Diese Arbeit wurde von Research Council of Norway, der Universität von Oslo, Anders Jahre Foundation, der Nansen-Stiftung und das Erbe in der Erinnerung an Henrik Homan finanziell unterstützt. Wir danken Dr. Noboru Mizushima für die ATG5 + / + MEFs und ATG5/MEFs, Dr. Masaaki Komatsu für die ATG7 + / + MEFs und ATG7/MEFs und Dr. Shizuo Akira für die ATG9A + / + MEFs und ATG9A/MEFs. Wir danken Frank Sætre für technische Hilfe und Dr. pro O. Seglen für konstruktive methodische Diskussionen.

(1) Zelle Aussaat und Behandlung
<ol><li>
Kultur adhärente Zellen in 75 cm2 Gewebe Kulturflaschen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C, mit dem bevorzugten Kulturmedium für den Zelltyp in Frage. Können Sie die Zellen wachsen, bis sie eine in der Nähe von Zusammenfluss Zellschicht erreichen. Hinweis: Verwenden Sie RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) für LNCaP, HEK293, Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs), BJ, MCF-7 und RPE-1-Zell...

Zusammenfassend lässt sich sagen ist das Protokoll hier beschrieben eine zuverlässigere und vielseitig einsetzbar-Methode, um lose selbstverdauende Sequestrierung in Säugetierzellen zu überwachen. Im Vergleich zu der ursprünglichen Methode12,16, haben wir etliche unnötige Schritte entfernt, einige der verbleibenden Schritte vereinfacht und eingeführt, eine erhebliche Herabsetzung. Infolgedessen das Protokoll in Bezug auf Kosten und Zeit-Effizienz erheblich...

Autophagie (griechisch für "Self-Essen") ist ein evolutionärer konservierten Prozess für vacuolar/lysosomalen Abbau der intrazellulären Material. Nach der Entdeckung der Autophagie-bezogene ("ATG") Gene, die für Autophagie in Hefe und Menschen wichtig sind, und die Erkenntnis, dass Autophagie spielt eine bedeutende Rolle in Gesundheit und Krankheit (anerkannt durch die 2016 den Nobelpreis für Medizin oder Physiologie Yoshinori Ohsumi), Autophagie ist eines der am intensivsten untersuchten Prozesse in der Zelle Biologie1,2schnell geworden.
Macroautophagy (nachfolgend "Autophagie") ist geprägt durch den Ausbau und Faltung der intrazellulären Membran Cisternen ("Phagophores") in versiegelten, Doppel oder membrane Strukturen ("autophagosom"), die effektiv absondern der eingehüllt Material vom Rest des Zytoplasmas. Bei der Verschmelzung von autophagosom mit Lysosomen ist die innere Autophagosomal Membran und die abgesonderten Ladung abgebaut und recycelt. Autophagosom kann zytoplasmatischen Material in zufälligen (nicht-selektiven Autophagie) und selektive (selektiven Autophagie) Manieren sequester. Bulk Autophagie am wahrscheinlichsten ist eine Mischung von nicht-selektiven und selektiven Autophagie.
In den 1960er und 70er Jahre ("die morphologische Ära" der Autophagie Forschung) wurde selbstverdauende Sequestrierung hauptsächlich durch Ultrastrukturforschung Analysen beurteilt. In den 1980er Jahren und Anfang der 90er Jahre ("der biochemischen Ära") pro Seglen und Mitarbeitern – der Autophagie in primären Ratte Hepatocytes studiert – entwickelt die ersten Methoden zur Messung quantitativ selbstverdauende Sequestrierung Aktivität3. Mit diesen Tests, Seglen definiert und charakterisiert die verschiedenen Schritte der selbstverdauende lysosomalen Pathway4,5, entdeckt und prägte die Amphisome6 (das Produkt der Fusion Endosom-Autophagosome) und war der erste beschreiben Sie die Rolle der Protein-Phosphorylierung Autophagie Verordnung7. Jedoch nach der Entdeckung der Stuka in den 1990 ("Molekulare Zeitalter") und die erste Charakterisierung eines Säugetiers ATG8 Proteins, Mikrotubuli-assoziierten Protein 1A/1 b-Light chain 3 (LC3) im Jahr 20008, die Verwendung von ATG Proteine als Marker für die selbstverdauende Prozess schnell an Popularität gewann, und der älteren und mühsamen biochemischen Methoden wurden zurückgelassen. In der Tat über die letzten 18 Jahre, western-Blot und Fluoreszenz-Mikroskopie-Analysen der LC3 geworden die mit Abstand beliebteste (und in vielen Fällen die einzige) Mittel der Autophagie in Säugetierzellen zu studieren. Der Vorteil ist die relative Leichtigkeit, mit der diese Methoden durchgeführt werden können. Der Nachteil ist, dass man eine Warenkorb-Komponente (LC3) anstatt tatsächliche selbstverdauende Fracht studiert. Dies ist ein ziemlich gravierender Nachteil, da die Beziehung zwischen den Staaten und/oder Fluss der LC3 durch den Weg gegen die Sequestrierung und Flussmittel Ladung sehr unklar ist. In der Tat haben wir gezeigt, dass Bulk Cargo Flussmittel auf hohem Niveau unter Bedingungen aufrechterhalten werden kann wo es keine LC3 Flussmittel, trotz der Anwesenheit von konjugierten LC3 in den Zellen9. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass Bulk Autophagie ist unbeeinflusst von effizienten LC3 Erschöpfung und somit wahrscheinlich LC3-unabhängige9. Dieser Befund wurde später bestätigt durch LC3 Knock-out-Studien10,11, in dem auch angeben, dass Parkin-abhängige Mitophagy (der selektiven Autophagie der Mitochondrien) unabhängig von LC310,11 .
Zusammenfassend lässt sich sagen, es ist ein klares muss für Fracht-based Assays, selbstverdauende Aktivitäten zu überwachen. Solche Tests sollte optimal breit anwendbar, gut definierten und leicht durchzuführen. In den letzten Jahren haben wir ein besonderes Interesse an der LDH-Sequestrierung Assay getroffen, die war in den 1980er Jahren12von pro Seglen entwickelt und basiert auf der Messung der Übertragung der cytosolischen LDH, Sedimentable, selbstverdauende Vakuole-haltigen Zelle Brüche. LDH ist ein stabiles, lösliche cytosolischen Protein, das bereitwillig Co abgesondert ist, wenn Phagophores zytoplasmatischen Fracht Einhüllen. Sequestrierung von LDH ist daher ein allgemeines Maß für selbstverdauende Sequestrierung. LDH wird ausschließlich durch die selbstverdauende lysosomalen Pathway12abgebaut. Also, im Beisein von lysosomalen Abbau-Inhibitoren, z. B. Bafilomycin A1 (Baf)13, experimentelle behandlungseffekte direkt Änderungen in selbstverdauende Sequestrierung Aktivität widerspiegeln. In Ermangelung von Abbau-Inhibitoren kann der Netto-Effekt der Änderungen in LDH-Sequestrierung und Abbau gemessen werden.
Die LDH-Sequestrierung Assay ist breit anwendbar, da LDH hoch und ubiquitär sich in alle Zelltypen drückt und LDH Niveaus durch eine enzymatische Assays14,15genau quantifiziert werden können. Aber das Original Protokoll12 — primäre Ratte Hepatocytes gegründet – war ziemlich zeitaufwändig und erforderte ein hohes Maß an Material sowie eine maßgeschneiderte elektrische Entladung Kondensator. In gewissem Sinne schrittweise haben wir eine einfache und vielseitige Methode allmählich Assays umgewandelt. Erstens war das ursprüngliche Protokoll für den Einsatz in Säugetierzellen Linien16angepasst. Zweitens war die Methode wesentlich herunterskalierten3,9. Dritte, mehrere Schritte im Protokoll wurden eliminiert, einschließlich ein mühsamer Dichte Polster Schritt17. Dies ermöglichte gleichzeitig eine noch weiter verkleinern der Methode, aus der ursprünglichen Ausgangspunkt mit einem 10 cm Teller pro Probe16 mit einem einzigen Brunnen aus einer 12-Well-Platte pro Probe (d.h.ca. 15-fold weniger ab Material)17. Viertens haben wir eine kommerzielle Elektroporation-Apparat, der die maßgeschneiderte elektrische Entladung Kondensator17ersetzen könnte.
Hier ist unsere aktuelle Protokoll des LDH-Sequestrierung Assays, enthält einige weiteren Vereinfachungen des Verfahrens im Vergleich zu den bisher veröffentlichten17 vorgestellt. Darüber hinaus eine Reihe von typischen Ergebnisse in einer Reihe von verschiedenen Zelltypen wird angezeigt, und wichtig ist, mehrere Textzeilen experimentelle Validierung der Methode mit pharmakologischen sowie genetische Zuschlag und Ko-Ansätze zur Verfügung gestellt. Ein Fluss Gesamtschema das ganze Protokoll Siehe Bild 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

Bulk Autophagie zeichnet sich durch die Sequestrierung große Teile der Zytoplasma in Doppel/multi-membrane Strukturen bezeichnet autophagosom. Hier ist ein einfaches Protokoll zur Überwachung dieses Prozesses beschrieben. Darüber hinaus sind typische Ergebnisse und experimentelle Validierung der Methode Autophagie-induzierenden Bedingungen in den verschiedenen Arten von kultivierten Säugerzellen vorgesehen. Während der Großteil Autophagie sequester autophagosom Zytosol, und damit auch lösliche cytosolischen Proteine, neben anderen selbstverdauende Ladung. LDH ist eine stabile und sehr reichlich, lösliche cytosolische Enzym, das nicht selektiv in autophagosom abgesondert wird. Die Höhe der LDH-Sequestrierung spiegelt daher die Menge an Masse selbstverdauende Sequestrierung. Um effizient und präzise LDH-Sequestrierung in Zellen bestimmen, setzen wir eine Electrodisruption-basierte Fraktionierung-Protokoll, die effektiv Sedimentable trennt sich von zytosolischen LDH, gefolgt durch eine Messung der Enzymaktivität in sedimentable Brüche im Vergleich zu ganzen Zellproben. Selbstverdauende-Sequestrierung wird durch Subtraktion des Anteils der Sedimentable LDH in den unbehandelten Zellen aus, dass im behandelten Zellen bestimmt. Der Vorteil des LDH-Sequestrierung Tests ist, dass es einem quantitativen Maß für die selbstverdauende Sequestrierung von endogenen Cargo, im Gegensatz zu anderen Methoden, dass entweder ektopische Expression von Sequestrierung Sonden oder semi-quantitativen Protease einbeziehen Schutz-Analysen der Autophagie Marker oder Rezeptoren.

Mit dem Protokoll beschrieben hier, Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in einer Reihe von verschiedenen Säugetieren Zelllinien, einschließlich LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, T47D, U2OS, PC3, MCF-7, G361, Maus embryonale Fibroblasten (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ und LNCaP Zellen gemessen wurde. Sequestrierung war unter basalen Bedingungen (im kompletten, nährstoffreichen Medium) bewertet, oder in Zellen verhungert akut für Serum und Aminosäuren (eine <...

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The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

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The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

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Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

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Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...