עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מועצת המחקר של נורבגיה, אוניברסיטת אוסלו, קרן Jahre אנדרס, קרן Nansen, המורשת לזכרו של הנריק Homan. אנו מודים ד ר Mizushima נובורו עבור ATG5 + / + MEFs ו- ATG5-/-MEFs, ד ר מסאקי Komatsu עבור ATG7 + / + MEFs ATG7/MEFs, ואת ד ר אקירה שיזואו עבור ATG9A + / + MEFs ו- ATG9A/MEFs. אנו מודים Sætre פרנק סיוע טכני, ד ר לכל O. Seglen על דיונים מועילים מתודולוגי.

1. תא זריעה וטיפול
<ol><li>
התרבות תאים חסיד ב- 75 ס מ2 תרביות רקמה מבחנות ב חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס, תוך שימוש באמצעי תרבות מועדפת עבור סוג התא המדובר. מאפשרים לתאים לגדול עד שיגיעו שכבה תא בקרבת מקום ל- confluent. הערה: השתמש בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עוברית שור נסיוב (FBS) L...

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה אמינה החלים נרחב כדי לעקוב אחר פעילות פחמיות autophagic בתפזורת בתאי יונקים. לעומת ה12,המקורי שיטת16, יש להסיר מספר צעדים מיותרים, פשוטה מספר השלבים הנותרים, ואנו הציג downscaling משמעותית. כתוצאה מכך, הפרוטוקול זה השתפר מאוד ביחס...

Autophagy (מיוונית "עצמי אוכל") היא תהליך ההכפלה אבולוציונית על השפלה vacuolar/lysosomal של חומר תאיים. על גילוי של גנים הקשורים autophagy ("ATG"), אשר חשובים עבור autophagy שמרים ובבני אדם, המימוש autophagy הזה משחק תפקיד משמעותי (הכיר בכך 2016 הנובל ברפואה או פיזיולוגיה כדי מחלה ובריאות האדם Yoshinori Ohsumi), autophagy הפך במהירות אחד מהתהליכים הכי בעוצמה למדה תא ביולוגיה1,2.
Macroautophagy (ןלהל "autophagy") הוא מאופיין על ידי ההרחבה, מתקפלים של קרום תאיים cisternae ("phagophores") לתוך חסומות, membrane כפול או ריבוי במבנים ("autophagosomes") sequester ביעילות חומר enwrapped משאר הציטופלסמה. על היתוך של autophagosomes עם lysosomes, קרום autophagosomal הפנימי ואת המטען מוחרמת מושפל, ממוחזר. Autophagosomes יכולים sequester חומר cytoplasmic אקראי (autophagy לא בררניים) והן נימוסים סלקטיבית (autophagy סלקטיבי). בתפזורת autophagy קרוב לוודאי מייצגת שילוב של autophagy לא בררניים, סלקטיבי.
ב שנות ה-60 וה-70 ("מורפולוגי עידן" autophagy מחקר), autophagic פחמיות הוערכה בעיקר באמצעות ניתוחים ultrastructural. בשנות השמונים ובתחילת שנות התשעים ("התקופה הביוכימי") לכל Seglen ועמיתים — מי למד autophagy בשנת החולדה הראשית hepatocytes — פיתח את השיטות הראשונות למדוד באופן כמותי את פעילות פחמיות autophagic3. באמצעות מבחני אלה, Seglen מוגדרת, מאופיין שלבים שונים של4,autophagic-lysosomal מסלול5גילה, טבע amphisome6 (התוצר של פיוז'ן אנדוזום-autophagosome), היה הראשון תאר את התפקיד של זירחון חלבונים ב autophagy בתקנה7. עם זאת, לאחר גילוי ATGs של 1990 ("התקופה מולקולרי"), אפיון חלבון ATG8 בתרבית של הראשון, חלבונים הקשורים microtubule 1A/1B-אור שרשרת 3 (LC3) ב- 20008, השימוש של חלבונים ATG כסמני עבור תהליך autophagic במהירות לפופולריות, שיטות ביוכימיות יותר מפרך ושנמצאת הושארו מאחור. למעשה, במהלך 18 השנים האחרונות, תספיג וניתוחים פלורסצנטיות מיקרוסקופיה של LC3 הפכו הפופולרי ביותר עד כה (ובמקרים רבים היחידה) פירושו של הלומדים autophagy בתאי יונקים. היתרון הוא הקלות שבה שיטות אלה יכול להתבצע. החיסרון הוא שזה הוא לומד מרכיב עגלה (LC3) במקום מטען autophagic בפועל. זה חיסרון די רציני, כי היחסים בין מדינות ו/או של שטף של LC3 דרך בשביל לעומת פחמיות, שטף של מטענים מאוד לא ברור. למעשה, אנחנו הראו כי שטף מטענים בצובר יכול להישמר ברמה גבוהה בתנאים שבו יש שטף LC3 אין, למרות נוכחותם של LC3 מצומדת ב9תאים. יתר על כן, אנו הפגינו autophagy בצובר הזה הוא לא מושפע על ידי דלדול LC3 יעיל, ולכן סביר שאינו תלוי-LC39. ממצא זה אושר מאוחר יותר על ידי LC3 מעלף מחקרים10,11, אשר גם עולה כי mitophagy תלויי-פרקין (autophagy סלקטיבי של המיטוכונדריה) היא עצמאית של LC310,11 .
לסיכום, יש ברור הצורך מבוסס-מטען מבחני לעקוב אחר פעילות autophagic. בצורה אופטימלית מבחני כזה צריך להיות בהרחבה ישימים, מוגדרים היטב וקל לביצוע. במהלך השנים האחרונות לקחנו את עניין מסוים וזמינותו פחמיות LDH, אשר פותחה על ידי לכל Seglen ב-198012, והיא מבוססת על מדידת ההעברה של cytosolic LDH כדי sedimentable, autophagic המכילים חלולית התא שברים. LDH הוא חלבון cytosolic יציב, מסיסים זה הוא ברצון משותפת מבודד כאשר phagophores שלכדו cytoplasmic מטענים. פחמיות של LDH לכן מדד כללי של פחמיות autophagic. LDH יורד באופן בלעדי על ידי שביל autophagic-lysosomal12. לפיכך, בנוכחות השפלה lysosomal מעכבי, למשל, bafilomycin A1 (Baf)13, טיפול ניסיוני השפעות ישירות לשקף שינויים בפעילות פחמיות autophagic. בהיעדרו של מעכבי השפלה, ניתן למדוד את השפעת שינויים ב- LDH פחמיות והשפלה נטו.
LDH פחמיות וזמינותו ישימה באופן כללי, כיוון LDH מאוד, ubiquitously מתבטא בכל סוגי התאים, LDH רמות ניתן לכמת במדויק על ידי מטוס14,assay אנזימטי15. עם זאת, המקורי פרוטוקול12 – נוסדה בשנת החולדה הראשית hepatocytes — היה במקום זמן רב והוא נדרש כמות גבוהה של החל בחומר, כמו גם קבל פריקה חשמלית בהזמנה אישית. באופן הדרגתיים, לנו יש בהדרגה הפך וזמינותו שיטה קלה ופסיביות. ראשית, הפרוטוקול המקורי הותאם לשימוש בתרבית של תאים שורות16. שנית, שיטת הפעולה היתה באופן משמעותי downscaled3,9. השלישי, מספר שלבים בפרוטוקול חוסלו, כולל כרית צפיפות מפרך בשלב17. זה מופעל בו זמנית של עוד יותר downscaling של השיטה, מנקודת ההתחלה המקורית של שימוש צלחת 10 ס מ לכל דגימה16 באמצעות לבאר בודדת מצלחת 12-טוב עבור דגימה (כלומר, כ 15-fold החל פחות חומר)17. רביעית, זיהינו מנגנון אלקטרופורציה מסחרי שיכול להחליף קבל פריקה חשמלית בהזמנה אישית17.
כאן מוצג שלנו פרוטוקול העדכנית ביותר של LDH פחמיות וזמינותו, הכולל כמה העבודה נוסף של השיטה לעומת ה-17 שפורסמו בעבר. יתר על כן, ערכה של טיפוסי התוצאות המתקבלות מספר סוגי התאים מוצג, חשוב, שורות מרובות של אימותים ניסיוניים של השיטה באמצעות נוקאאוט תרופתי, כמו גם גנטי וגישות נוק אאוט הינם מסופקים. לקבלת לסכימת הזרימה הכללית של פרוטוקול שלם, ראה איור 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

תפזורת autophagy מאופיין על ידי פחמיות של חלקים גדולים של הציטופלסמה למבנים כפול/מולטי-membrane הנקרא autophagosomes. כאן מתואר פרוטוקול פשוט לעקוב אחר תהליך זה. יתר על כן, תוצאות טיפוסי ובדיקת ניסיוני של השיטה בתנאים בתדר autophagy מסוגים שונים בתרבית של תאים בתרבית הינם מסופקים. במהלך autophagy בתפזורת, autophagosomes sequester ציטוזול, ובכך גם חלבונים מסיסים cytosolic, לצד אחרים מטען autophagic. LDH הינה יציב מאוד אנזים cytosolic שופע, מסיסים שאינם סלקטיבי. מבודד לתוך autophagosomes. הכמות של LDH פחמיות ולכן משקף את כמות פחמיות autophagic בתפזורת. ביעילות ובדייקנות לקבוע LDH פחמיות בתאים, אנחנו מעסיקים פרוטוקול מבוסס electrodisruption fractionation המפריד ביעילות sedimentable LDH cytosolic, ואחריו מדידה של פעילות אנזימטי sedimentable שברים לעומת דגימות תאים שלמים. Autophagic פחמיות נקבע על ידי הפחתת שיעור sedimentable LDH בתאים לא מטופל מתאי שטופלו בתוך זה. היתרון של LDH פחמיות וזמינותו היא כי זה נותן מדד כמותי פחמיות autophagic של מטענים אנדוגני, לעומת שיטות אחרות גם לערב ביטוי חוץ רחמי של הגששים פחמיות או פרוטאז הכמותיים למחצה ניתוחים הגנה של סמנים autophagy או קולטנים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, נפח פעילות פחמיות autophagic במספר קווים שונים בתרבית של תאים, כולל LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, הלה, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs), RPE-1. תאים HEK293, בי ג'יי ו LNCaP נמדדה. פחמיות היה מוערך בתנאים הבזליים (ב מלאה, עשירות בינוני), או בתאים בחריפות ב?...

Watch this Scientific Journal Video about The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay Ã¢â‚¬â€ A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells at 

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...