Dit werk werd financieel ondersteund door de Raad onderzoek van Noorwegen, de Universiteit van Oslo, de Anders Jahre Foundation, de Nansen-Stichting en de erfenis in het geheugen van Henrik Homan. Wij danken Dr. Noboru Mizushima voor de ATG5 +/ + MEFs en ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu voor de ATG7 +/ + MEFs en ATG7-/-MEFs en Dr. Shizuo Akira voor het ATG9A +/ + MEFs en ATG9A-/-MEFs. Wij bedanken Frank Sætre voor technische bijstand, en Dr. Per O. Seglen voor constructieve methodologische discussies.

1. cel zaaien en behandeling
<ol><li>
Cultuur Adherente cellen in 75 cm2 weefselkweek kolven in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C, met behulp van het medium van de cultuur voor het celtype in kwestie. De cellen groeien totdat ze een in de buurt van-heuvels cellaag bereiken toestaan. Opmerking: Gebruik RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) voor LNCaP, HEK293, muis embryonale fibroblasten (MEFs), BJ, MCF-7 en RPE-1 cellen.<ol>
<li>Wassen van ...

Kortom vertegenwoordigt het protocol beschreven hier een betrouwbare en breed toepasbaar methode om bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen te controleren. Vergeleken met de oorspronkelijke methode12,16, hebben we een aantal onnodige stappen verwijderd, vereenvoudigd verscheidene van de resterende stappen en introduceerde een aanzienlijke inkrimping. Dientengevolge, het protocol is sterk verbeterd ten opzichte van kosten - en tijd-efficiëntie, en ...

Autophagy (Grieks voor "zelf eten") is een evolutionaire geconserveerde proces voor vacuolar/lysosomale afbraak van intracellulaire materiaal. Bij ontdekking van de genen autophagy-gerelateerde ("ATG"), die belangrijk voor autophagy in gist en mensen zijn, en het besef dat autophagy speelt een belangrijke rol in de menselijke gezondheid en ziekte (erkend door 2016 de Nobelprijs voor geneeskunde of fysiologie aan Yoshinori Ohsumi), autophagy snel uitgegroeid tot een van de meest intensief bestudeerde processen in1,2van de biologie van de cel.
Macroautophagy (hierna te noemen "autophagy") wordt gekenmerkt door de expansie en vouwen van intracellulaire membraan cisternae ("phagophores") in hermetisch gesloten, dubbel - of multi - membrane structuren ("autophagosomes") die effectief sekwestreren de enwrapped materiaal van de rest van het cytoplasma. Na de fusie van autophagosomes met lysosomen, is de innerlijke autophagosomal membraan de afgezonderd lading gedegradeerd en gerecycleerd. Autophagosomes kan sekwestreren cytoplasmatische materiaal in zowel willekeurige (niet-selectieve autophagy) en selectieve (selectieve autophagy) manieren. Bulk autophagy waarschijnlijk vertegenwoordigt een mix van niet-selectieve en selectieve autophagy.
In de jaren 1960 en 70 ("de morfologische tijdperk" van autophagy onderzoek), was autophagic sekwester vooral beoordeeld via ultrastructurele analyses. In de jaren 1980 en begin van de jaren 1990 ("de biochemische tijdperk") Per Seglen en medewerkers — die studeerde autophagy in primaire rat hepatocyten — de eerste methodes voor het kwantitatief meten van autophagic sekwester activiteit3ontwikkeld. Met behulp van deze tests, Seglen gedefinieerd en gekenmerkt van de verschillende stappen van de autophagic-lysosomale traject4,5, ontdekt en bedacht de amphisome6 (het product van endosome-autophagosome fusion) en was de eerste die beschrijven de rol voor Proteïne Fosforylatie in autophagy verordening7. Echter, na de ontdekking van de ATGs in de jaren 1990 ("de moleculaire tijdperk") en de eerste karakterisering van een zoogdieren ATG8 eiwit, microtubulus-geassocieerde proteïne 1A/1B-licht ketting 3 (LC3) in 20008, het gebruik van eiwitten van de ATG als markers voor de autophagic proces snel aan populariteit gewonnen en de oudere en meer moeizaam biochemische methoden werden achtergelaten. In feite, in de laatste 18 jaren, westelijke vlek en fluorescentie microscopie analyses van LC3 de veruit het meest populair zijn geworden (en in veel gevallen de enige) vervoermiddel studeren autophagy in de cellen van zoogdieren. Het voordeel is het relatieve gemak waarmee deze methoden kunnen worden uitgevoerd. Het nadeel is dat men bestudeert een kar component (LC3) in plaats van de werkelijke autophagic lading. Dit is een vrij ernstige nadeel, omdat de relatie tussen de Staten en/of flux van LC3 via het traject ten opzichte van de sekwestratie en flux van lading zeer onduidelijk is. In feite, we hebben aangetoond dat bulk cargo flux kan worden gehandhaafd op een hoog niveau in omstandigheden waar er geen LC3 flux, ondanks de aanwezigheid van geconjugeerd LC3 in de cellen9. Bovendien, we laten zien dat bulk autophagy niet wordt beïnvloed door efficiënte LC3 uitputting, en is dus waarschijnlijk LC3-onafhankelijke9. Deze bevinding is later bevestigd door LC3 knock-out studies10,11, waaruit ook blijkt dat Parkin-afhankelijke mitophagy (de selectieve autophagy mitochondria) onafhankelijk is van LC310,11 .
Kortom, er is duidelijk behoefte aan lading gebaseerde testen om autophagic activiteit te controleren. Optimaal moet deze gehaltebepalingen in grote lijnen die van toepassing zijn, duidelijk omschreven en gemakkelijk uit te voeren. De afgelopen jaren hebben wij een bijzonder belang bij het LDH sekwester assay, die werd ontwikkeld door Per Seglen in de jaren 1980-12, en is gebaseerd op de meting van de overdracht van cytosolische LDH aan sedimentable, autophagic vacuole-bevattende cel genomen breuken. LDH is een stabiele, oplosbare cytosolische eiwit dat is gemakkelijk samen afgezonderd wanneer phagophores wrap cytoplasmatische lading. Sekwestratie van LDH is daarom een algemene maatregel autophagic sekwester. LDH is uitsluitend afgebroken door de autophagic-lysosomale traject12. Dus, in het bijzijn van de lysosomale afbraak-remmers, bijvoorbeeld bafilomycin A1 (Baf)13, experimentele behandeling effecten direct bijgewerkt met de wijzigingen in autophagic sekwester activiteit. Bij gebrek aan degradatie remmers, kan het netto-effect van wijzigingen in het LDH sekwestratie en afbraak worden gemeten.
De bepaling van de sekwestratie LDH is breed toepasbare, aangezien LDH zeer en overal in alle celtypes uitgedrukt is, en LDH niveaus kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd met een enzymatische assay14,15. Echter, de oorspronkelijke protocol12 — vastgesteld in primaire rat hepatocyten — was nogal tijdrovend en vereist een hoge hoeveelheid materiaal, evenals een op maat gemaakte elektrische kwijting condensator beginnen. Op een stapsgewijze manier, hebben wij de bepaling geleidelijk omgevormd tot een gemakkelijke en veelzijdige methode. Ten eerste, was het oorspronkelijke protocol aangepast voor gebruik in zoogdiercellen lijnen16. Ten tweede, de methode was aanzienlijk radiolink3,9. Derde, verschillende stappen in het protocol werden geëlimineerd, met inbegrip van een moeizame dichtheid kussen stap17. Hierdoor tegelijkertijd een nog verdere inkrimping van de methode van het oorspronkelijke beginpunt van het gebruik van een 10 cm plaat per monster16 naar het gebruik van een enkele goed uit een plaat van de 12-well per monster (dat wil zeggen, ongeveer 15-fold minder beginnen materiaal)17. Ten vierde, we een commerciële electroporation apparaat dat zou kunnen van de op maat gemaakte elektrische kwijting condensator17 vervangenvastgesteld.
Hier wordt onze meest recente protocol van het LDH sekwester assay, waarin sommige verdere vereenvoudigingen van de methode in vergelijking met de eerder gepubliceerde17 gepresenteerd. Bovendien, een typische resultaten die zijn verkregen in een aantal verschillende soorten cellen worden weergegeven, en belangrijker, meerdere tekstregels experimentele validaties van de methode met behulp van zowel farmacologische als genetische knockdown en knock-out benaderingen worden meegeleverd. Voor een algehele regeling van de stroom van het hele protocol, Zie Figuur 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

Bulk autophagy wordt gekenmerkt door de inbeslagneming van grote delen van het cytoplasma in dubbele/multi-membrane structuren genoemd autophagosomes. Hier is een eenvoudig protocol volgen van dit proces beschreven. Bovendien, de typische resultaten en experimentele validatie van de methode onder autophagy-inducerende omstandigheden in verschillende soorten gekweekte zoogdiercellen worden geleverd. Tijdens bulk autophagy sekwestreren autophagosomes cytosol, en daarmee ook oplosbare cytosolische eiwitten, naast andere autophagic lading. LDH is een stabiel en zeer overvloedig, oplosbaar cytosolische enzym dat is non-selectief afgezonderd in autophagosomes. De hoeveelheid LDH sekwester weerspiegelt dan ook de hoeveelheid bulk autophagic sekwester. Efficiënt en nauwkeurig bepalen van LDH sekwester in cellen, hanteren wij een electrodisruption gebaseerde fractionering protocol dat effectief sedimentable van cytosolische LDH scheidt, gevolgd door meting van enzymatische activiteit in sedimentable breuken versus geheel-celsteekproeven. Autophagic sekwester wordt bepaald door het aantal sedimentable LDH in onbehandelde cellen uit dat in behandelde cellen af te trekken. Het voordeel van de bepaling van de sekwestratie LDH is dat het geeft een kwantitatieve meting van de autophagic sekwestratie van endogene lading, in tegenstelling tot andere methoden dat ofwel ectopische uitdrukking van sekwester sondes of semi-kwantitatieve protease betrekken de analyses van de bescherming van autophagy markeringen of receptoren.

Met behulp van het protocol beschreven hier, bulk autophagic sekwester activiteit in een aantal verschillende zoogdieren cellijnen, met inbegrip van LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, muis embryonale fibroblasten (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ en LNCaP cellen werd gemeten. Sekwester was beoordeeld onder basale omstandigheden (in volledige voedselrijke medium), of in cellen acuut uitgehongerd voor serum en aminozuren (een bona fide autoph...

Watch this Scientific Journal Video about The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay Ã¢â‚¬â€ A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells at 

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Gebruik van de Protease Fluorescerende Detection Kit om Protease activiteit te bepalen

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Monogene Assay: hechtende cellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA&#39;s in zoogdiercellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...