Ce travail a été soutenu financièrement par le Conseil norvégien de la recherche, l’Université d’Oslo, le Anders Jahre Foundation, la Fondation de Nansen et l’héritage dans la mémoire de Henrik Homan. Nous remercions m. Noboru Mizushima pour le ATG5 + / + MEFs et ATG5-/-MEFs, Dr Masaaki Komatsu pour le ATG7 + / + MEFs et ATG7-/-MEFs et Dr Shizuo Akira pour le ATG9A + / + MEFs et ATG9A-/-MEFs. Nous remercions Frank Sætre pour assistance technique et Dr par O. Seglen pour des débats constructifs méthodologiques.

1. cellule ensemencement et traitement
<ol><li>
Cellules adhérentes de la culture dans des flacons de culture de tissu de2 cm 75 dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C, en utilisant le milieu de culture privilégié pour le type de cellule en question. Laissez les cellules jusqu'à ce qu’ils atteignent une couche de cellules de proximité-anastomosé. Remarque : Utiliser un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) pour LNCaP, HEK29...

En résumé, le protocole décrit ici représente une méthode fiable et largement applicable pour surveiller l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères. Par rapport à la méthode originale12,16, nous avons supprimé un certain nombre d’étapes inutiles, simplifié plusieurs des étapes restantes et introduit une substantielle réduction d’échelle. Par conséquent, le protocole est grandement amélioré par rapport...

Autophagie (du grec « se manger ») est un processus évolutif et conservé pour dégradation lysosomale/vacuolaire du matériel intracellulaire. Lors de la découverte des gènes liés autophagie (« ATG »), qui sont importants pour l’autophagie chez les levures et les humains, et la réalisation que l’autophagie joue un rôle important dans la santé humaine et de la maladie (reconnu par le prix Nobel de médecine ou de physiologie à 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagie est rapidement devenu un des procédés plus intensément étudiés en cellule biologie1,2.
Macroautophagy (ci-après dénommé « autophagie ») est caractérisée par l’expansion et pliage de saccules membranaires intracellulaire (« phagophores ») dans des structures scellées, double - ou multi - membrane (« autophagosomes ») séquestrent efficacement le enveloppé de matériel du reste du cytoplasme. Lors de la fusion des autophagosomes avec les lysosomes, la membrane intérieure autophagosomal et la cargaison séquestrée est dégradée et recyclés. Autophagosomes peut piéger le matériel cytoplasmique en aléatoire (autophagie non sélectif) et manières sélectives (autophagie sélective). En vrac autophagie probablement représente un mélange de l’autophagie non-sélective et sélective.
Dans les années 60 et 70 (« l’ère morphologique » de la recherche de l’autophagie), séquestration autophagique a été principalement évaluée au moyen d’analyses ultrastructurales. Dans les années 1980 et au début des années 1990 (« l’ère biochimique ») par Seglen et collègues de travail — qui a étudié l’autophagie dans les hépatocytes primaires de rat — mis au point les premières méthodes pour mesurer quantitativement la séquestration autophagique activité3. À l’aide de ces tests, Seglen défini et caractérise les différentes étapes de la voie autophagique lysosomal4,5, découvert et a inventé l’amphisome6 (le produit de la fusion de l’endosome-autophagosome) et fut le premier à décrire le rôle de la phosphorylation des protéines l’autophagie règlement7. Cependant, après la découverte des ATGs dans les années 1990 (« l’ère moléculaire ») et la première caractérisation d’une protéine ATG8 chez les mammifères, les protéines associées aux microtubules 1 a/1 b-light chain 3 (LC3) 20008, l’utilisation de protéines ATG comme marqueurs pour la processus autophagique rapidement gagné en popularité, et les plus âgés et plus laborieux des méthodes biochimiques ont été laissés. En fait, sur les 18 dernières années, les tache occidentale et les analyses de microscopie de fluorescence de LC3 sont devenues de loin la plus populaire (et dans bien des cas la seule) moyens d’étudier l’autophagie des cellules de mammifères. L’avantage est la facilité par laquelle ces méthodes peuvent être effectuées. L’inconvénient est que l'on étudie un composant du panier (LC3) plutôt que de réel autophagique fret. Il s’agit d’un inconvénient plutôt sérieux, parce que la relation entre les Etats et/ou les flux de LC3 par la voie contre la séquestration et de la cargaison n’est pas très claire. En fait, nous avons montré que le flux de cargaison en vrac peut être maintenue à des niveaux élevés dans des conditions où il n’y a aucun flux LC3, malgré la présence de LC3 conjugués dans les cellules9. En outre, nous avons démontré que l’autophagie en vrac n’est pas affectée par l’appauvrissement LC3 efficace et donc probablement est indépendant du LC39. Cette constatation est confirmée plus tard par LC3 études knock out10,11, qui indiquent également que mitophagy Parkin-dépendante (l’autophagie sélective des mitochondries) est indépendant de LC310,11 .
En résumé, il n’y a absolument besoin pour analyses fret surveiller l’activité de l’autophagie. Façon optimale ces tests devraient être largement applicable, bien définie et facile à exécuter. Au cours de ces dernières années, nous avons pris un intérêt particulier pour le test de fixation du LDH, qui a été développé par Seglen dans les années 198012et repose sur la mesure de la cession de LDH cytosolique à sédimentables, cellule de contenant des vacuoles autophagique fractions. LDH est une protéine cytosolique stable, soluble qui est séquestrée facilement conjointement au moment où phagophores enwrap fret cytoplasmique. Séquestration de LDH est donc une mesure générale de séquestration de l’autophagie. LDH est exclusivement dégradée par la voie autophagique lysosomal12. Ainsi, en présence d’inhibiteurs de dégradation lysosomale, par exemple, bafilomycine A1 (Baf)13, directement les effets du traitement expérimental reflètent altérations dans l’activité de séquestration autophagie. En l’absence d’inhibiteurs de la dégradation, l’effet net des altérations dans la séquestration de la LDH et de la dégradation peut être mesurée.
Le test de fixation du LDH est largement applicable, puisque la LDH s’exprime fortement et de façon ubiquitaire dans tous les types de cellules, et des niveaux LDH peuvent être quantifiées avec précision par un dosage enzymatique14,15. Toutefois, l’original du protocole12 — établi dans les hépatocytes primaires de rat — est plutôt fastidieux et requiert une grande quantité d’à partir de matériel comme un condensateur de décharge électrique sur mesure. De manière progressive, nous avons progressivement transformé l’essai dans une méthode simple et versatile. Tout d’abord, le protocole original a été adapté pour une utilisation dans des cellules de mammifères lignes16. Deuxièmement, la méthode a été substantiellement à échelle réduite de3,9. Troisièmement, plusieurs étapes dans le protocole ont été éliminés, y compris un coussin de densité laborieuse étape17. En même temps, cela a permis une réduction encore plus loin de la méthode, dans le point de départ original d’utiliser une plaque de 10 cm par exemple16 pour utiliser un seul puits d’une plaque de 12 puits par échantillon (soitenviron 15 fois moins à partir le matériel)17. Quatrièmement, nous avons identifié un appareil commercial électroporation qui pourrait remplacer le condensateur de décharge électrique sur mesure17.
Notre protocole à jour de l’essai de fixation du LDH, qui comprend quelques simplifications supplémentaires de la méthode par rapport à la publiées antérieurement17 est présenté ici. En outre, un ensemble de résultats typiques obtenus dans un certain nombre de différents types de cellules s’affiche, et important, plusieurs lignes de validations expérimentales de la méthode à l’aide de knockdown pharmacologique mais aussi génétique et approches knockout sont fournis. Pour un projet global de flux du protocole entier, voir la Figure 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

En vrac autophagie est caractérisée par la séquestration de larges portions du cytoplasme en double/multi-membrane structures appelées autophagosomes. Un protocole simple de contrôler ce processus est décrit ici. En outre, les résultats typiques et validation expérimentale de la méthode dans des conditions inductrices d’autophagie dans divers types de cellules mammifères cultivées sont fournis. Au cours de l’autophagie en vrac, autophagosomes séquestrer le cytosol et aussi des protéines cytosoliques solubles, aux côtés d’autres cargaisons autophagie. LDH est stable et très abondant, soluble enzyme cytosolique qui est non sélective séquestré dans autophagosomes. Le montant de la séquestration du LDH reflète donc la quantité de séquestration autophagique en vrac. Pour efficacement et précisément déterminer la séquestration de LDH dans les cellules, nous utilisons un protocole basé sur electrodisruption de fractionnement qui sépare efficacement sédimentables LDH cytosolique, suivie de la mesure de l’activité enzymatique dans sédimentables fractions par rapport à des échantillons de cellules entières. Séquestration de l’autophagie est déterminée en soustrayant la proportion de sédimentables LDH dans les cellules non traitées que dans les cellules traitées. L’avantage de l’essai de séquestration de LDH est qu’il donne une mesure quantitative de la séquestration autophagique du fret endogène, par opposition à d’autres méthodes que soit impliquent l’expression ectopique de sondes de séquestration ou semi-quantitatifs protéase analyses de la protection des récepteurs ou des marqueurs de l’autophagie.

En utilisant le protocole décrit ici, activité autophagique séquestration en vrac dans un certain nombre de lignées cellulaires chez les mammifères, y compris LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, T47D, U2OS, PC3, MCF-7, G361, (MEFs) les fibroblastes embryonnaires de souris, pre-1, On a mesuré les cellules HEK293, BJ et LNCaP. Sequestration a été évaluée dans les conditions basales (dans un milieu complet, riche en nutriments), ou dans les cellules aiguë affamée...

Watch this Scientific Journal Video about The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay Ã¢â‚¬â€ A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells at 

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

Un protocole simple et bien validé pour mesurer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères est décrit ici. La méthode est basée sur la quantification de la proportion de la lactate déshydrogénase (LDH) dans les fractions de cellules sédimentables par rapport aux niveaux LDH cellulaires totales.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Recherche

Biologie

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

L&#39;utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l&#39;activité de protéase

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Test clonogénique: cellules adhérentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Un test basé sur Matrigel Tube Formation d&#39;évaluer l&#39;activité Vasculogenic de cellules tumorales

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Cellules de mammifères autonome bioluminescentes pour la surveillance continue et en temps réel de la cytotoxicité

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Méthode simple pour l&#39;ADN fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation des chromosomes écrasé

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...