Name: analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Карл-Петер Hopfner и Роберт Томас Бирн, любезно предоставление образцов белка Гера и Гера-Нура и за их помощь с экспериментальным дизайном. Мы также благодарим д-р Имонн чтения для его рассмотрения рукописи. Мы с благодарностью признаем наши финансирующие органы: Уэллком траст [109854/Z/15/Z] и Королевского общества [RG150216 а.п.].

Отсутствие конфликта интересов объявил.

МС играет все более важную роль в характеристике стехиометрии, взаимодействий и архитектура Субблок белковых комплексов. IM-MS данные могут использоваться для определения топологических мероприятий подразделений в многокомпонентных комплексов. По сравнению с другими существующими методами структурной биологии, MS имеет несколько преимуществ. Родной MS-это способ быстро и чувствительный и может использоваться для проверки образцов гетерогенных белков. При сочетании с экспериментов в решение нарушения, может контролироваться диссоциации пути сборки белков. Вместе с кристаллические структуры или модели гомологии информации, предлагаемые структурные MS предлагает инструмент для изучения взаимодействий протеин лиганда и обеспечивают почти родной модели и Ассамблеи пути11.
Здесь мы описываем экспериментальных процедур, необходимых для анализа стехиометрии и состав взаимодействий протеин лиганд, с одного или нескольких лигандов, используя интегративной MS. Это включает в себя MS пробоподготовки, сбор данных, анализ данных и интеграции данных MS, с использованием вычислительных средств. Для этого мы использовали ДНК резекция Гера-Нура гетеро олигомерных комплекс белков, обязан три лигандами (ДНК, АТФ и АДФ), как наша модель системы. Протокол показывает использование имеющихся в настоящее время программное обеспечение для анализа и представления данных.
Приобретение спектры высокого качества имеет важное значение для анализа Связывание лиганда, поэтому, тщательно образца подготовительные шаги являются критическими, включая очищение протеина, лигандом титрования и буфера обмена. Одно ограничение Неси родной МС при изучении Связывание лиганда является неспецифической привязки. Неспецифическая привязки возникает во время капелька desolvation на протяжении всего процесса электроспрей. Это увеличивает концентраций лигандов и таким образом изменяет соотношение белка/лигандом29. Связывание нуклеотидов приводит к относительно небольшой массовой разницей между АПО и нуклеотидов прыгните белка, которая не изменяет50,эффективность ионизации51.
Мы использовали систему Synapt G2-Si MS для нашей работы, но протоколы применяются для различных расследований других белков лиганд комплексов с использованием других коммерчески доступных нано электроспрей масс-спектрометров. Интегративной структурных MS играет все более важную роль в решении проблем биологии большей сложности. Рабочий процесс и методы, описанные здесь хорошо подходят для понимания структурных последствий и создания механизмов комплекс белков и белка лиганд формирования, которые иначе трудно исследования с использованием обычных методов структурного .

Родной масс-спектрометрических анализ интакт белками и их комплексов осуществляется с помощью электроспрей и нано электроспрей ионизации (Неси), которые сохранили сворачивание белков и non ковалентные взаимодействий во время процесса ионизации1, 2. В родной МС в состоянии почти родной в газовой фазе3,4сохраняются структура белков и их комплексов. Родной MS обнаруживает несколько заряженных белков ионов, которые разделены согласно их массы для зарядки соотношение (m/z) позволяет масса белка или белка лиганд комплекс рассчитывается. Эта информация позволяет определение стехиометрии интактных белков, субъединицы композиции, Связывание лиганда и взаимодействия сетей3,4,5,6. Родной MS имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами такие рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса спектроскопии5. Во-первых родной MS методика быстро и чувствительный, требуя лишь несколько микролитров (2-3 мкл) образца при относительно низких концентрациях окончательный комплекс в высокой Нм до низкой мкм диапазон6. Во-вторых родной MS может использоваться допросить образцы гетерогенных белков, что позволяет анализировать несколько белков и олигомерные государств одновременно. В-третьих родной MS не требуют образцы протеина быть изменен до анализа химической сшивки или белка маркировки. Эти преимущества сделали структурных MS мощный инструмент для структурной расследования белковых комплексов.
Родной MS может сочетаться с ионной подвижности (IM), техника, которая измеряет время, необходимое для путешествия через электрическое поле, белок-Ион, позволяя Столкновительное поперечного сечения (CCS), которые будут определены. CCS предоставляет разрешением структурную информацию, которая позволяет топологии и конформационные неоднородности информации белков, которые могут быть получены. Кроме того он позволяет изучение структурных моделей белков порожденных вычислительной подходы.
Белка газовой фазы стабильности могут расследоваться столкновения, индуцированных разворачивается (КИУ) измеряется с помощью IM-MS. Во время процесса ОРЖ белок ионы ускорился и активирована через повышение ускорения столкновения с инертной буферного газа в масс-спектрометр7,8,9. Этот процесс Столкновительное активации вызывает белок частично разворачиваться, что приводит к увеличению в уху. Это изменение в уху и энергия, необходимая для разворачиваться белка может быть измерено с использованием IM-г-жа этот подход, эффект привязки лигандов на стабильность белков может быть измеренной10. Субкомплексы могут создаваться в решения с помощью нарушения в решение методы, такие как добавление органических растворителей для мониторинга топологии родной как белковых комплексов. Срыв белковых комплексов в основном за счет нарушения non ковалентные взаимодействий внутри. Суб комплексы сохранить родной как топологий и, при обнаружении MS, раскрыть информацию о межучрежденческой подгруппы подключения.
Интеграционные подходы в структурной биологии комбинировать различные методы изучения структуры и динамики белков и их комплексов3,4,5,6. Родной MS и IM-MS использовались раскрыть молекулярных детали сложных биологических систем. Там было несколько примеров приложений, включая изучение белков Ассамблеи пути11,12,13,14, изучая сетей взаимодействия протеин15 , 16 , 17, мембранные белки6,18,19,20,21и белка лиганд взаимодействиями, такими как нуклеиновые кислоты22,23 ,24.
Однако родной МС также имеет свои ограничения. Родной MS измерения часто выполняются в летучих буферов как водный аммония ацетат, в котором некоторые белки не сохранит их сложить родного государства3,25. Тем не менее последние исследования показали, что это ограничение можно преодолеть путем оптимизации распыления диаметра кончика иглы (0,5 мм советы), таким образом, что белка и протеина сложного ионов может быть сформирован непосредственно из энергонезависимой буферов с высокой ионной силы, которые лучше имитации физиологической среды26. Кроме того родной MS использует электроспрей ионизировать и передачи non ковалентные сборок из раствора в газовой фазе; Таким образом относительное обилие обнаруженных комплексов может не представлять полностью, в раствор5,27. Кроме того в сравнении к в растворе, газовой фазы гидрофобных взаимодействий становятся слабее и электростатического взаимодействия становятся сильнее и поэтому выступает за3,28.
В этой статье мы предоставляем протоколы, анализа данных и интерпретации для идентификации белков и привязка с использованием родного MS, IM-MS, КИУ, срыв в раствор и моделирования лигандов. Ремонт комплекса ДНК, Гера-Нура, используется в качестве модели системы. Двуцепочечные разрывы ДНК (DSBs) являются одним из самых цитотоксических и пагубных форм повреждения ДНК, что приводит к генетической нестабильности и возможного развития рака в организме человека. Гомологичная рекомбинация является ремонт механизма, которая искореняет DSBs, процесс, который руководил комплекс, Гера-Нура СПС зависимых helicase нуклеиназы22.
Комбинируя родной MS и IM-MS с функциональных анализов и моделирования позволили расследование: i) роль Нура в Ассамблее, конформация и стабильности комплекса, ii) взаимодействия между dsDNA и комплекса и его влияние на общий стабильность комплекса и iii) стехиометрии и воздействия СПС привязки на Ассамблее22. В целом эта работа привели к улучшению понимания молекулярные основы комплекса HerA-Нура, связывая комплекс конформационные изменения протеина и стабильности с привязкой нуклеотидов. Этот протокол является универсальным для любого белка complex(es), который взаимодействует с одним или несколькими типами ligand(s).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">119120-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">20398-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ammonium acetate solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td style="width:71px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">7326204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vivaspin concentrator</td>
			<td style="width:71px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">Z614041-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Water TraceSelect</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">300060</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein architectures and protein-ligand complexes by integrative structural mass spectrometry

Белки являются важным классом биологических макромолекул, которые играют многие ключевую роль в клеточных функций, включая экспрессии генов, катализирующих метаболических реакций, репарации ДНК и репликации. Таким образом, глубокое понимание этих процессов обеспечивает критически важную информацию о том, как функции клеток. Интегративная структурные методы MS предлагают структурных и динамичная информация о белка комплекс Ассамблеи, сложные соединения, субъединицы стехиометрии, олигомеризации протеина и Связывание лиганда. Последние достижения в интегративной структурных МС позволили для описания сложных биологических систем, включая большие протеины дна binding и мембранных белков. Этот протокол описывает интеграцию разнообразных данных MS, такие, как родной MS и ионной подвижности масс-спектрометрии (IM-МС) с моделирования молекулярной динамики, чтобы получить понимание ДНК helicase нуклеиназы ремонт комплекс белков. Результате подход обеспечивает рамки для детального изучения лигандом привязки других белковых комплексов, участвует в важных биологических процессах.

Родной MS результаты показали олигомерных государства, состав и топологии комплекса HerA-Нура (рис. 1). Как non ковалентные взаимодействия сохранились в газовой фазе, родной MS АТФ γ-S и ADP титрования экспериментов определяется попарных нуклеотидов привязки Гера-Нура (рис. 2) и что повышение концентрации ATP-γ-S увеличивает относительный интенсивность hexameric Гера (рис. 3). Структурная информация относительно Субблок взаимодействия были получены от нарушения-решение, следуют родной MS и были согласны с и теоретической массы (рис. 4 и таблица 1).
Экспериментальные значения УХУ белков и их комплексов была получена от IM-MS экспериментов (рис. 5). Эти ценности вращательно усредненной газовой фазы поперечного сечения расчеты молекулярных фигуры и описать состояние мерных белка. CCS значения сравниваются с теоретических измерений от рентгеноструктурного анализа и хорошее соглашение выводит, что родной фигуру в сохранить в газовой фазе (таблица 1). Это проверяет, используя CCS значения для построения моделей с низким разрешением белка Ассамблеи48.
Экспериментальная ККСС могут быть рассчитаны для каждого иона состояние заряда. Конформером родной как белка может привести к возникновению для зарядки состояние ионов с аналогичными значениями CCS. Однако высокий заряд состояние ионов увеличилось кулоновских repulsions, которые могут привести к белка газовой фазы разворачивается и больше CCS значения по сравнению с теоретическим ККСС. CCS значение низкий заряд ионов, поэтому обычно используется в49. Для HerA-Нура, срыв в решение эксперименты на Гера и Гера-Нура и без ДНК побудило поколения Ассамблее путь, начиная с мономеров, то формирование весь hexameric Гера (6Гера)-комплекс димерной Нура (2Нура) с ДНК (рис. 6).
Различия в разворачивающихся участков CIU АПО (лигандом бесплатно) и связанными лиганда определить изменения в сложных стабильности на Связывание лиганда. Выше резюме50 или KECOM значение подразумевает более стабилизированный Ион в газовой фазе. CIU и KECOM анализ показал, что ДНК прыгните Гера-Нура является более стабильным, чем ДНК бесплатный комплекс (AiiРисунок 7). Из анализа ГРЖ-MS в соответствующих государствах АТФ привязки четыре АТФ γ-S связанного состояния, уменьшение комплекс стабильность в газовой фазе и шести -АТФ-γ-S связанного состояния, где находятся все места заняты был наиболее стабильных (BiiРисунок 7). Родной MS может выявить дискретных нуклеотидов привязки государства Гере; Однако он не может отличить которые Гера подразделения являются обязательными СПС и где происходит эта привязка. Эта информация может быть получена от явного моделирования растворителей MD hexameric Гера и Гера-Нура после обобщенных рабочего процесса (рис. 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Рисунок 1. Допрос олигомерных государства, состав и топологии HerA-Нура non ковалентные комплекса. (A) массовые спектры HerA, Гера-Нура и Гера-Нура присутствии ДНК (15,4 кДа 25 bp двуцепочечной ДНК). Субкомплекс HerA существует как hexamer и гептамер. Связывает Нура димер и Гера hexamer введении олигомерных преобразования. ДНК связывается сформированное комплекс Гера - Нура (адаптировано из Z. Ahdash et al., 201722результаты). (B) относительной интенсивности выявленных видов рассчитываются с использованием UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Рисунок 2. Родной ESI-MS раскрывает механизм привязки нуклеотидов, Гера-Нура. Массовые спектры Гера-Нура (A) и (B) Гера-Нура-ДНК с увеличением концентрации (i) СПС γ-S и (ii) ADP. Измеренной массы по сравнению с теоретической массы и количество АТФ γ-S или ADP связаны определяются. Измерения массы и количество связанных нуклеотидов указаны на спектры. ATP-γ-S и ADP титрования эксперименты определяется попарных нуклеотидов привязки Гера-Нура самостоятельно и в комплексе с ДНК, указывающее механизм циклического реакции (адаптировано из Z. Ahdash et al., 201722результаты). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> На рисунке 3. Измерение эффект увеличения концентрации ATP-γ-S на HerA олигомерных государства. (A) массовые спектры Геры на повышение концентрации ATP-γ-S. (B) график, показывающий относительных интенсивностей различных видов из родной MS, рассчитанных с использованием UniDec свёртки программного обеспечения32. С увеличением концентрации ATP-γ-S, относительная интенсивность hexameric Гера также увеличивается. Количество молекул АТФ γ-S связаны показана на спектрах (адаптировано из Z. Ahdash et al., 201722результаты). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Рисунок 4. Массовые спектры и югу комплекс диссоциации продуктов HerA (A) и (B) Гера-Нура (i) самостоятельно и в присутствии ниже (ii) ДНК-решение нарушения. В решение нарушения были эксперименты с использованием 10-40% ацетонитриле, метанол (метанола) или диметилсульфоксида (ДМСО) и привели к формированию различных Субкомплексы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Рисунок 5. Ион мобильности прибытия время распределение показано на оси УХУ для комплексов и сгенерированный суб комплексов. Значок для каждого югу комплекс соотносятся с теми комментариями на спектры на рисунке 4. Экспериментальные и расчетные массы и CCS значения суб комплексов, перечислены в таблице 1 , все из которых показал, что соглашение между экспериментальных и расчетных значений (после рассмотрения типичных неопределенности в резолюции путешествия волны Ион мобильности масс-спектрометрия37± 5 - 8%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Рисунок 6. Путь сборки комплекса HerA-Нура, образующиеся-решение нарушением родной MS и IM-г-жа цветные круги обозначают условия, где каждый субкомплекс было отмечено: родной (зеленый, ранее нарушения), метанол (желтый), ДМСО (фиолетовый) или Ацетонитрил (красный). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Рисунок 7. Расследование стабилизирующий эффект (A) ДНК на HerA-Нура и (B) СПС связывание Гера-Нура-ДНК. (i) газ фаза ГРЖ-MS участки и (ii) центр массы столкновения энергий (KEcom) вычисления показывают, что присутствие dsDNA стабилизирует комплекс HerA-Нура и что шесть АТФ γ-S государства является наиболее стабильным. Показано стабилизации для заряда различных государств. Участки были созданы с помощью «Пульсар» 33. Результаты от (A) взято из Z. Ahdash et al., 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Рисунок 8. Рабочий процесс для процедур моделирования для дифференциальной молекулярной динамики. (A) создание комплекса под следствием путем создания топологии из существующих подразделений и восстановления отсутствующих остатков. (B) рабочий процесс для запуска моделирования молекулярной динамики на комплекс с и без лигандом белков. Молекулярной динамики, что моделирование побежал для белок только который действует как ссылка и которая вычитается из моделирования белка плюс лиганда. Это сопровождается расчета колебаний дифференциального квадратного корня (RMSF) между моделирования и определения эффект Связывание лиганда. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Комплекс / югу комплекс</td>
			<td>Теоретическая масса (кДа)</td>
			<td>Экспериментальный масса (кДа)</td>
			<td>Теоретические CCS (Å2)</td>
			<td>Экспериментальный CCS (Å2) [бесплатно]</td>
			<td>Условие HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера6- Нура2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417,85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20% ACN, 10-40% ДМСО, 10% метанола</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера6- Нура2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>ACN на 10%, 10% метанола</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нура1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 10% метанола, 20-40% ДМСО</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нура2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40% метанола, 20-40% ДМСО</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 Гера
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56,32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>ACN НА 10-40%, 40% ДМСО</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40% meth, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% метанола, может 10-40%, 40% ДМСО</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера3 + ДНК</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40% метанола, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + ДНК</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339,3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% метанола, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера-6 + ДНК</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% метанола, АКС 10-40%, 10-40% ДМСО</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гера7 + ДНК</td>
			<td>409,8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Экспериментальные и расчетные массы и CCS значения Гера-Нура и его подпункта комплексов создается форма в решение срыв исследований.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Анализ архитектуры белка и белка Ligand комплексов по интегративной структурных масс-спектрометрии

Масс-спектрометрия (МС) стала важным инструментом для исследования структуры и динамики макромолекулярных сборок. Здесь мы интегрировать подходы на основе MS допросить комплекс формирования белков и Связывание лиганда.

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

В настоящее время масс-спектрометрия играет важную роль в структурной биологии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о важных биологических макромолекулах в их родном государстве, особенно белков и белковых комплексов. Родная масс-спектрометрия широко применима к различным биомолекулярным агрегатам, включая мультипротеиновые и нуклеиновые кислотные системы.Основным преимуществом этой техники является то, что она быстрая и очень чувствительная. Он может быть использован для допроса неоднородных образцов белка, что позволяет анализировать несколько белков в олигомерном состоянии одновременно. Демонстрация процедуры будет Энди Лау, аспирант в моей группе.Чтобы начать эту процедуру, подготовьте в доме капилляры для наноэлектропрактики, как указано в текстовом протоколе. Подготовьте образец без лиганда в качестве элементов управления для каждого запуска в качестве буферного обмена каждого в ацетат аммония. Далее выберите режимы чувствительности, положительного приобретения ионов и мобильности TOF.Следующий поворот на ловушку, API и IMS газов. Для разделения чата используйте показанные здесь отправные точки азота и аргона и настраивайте по мере необходимости. Установите соответствующий диапазон приобретения m/z.Для неизвестного белка первоначальные шаги оптимизации должны использовать широкий диапазон. Вставьте капилляр с золотым покрытием в капиллярный держатель. Затем загрузите от двух до трех микролитров белкового комплексного раствора, представляющих интерес для капилляров.Аккуратно затяните капилляр и поместите его на стадии источника электроспрей. Сдвиньте этап в положение, чтобы начать получение данных. Нанесите низкое давление газа нано-потока до тех пор, пока капля не образуется на кончике капилляра.Перемещение капилляров по отношению к конусу и контролировать ионный ток для достижения стабильного ионового тока. Нанесите капиллярное напряжение в диапазоне от 0,9 до 1,6 киловольт. Затем установите конус выборки, смещение источника, температуру источника и поток конусного газа, как указано в текстовом протоколе.Для получения хорошо разрешенного массового спектра и максимальной передачи ионов, отрегулируйте параметры MS и отслеживайте полученное изменение спектра. Установите энергию столкновения ловушки до начальной отправной точки между 10 и 50 вольт. Если смещения напряжения недостаточны, отрегулируйте энергии столкновения ловушки.Установите ловушку через его напряжение до начальной отправной точки между 20 и 45 вольт. Улучшение запустения за счет оптимизации этого напряжения. После этого оптимизируйте скорость волны и высоту волны, как указано в тексте, чтобы достичь наилучшего разделения подвижности.Для исследований с участием HerA и NurA используйте скорость волны 40 метров в секунду и высоту волны от 550 до 650 вольт. Для анализа связывания ДНК смешайте белок и ДНК в соотношении моляров, что позволяет сформировать комплекс ДНК белка. Добавьте все большее количество любого из следующих, 5'O-3-тио-трифосфата, соли тетратия или ADP.С помощью соответствующего программного обеспечения измеряют массы генерируемых видов и идентифицируют связывание лигандов, таких как связывание АТФ и ADP и олигомерные состояния. Затем используйте ионные интенсивности, наблюдаемые в необработанных спектрах ESI MS, для количественной оценки соответствующего относительного изобилия видов. После оптимизации условий прибора для стабильной передачи, уменьшить коллизионной энергии и отбора проб конуса как можно ниже, сохраняя при этом хорошее качество спектра.Используйте ранее установленную оптимизированную скорость волны и высоту волны для приобретения IM MS. Измерьте время дрейфа ионов на трех различных скоростях волн, сохраняя при этом одинаковую высоту волны. Для определения белка ион CCS измерения четырех калибрантов белка, два с массой выше белка в стадии исследования и два с массой ниже, используя те же условия приборов. Во-первых, подготовить образцы белка и буфер обмена их в ацетат аммония, как указано в текстовом протоколе.Добавить растворитель в 10%increments до достижения желаемого количества. Инкубировать на льду в течение одного часа. После этого приобрети спектр IM-MS для каждого образца.Используя программное обеспечение SUMMIT, назначайте белковые подкомплексы и генерируйте сети белкового взаимодействия. Кроме того, вручную создать список теоретических масс для ожидаемых видов. Чтобы начать исследование стабильности белковой комплексности, заведать данные IM-MS при одновременном увеличении напряжения ускорения ловушки с 10 вольт до 200 вольт, которые будут постепенно разворачиваться в белковой и газовой фазе.Анализируйте данные с помощью соответствующего программного обеспечения и генерируйте двумерные разворачивающиеся участки, укладыв нормализованные распределения CCS при каждом ускоряющемся напряжении для каждого состояния заряда. Родные результаты MS показывают олигомерное состояние, состав и топологию комплекса HerA и NurA. Поскольку нековалентные взаимодействия сохраняются в газовой фазе, родной MS экспериментов по титроваю АТФ гамма-S и ADP используется для определения парного нуклеотида, связывающего в HerA и NurA.Массовые спектры олигомерных состояний HerA показывают, что увеличение концентрации гамма-S АТФ увеличивает относительную интенсивность гексамерической HerA. Экспериментальные значения CCS для белков и их комплексов затем выводятся из экспериментов IM-MS. Эти значения, как видно, имеют хорошее согласие с теоретическими измерениями рентгеновской кристаллографии, которая подтверждает использование значений CCS для построения моделей сборки белка с низким разрешением.Анализ CIU и KEcom показывает, что ДНК, связанная с HerA-NurA, более стабильна, чем комплекс, свободный от ДНК. Анализ CIU MS и соответствующие состояния связывания АТФ показывают, что четыре гамма-состояния АТФ S снижают сложную стабильность в газовой фазе. Тем не менее, шесть АТФ гамма-связанных состояние, в котором все сайты заняты, считается наиболее стабильным.Точные измерения молекулярной массы нетронутого комплекса дают ценную информацию о биомолекулярной характеристике. Мы можем получить информацию о сложных сборочных путях, олигомеризации белка и связывании лигандов. Объединение всей этой информации позволяет создавать детальные модели функциональных биологических сборок.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Chemistry

Biology

Molecular Biology

Unit 1

Fundamentals

Protein Function

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Анализируя Динамика белков с использованием водорода валютный масс-спектрометрии

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Улучшенные В-гель восстановительного β-Ликвидация для Комплексная О-связанные и сульфо-glycomics помощью масс-спектрометрии

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Исследование комплексообразования ртути (II) с Dicysteinyl тетрапептидов электрораспылительной ионизации масс-спектрометрии

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

HS-мно Assay для количественного определения белков клетки хозяина в области биофармацевтики белка по жидкостной хроматографии ионной подвижности QTOF масс-спектрометрии

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Анализ реального времени дыхание с помощью вторичных Nanoelectrospray ионизации в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Подходы масс-спектрометрии капиллярного электрофореза для характеристики белковой и метаболитовой короны, приобретенной наноматериалами

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Ковалентная маркировка диэтилпирокарбонатом для изучения структуры белка высшего порядка с помощью масс-спектрометрии

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...