كان هذا العمل دعم مالي من مجلس البحوث في النرويج وجامعة أوسلو، أندرس جهر مؤسسة، مؤسسة نانسن، والتركة في الذاكرة للأفغاني هنريك. ونشكر الدكتور نوبورو ميزُشيما ATG5 + + ميفس و ATG5--/--ميفس، الدكتور ماساكي كوماتسو ATG7 + + ميفس ATG7/ميفس، والدكتور شيزو أكيرا ATG9A + + ميفس و ATG9A/ميفس. ونشكر Sætre فرانك للمساعدة التقنية، والدكتور كل O. سيجلين للمناقشات البناءة بالمنهجية.

1-خلية البذر والعلاج
<ol><li>
ثقافة الخلايا ملتصقة في قوارير زراعة الأنسجة2 75 سم في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية، واستخدام الثقافة الوسيلة المفضلة لنوع الخلية في السؤال. السماح للخلايا لتنمو حتى تصل إلى طبقة خلايا بالقرب من روافد. ملاحظة: استخدام المتوسط RPMI 1640 ...

ويمثل البروتوكول الموصوفة هنا في ملخص، طريقة موثوقة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لمراقبة نشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات. مقارنة بالأسلوب الأصلي12،16، نحن إزالة عدد من الخطوات غير الضرورية، وتبسيط العديد من الخطوات المتبقية، وأدخلت تقليص حجم...

أوتوفاجي (اليونانية "الأكل الذاتي") عملية تطورية مصانة لتدهور رغوي/تعويض المواد داخل الخلايا. عند اكتشاف الجينات المرتبطة أوتوفاجي ("ATG")، وهامة أوتوفاجي في الخميرة والبشر، والتحقيق أوتوفاجي أن يلعب دوراً هاما في صحة الإنسان والمرض (اعترف بفضل جائزة نوبل في الطب أو الفيزيولوجيا لعام 2016 يوشينوري اوشومي)، أوتوفاجي قد تصبح بسرعة واحدة من العمليات الأكثر كثافة درس في خلية علم الأحياء1،2.
ماكرووتوفاجي (يشار إليه فيما يلي "أوتوفاجي") تتسم بالتوسع وقابلة للطي للغشاء داخل الخلايا سيستيرناي ("فاجوفوريس") في هياكل مختومة، مزدوج أو متعدد membrane ("أوتوفاجوسوميس") الذي عزل فعال المواد enwrapped من باقي السيتوبلازم. عند انصهار أوتوفاجوسوميس مع lysosomes، الغشاء أوتوفاجوسومال الداخلي والبضائع المنحاة المتدهورة والمعاد تدويرها. أوتوفاجوسوميس يمكن عزل المواد هيولى في عشوائية (غير انتقائية أوتوفاجي) وآداب الانتقائي (أوتوفاجي الانتقائي). أوتوفاجي الأكبر على الأرجح يمثل مزيجاً أوتوفاجي انتقائية وغير انتقائي.
في عام 1960 و 70 ("المورفولوجية عصر" البحوث أوتوفاجي)، وعزل أوتوفاجيك قيمت أساسا من خلال التحليلات ultrastructural. في ثمانينيات القرن الماضي وبداية تسعينيات القرن العشرين ('' مرحلة البيوكيميائية '') "كل سيجلين" وزملاء العمل – الذي درس أوتوفاجي في خلايا الكبد في الفئران الأولية – تطوير أساليب الأولى لقياس كمي تنحية أوتوفاجيك النشاط3. استخدام هذه الاختبارات، سيجلين تعريف ووصف مختلف الخطوات من4،أوتوفاجيك الليزوزومية المسار5، اكتشفت ويسك أمفيسومي6 (منتج الانصهار دخلول-أوتوفاجوسومي) وكان الأول من وصف دور الفسفرة البروتين في أوتوفاجي لائحة7. ومع ذلك، بعد اكتشاف أتجس في لعام 1990 ("عصر الجزيئية")، ووصف أول بروتين ATG8 الثدييات، سلسلة البروتينات المرتبطة microtubule 1A/1B-الضوء 3 (LC3) في عام 20008، استخدام البروتينات ATG كعلامات عملية أوتوفاجيك سرعان ما اكتسب شعبية، وتركت الطرق البيوكيميائية الأكبر سنا وأكثر مشقة. وفي الواقع، على مدى 18 عاماً الماضية ولطخة غربية وتحاليل مجهرية fluorescence LC3 أصبحت حد بعيد الأكثر شعبية (وفي كثير من الحالات فقط) وسيلة لدراسة أوتوفاجي في خلايا الثدييات. الميزة هي السهولة النسبية التي يمكن تنفيذ هذه الأساليب. العيب أن واحداً دراسة مكون عربة (LC3) بدلاً من البضائع أوتوفاجيك الفعلية. وهذا عيب خطير بدلاً من ذلك، نظراً للعلاقة بين الدول و/أو التمويه LC3 من خلال المسار مقابل عزل وتدفق البضائع غير واضح جداً. وفي الواقع، أننا أظهرنا أنه يمكن الحفاظ على تدفق البضائع السائبة في مستويات عالية في ظروف حيث يوجد لا التمويه LC3، على الرغم من وجود LC3 مترافق في خلايا9. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن أوتوفاجي الأكبر لا تتأثر بكفاءة LC3 نضوب، وبالتالي يرجح أن هو مستقل LC39. وقد أكد هذا الاستنتاج في وقت لاحق LC3 الدراسات المغلوب10،11، التي تشير أيضا إلى أن تعتمد على باركين ميتوفاجي (أوتوفاجي انتقائية من الميتوكوندريا) بشكل مستقل LC310،11 .
وباختصار، هناك واضحة تحتاج لفحوصات على أساس الشحن لمراقبة نشاط أوتوفاجيك. على النحو الأمثل ينبغي أن تكون مثل هذه الاختبارات على نطاق واسع المنطبقة ومحددة تحديداً جيدا، وسهلة لتنفيذ. على مدى السنوات القليلة الماضية لقد أحطنا اهتماما خاصا بمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، التي وضعتها "كل سيجلين" في ثمانينيات القرن الماضي12، ويستند إلى قياس نقل رابطة حقوق الإنسان سيتوسوليك إلى سيديمينتابل، أوتوفاجيك الخلية التي تحتوي على المنقبضة الكسور. رابطة حقوق الإنسان هو بروتين سيتوسوليك مستقر وقابل للذوبان بسهولة المحتبس المشترك عند فاجوفوريس لف البضائع هيولى. ولذلك تنحية من رابطة حقوق الإنسان مقياس عام لعزل أوتوفاجيك. رابطة حقوق الإنسان المتدهورة حصرا ب المسار أوتوفاجيك الليزوزومية12. وبالتالي، وجود مثبطات تدهور الليزوزومية، مثلاً، بافيلوميسين A1 (Baf)13، آثار العلاج التجريبي مباشرة تعكس التغييرات في نشاط تنحية أوتوفاجيك. نظراً لغياب مثبطات التدهور، يمكن قياس الأثر الصافي للتعديلات في تنحية رابطة حقوق الإنسان والتدهور.
مقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان المطبقة على نطاق واسع، حيث يعبر رابطة حقوق الإنسان عاليا وأوبيكويتوسلي في جميع أنواع الخلايا، ويمكن قياس مستويات رابطة حقوق الإنسان بدقة تحليل الأنزيمي14،15. غير أن البروتوكول الأصلي12 – أنشئت في خلايا الكبد في الفئران الأولية – بدلاً من ذلك يستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب كمية عالية من ابتداء من المواد، فضلا عن تفريغ كهربائي مصنوعة خصيصا مكثف. على نحو تدريجي، ونحن قد تحولت تدريجيا المقايسة إلى طريقة سهلة ومرنة. أولاً، البروتوكول الأصلي تم تكييفها للاستخدام في خلايا الثدييات الأسطر16. وثانيا، كان الأسلوب كثيرا المصغرة3،9. ثالثا، تم القضاء على العديد من الخطوات في البروتوكول، بما في ذلك كثافة شاقة وسادة الخطوة17. مكن هذا في نفس الوقت تصغير أبعد من الأسلوب، من نقطة البداية الأصلية لاستخدام لوحة 10 سم كل عينة16 إلى استخدام بئر واحدة من صفيحة 12-جيدا كل عينة (أيحوالي 15-fold أقل بدءاً 17من المواد). ورابعاً، حددنا جهاز انهانسر تجارية التي يمكن أن تحل محل مكثف تفريغ كهربائي مصنوعة خصيصا17.
ويرد هنا لدينا البروتوكول الأكثر حداثة للمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، التي تشمل بعض التبسيطات مواصلة أسلوب مقارنة ب نشرها مسبقاً17 . وعلاوة على ذلك، يتم إظهار مجموعة من النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها في عدد من أنواع مختلفة من الخلايا، والأهم من ذلك، يتم توفير عدة أسطر من التصديقات التجريبية لأسلوب استخدام ضربة قاضية الدوائية فضلا عن الجينية والنهج خروج المغلوب. لمخطط تدفق الإجمالي البروتوكول كله، انظر الشكل 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

أوتوفاجي السائبة تتميز بعزل أجزاء كبيرة من السيتوبلازم إلى الهياكل المزدوجة-membrane متعددة تسمى أوتوفاجوسوميس. ويرد هنا بروتوكول بسيط لرصد هذه العملية. وعلاوة على ذلك، يتم توفير النتائج النموذجية والتجريبية التحقق من صحة الأسلوب تحت ظروف حمل أوتوفاجي في أنواع مختلفة من خلايا الثدييات المستزرعة. خلال أوتوفاجي السائبة، تنحية أوتوفاجوسوميس سيتوسول، وذلك أيضا للذوبان البروتينات سيتوسوليك، جنبا إلى جنب مع غيرها من البضائع أوتوفاجيك. رابطة حقوق الإنسان هي مستقرة وعالية الإنزيم سيتوسوليك وفيرة، والقابلة للذوبان هو المعزول غير انتقائية في أوتوفاجوسوميس. ولذلك يعكس مقدار تنحية رابطة حقوق الإنسان مبلغ السائبة تنحية أوتوفاجيك. لتحديد كفاءة ودقة تنحية رابطة حقوق الإنسان في الخلايا، نحن نوظف بروتوكولا تجزئة المستندة إلى اليكتروديسروبشن الذي يفصل فعالية سيديمينتابل من سيتوسوليك رابطة حقوق الإنسان، تليها قياس النشاط الأنزيمي في سيديمينتابل الكسور مقابل عينات كامل الخلية. عزل أوتوفاجيك يتحدد بطرح نسبة سيديمينتابل رابطة حقوق الإنسان في الخلايا غير المعالجة من تلك الخلايا في المعالجة. ميزة الفحص تنحية رابطة حقوق الإنسان أنه يعطي مقياس كمي لعزل أوتوفاجيك من البضائع المحلية، بدلاً من الأساليب الأخرى أما تنطوي على التعبير حمل خارج الرحم المسابير تنحية أو مبطلات شبه كمي حماية تحليلات لعلامات أوتوفاجي أو مستقبلات.

استخدام البروتوكول الموصوفة هنا، نشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في عدد من خطوط خلايا الثدييات المختلفة، بما في ذلك LAPC4، DU145، Huh7، PNT2A، هيلا، VCaP، H3122، Hec1A، MCF-7، G361، T47D، U2OS، PC3 الماوس الليفية الجنينية (MEFs)، RPE-1، وتم قياس الخلايا BJ، HEK293 ولنكاب. عزل بتقييم ظروف القاعدية (في المتوسط ك?...

Watch this Scientific Journal Video about The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay Ã¢â‚¬â€ A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells at 

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

مقايسة تنحية نازعة لاكتات — طريقة بسيطة وموثوق بها لتحديد النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات

ويرد هنا بروتوكول بسيط وتم التحقق من صحتها جيدا لقياس النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات. الأسلوب يستند على قياس نسبة اللاكتات نازعة (رابطة حقوق الإنسان) في سيديمينتابل خلية الكسور مقارنة بإجمالي المستويات الخلوية في رابطة حقوق الإنسان.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing : طريقة بسيطة لالتنميط الجيني دقيقة

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

تشكيل الأنبوبة Matrigel القائم على الفحص لتقييم نشاط الخلايا السرطانية مكون للأوعية

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

طريقة بسيطة لDNA الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لسحق الكروموسومات

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...