Name: visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00
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Si ringraziano il Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci dell'Istituto Francis Crick per tipo aiutare negli esperimenti singola molecola, Dr. Daniel Duzdevich dal laboratorio del Dr. Eric C. Greene della Columbia University, Dr. Yujie Sun della Peking University e Dr. Chunlai Chen di Tsinghua University per utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation della Cina 31371264, 31401059, CAS Team di innovazione interdisciplinare e la Newton Advanced Fellowship (NA140085) dalla Royal Society.

1. preparazione del substrato di DNA λ-ARS317
<ol><li>Imballaggio e la costruzione di DNA substrato<ol>
<li>Digerire DNA nativo λ usando Xhoio enzima; amplificare un 543 cuscinetto del frammento del DNA bp ARS317 dal DNA genomico di germogliamento lievito usando i primer contenenti 20 bp omologa sequenze di upstream e downstream di Xhoio sito enzima DNA di lambda. Aggiungere 100 ng di Xhoho digerito il DNA λ e 10 ng di DNA frammento a 10 µ l di sistema di reazione di ricombinazione omolog...

<ol>
	<li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase.">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria.">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li><li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots:+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors.">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots.">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA.">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li><li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot.">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li><li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system.">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li><li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level.">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).</li><li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation:+origin+specificity,+licensing,+and+firing+at+the+single-molecule+level.">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li><li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes.">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies.">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li><li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-molecule+approach+to+visualize+the+nucleosome+assembly+in+yeast+nucleoplasmic+extracts.">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li><li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts.">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li><li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+&#955;+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates.">A bacteriophage &#955; DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li><li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes.">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li><li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+modification+of+&#955;-DNA+substrates+for+single-molecule+studies.">Efficient modification of &#955;-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).</li></ol>

Qui, presentiamo un protocollo per osservare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate utilizzando il TIRFM in una cella di flusso. I passi necessari sono site-specific modificazione del substrato di DNA, DNA biotinylation, pulizia vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, preparazione di cella di flusso e imaging singola molecola. Ci sono due punti chiave che dovrebbero essere notati. Innanzitutto, tutti i passaggi con λ DNA devono essere manipolati delicatamente per ridurre even...

Interazioni tra DNA e proteine sono essenziali per molti processi biologici complessi, come ad esempio la replicazione del DNA, riparazione del DNA e trascrizione. Anche se gli approcci convenzionali hanno fatto luce sulle proprietà di questi processi, molti meccanismi chiave sono ancora poco chiare. Recentemente, con le tecniche di singola molecola in rapido sviluppo, alcuni dei meccanismi sono stati indirizzati1,2,3.
L'applicazione di microscopia di fluorescenza di singola molecola sulla visualizzazione interazioni proteina-DNA in tempo reale principalmente dipende dallo sviluppo di rilevazione della fluorescenza e sonde fluorescenti. Per uno studio di singola molecola, è importante etichettare la proteina di interesse con una sonda fluorescente adatta poiché sistemi di rilevazione di fluorescenza per la maggior parte sono commercialmente disponibili.
Le proteine fluorescenti sono comunemente usate in biologia molecolare. Tuttavia, la bassa luminosità fluorescente e la stabilità contro photobleaching limitarne l'applicazione in molti saggi di singola molecola. Punti quantici (QDot) sono piccoli emettitori di luce nanoparticelle4. A causa di loro proprietà ottiche uniche, QDot sono 10 - 20 volte più luminoso e diverse migliaia di volte più stabile di ampiamente usato organici coloranti5. Inoltre, QDot hanno un grande Stokes shift (la differenza tra la posizione dei picchi di eccitazione e di emissione)5. Così, QDot può essere utilizzato per l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini con alti rapporti segnale-rumore, mentre essi non possono essere utilizzati in analisi quantitative.
Ad oggi, ci sono due approcci per etichettare una proteina bersaglio con QDot site-specifically: etichettatura con l'ausilio di anticorpi primari o secondari coniugati Qdot6,7,8; o etichettatura la proteina bersaglio con QDot direttamente, che si basa sull'interazione forte tra biotina e streptavidina9,10,11,12,13. Rivestite con streptavidina QDot sono disponibili in commercio. Nel nostro recente studio, site-specifically proteine biotinilate in lievito ad alta efficienza sono stati purificati dal co-sovraespressione di BirA e proteine etichettate Avi in vivo10. Segue e ottimizzando le analisi di singola molecola14,15,16,17, abbiamo osservato le interazioni tra DNA e proteine identificate Qdot a utilizzando il livello di singola molecola TIRFM10.
Qui, abbiamo scelto la gemmazione lievito origine riconoscimento complesso (ORC), che possa in particolare riconoscono e si legano alla sequenza autonomamente replica (ARS), come la proteina di interesse. Il seguente protocollo presenta una procedura dettagliata di visualizzare l'interazione di Qdot-labeled ORC con ARS utilizzando TIRFM. La preparazione del substrato DNA site-specifically modificato, la biotinilazione di DNA, la pulizia del vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, l'Assemblea di cella di flusso e l'imaging di singola molecola sono descritti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3011</td>
			<td>Store 25 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-fusion cloning kit</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B22611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPlax Lambda 
			Packaging Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5110</td>
			<td>Bacterial strain LE392MP 
			is included in this package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10013092</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10012818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ-amine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J853-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22090-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring apparatus</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KMO2 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122151</td>
			<td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R4875-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5319-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0706-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated primers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22266882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80120891</td>
			<td>sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10011218</td>
			<td>30% Hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG 
			(methoxy-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-PEG 
			(biotin-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>IPC250-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum sealer</td>
			<td>MAGIC SEAL</td>
			<td>WP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped glass scribe</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>70036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/4</td>
			<td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL620001-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>LEAFTOP</td>
			<td>9005</td>
			<td>five minutes epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion/withdrawal 
			programmable pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Sapphire-532-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS-640-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Imaging 
			splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics K.K.</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illumination system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX2-RFAEVA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60&#215;TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>APON60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-edge laser dichroic 
			beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di01-R405/488/ 
			532/635-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/ 
			581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF649-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET585/65m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET665lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F36909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot705 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q10163MP</td>
			<td>Store at 4 &#186;C, do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0220-25G</td>
			<td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M109-5G</td>
			<td>Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 &#956;l aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

La microscopia di fluorescenza ha fatto grandi contributi nella dissezione dei meccanismi di complessi processi biologici a livello di singola molecola. Nelle analisi di singola molecola per lo studio delle interazioni DNA-proteina, ci sono due fattori importanti da considerare: il substrato di DNA con una lunghezza sufficiente per l'osservazione facile ed etichettatura una proteina con una sonda fluorescente adatta. 48,5 kb λ DNA è un buon candidato per il substrato del DNA. Punti quantici (QDot), come una classe di sonde fluorescenti, consentono l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini di alta qualità. In questa carta, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina a livello di singola molecola, che comprende preparando un λ site-specifically modificate del DNA e l'etichettatura di una proteina bersaglio con QDot rivestite con streptavidina. Per un proof of concept, scegliamo ORC (riconoscimento di origine complessa) nel lievito gemmante come una proteina di interesse e visualizzare la sua interazione con un ARS (sequenza autonomamente replica) utilizzando TIRFM. Rispetto ad altre sonde fluorescenti, QDot hanno evidenti vantaggi negli studi di singola molecola a causa della sua elevata stabilità contro photobleaching, ma va notato che questa proprietà limita la sua applicazione in analisi quantitative.

Per visualizzare l'interazione tra Qdot-labeled ORC e l'ARS, abbiamo costruito il substrato di DNA λ-ARS317. Un frammento di DNA che contiene ARS317 è stato integrato in XhoI sito (33,5 kb) del DNA nativo λ di ricombinazione omologa (Figura 1A). Il prodotto di ricombinazione è stato confezionato usando gli estratti e le particelle dei fagi confezionati sono state coltivate su piastre LB (Figura 1B). La placca positiv...

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Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â» DNA at the Single Molecule Level

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Research

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Biology

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

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CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...