bruk deretter ideintensitetene observert i den rå ESI MS-spektraen for å kvantifisere den tilsvarende relative overfloden av arter. Etter å ha optimalisert instrumentforholdene for stabil overføring, reduser kollisjonsenergien og prøvetakingskjeglen så lavt som mulig, samtidig som den beholder god spektrakvalitet.Bruk den tidligere fastslåtte optimaliserte bølgehastigheten og bølgehøyden til å skaffe IM MS. Mål iddriftstiden ved tre forskjellige bølgehastigheter samtidig som den samme bølgehøyden opprettholdes. For å bestemme proteinion ccs måle fire protein kalibrants, to med massen over proteinet under undersøkelse og to med massen nedenfor, ved hjelp av de samme instrumentering forhold. Først forberede protein prøver og buffer utveksle dem til ammoniumacetat som beskrevet i tekstprotokollen.Legg til løsningsmiddel i 10% trinn til du når ønsket beløp. Inkuber på is i en time. Etter dette får du et IM-MS-spektrum for hvert utvalg.Bruk SUMMIT-programvaren til å tildele proteinunderkomplekser og generere proteininteraksjonsnettverk. Alternativt kan du manuelt generere en liste over teoretiske masser for de forventede artene. For å begynne å undersøke protein kompleks stabilitet, registrere IM-MS data samtidig øke felle akselerasjon spenning fra 10 volt til 200 volt, som gradvis vil utfolde seg til protein og gassfasen.Analyser dataene ved hjelp av riktig programvare og generer todimensjonale utfoldelsesplott ved å stable intensiteten normaliserte CCS-distribusjoner ved hver akselererende spenning for hver ladetilstand. Native MS resultater avslører oligomerisk tilstand, sammensetning, og topologi av HerA og NurA kompleks. Ettersom ikke-kovalente interaksjoner bevares i gassfasen, brukes innfødte MS av ATP gamma S- og ADP-titreringseksperimenter til å bestemme den parvise nukleotidbindingen i HerA og NurA.Massespektra av HerA oligomeriske tilstander avslører at å øke ATP gamma S konsentrasjonen øker den relative intensiteten av heksameriske HerA. De eksperimentelle CCS-verdiene for proteinene og deres komplekser er deretter avledet fra IM-MS-eksperimentene. Disse verdiene er sett å ha god enighet med teoretiske målinger fra røntgenkrystallografi, som validerer ved hjelp av CCS-verdier for å bygge lavoppløsningsmodeller av proteinmontering.CIU- og KEcom-analysen viser at DNA-bundet HerA-NurA er mer stabil enn det DNA-frie komplekset. CIU MS-analyse og de respektive ATP-bindingstilstandene viser at de fire ATP gamma S-bundne tilstanden reduserer kompleks stabilitet i gassfasen. Men de seks ATP gamma S bundet tilstand der alle områder er okkupert, er sett på som den mest stabile.Nøyaktige målinger av den molekylære massen av et intakt kompleks gir verdifull innsikt i biomolekylær karakterisering. Vi kan få informasjon om komplekse monteringsveier, protein oligomerisering og ligand binding. Ved å kombinere all denne informasjonen kan du generere detaljerte modeller av funksjonelle biologiske samlinger.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Chemistry

Biology

Molecular Biology

Unit 1

Fundamentals

Protein Function

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Produksjon av disulfide-stabilisert transmembrane Peptid Komplekser for Strukturelle studier

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysere Protein Dynamics Bruke Hydrogen Exchange-massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Forbedret i-gel reduktiv β-eliminering for Comprehensive O-forbundet og sulfo-glycomics ved massespektrometri

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

En studie av kompleks av Mercury (II) med Dicysteinyl tetrapeptidene av elektrosprayionisering massespektrometri

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

HS-MRM analysen for kvantifisering av verten celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals av flytende kromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Sanntid pusten analyse ved hjelp av sekundære Nanoelectrospray Ionization koblet til høy oppløsning massespektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Kapillær elektroforese massespektrometri tilnærminger for karakterisering av protein og metabolitt korona ervervet av nanomaterialer

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Kovalent merking med Diethylpyrokarbonat for å studere protein høyere orden struktur ved massespektrometri

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...