이 작품 연구 위원회 노르웨이, 오슬로의 대학, 앤 더 스 년 재단, 난센 재단, 그리고 헨릭 Homan의 메모리에 유산에 의해 재정적으로 지원 되었다. 우리 박사 벅 미즈시마는 ATG5에 대 한 감사 + + MEFs와 ATG5-/-MEFs, 박사 마사 아키 고마쓰는 ATG7에 대 한 + + MEFs 및 ATG7/MEFs, 및 박사 시즈 아키라는 ATG9A에 대 한 + + MEFs 및 ATG9A/MEFs. 우리는 건설적인 방법 론 적 토론에 대 한 기술 지원과 O. Seglen 당 박사에 대 한 프랭크 Sætre을 감사합니다.

1. 셀 시드 및 치료
<ol><li>
셀에 대 한 선호 문화 매체를 사용 하 여 37 ℃에서 5% CO2 습도 인큐베이터에서 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 문화 부착 셀에 입력 합니다. 근처 합칠 셀 계층에 도달할 때까지 성장 하는 세포 수 있습니다. 참고: 사용 하 여 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) LNCaP, HEK293, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), 비제이에 대 한 보충 RPMI 1640 매체 MCF-7 및 RPE-1...

요약, 여기에 설명 된 프로토콜 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 모니터링 하는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 메서드를 나타냅니다. 원래 방법12,16에 비해, 우리 몇 가지 불필요 한 단계를 제거, 몇몇 나머지 단계를 단순화 하 고 상당한 상세화 도입. 결과적으로, 프로토콜은 크게 관련 비용 및 시간-효율성, 향상 하 고 같은 양의 샘플 이제 원...

Autophagy ("먹는 자"에 대 한 그리스어) 세포내 물질의 vacuolar lysosomal 저하에 대 한 진화 보존된 과정 이다. 효 모와 인간 autophagy 중요 autophagy 관련 ("ATG") 유전자의 발견 즉시 실현 그 autophagy 인류 건강 및 질병 (의학 또는 생리학에 있는 노벨상 2016에 의해 인정에 중요 한 역할을 담당 요시노 리 Ohsumi) autophagy 빠르게 되고있다 세포 생물학1,2에서 가장 심각 하 게 공부 과정 중 하나.
Macroautophagy ("autophagy" 라 함)은와 효과적으로 격리 하는, 이중 또는 다중 membrane 구조 ("autophagosomes")에 세포내 막 cisternae ("phagophores")의 접는 확장 특징은 휩 싸이 세포질의 나머지에서 자료. Autophagosomes와 리소좀의 융합에 내부 autophagosomal 막과 분리 된 화물은 저하 고 재활용. Autophagosomes 무작위 (비 선택적 autophagy)와 선택적 (선별 autophagy) 매너 세포질 물질을 격리 수 있습니다. 대량 autophagy 대부분 비 선택적이 고 선택적 autophagy의 혼합을 나타냅니다.
1960 년대와 70 년대 ("형태"의 시대 autophagy 연구)에서 autophagic 격리 주로 ultrastructural 분석을 통해 평가 했다. 1980 년대에서 1990 년대 ("생 화 확 적인 시대") 당 Seglen와 동료의 시작-누가 주 쥐 hepatocytes에서 autophagy 공부-양적 autophagic 격리 활동3를 측정 하는 첫 번째 방법을 개발. 이 분석 실험을 사용 하 여, Seglen 정의 autophagic lysosomal 통로가4,5의 다른 단계를 특징, 발견 만들어낸 amphisome6 (endosome autophagosome 퓨전의 제품), 그리고 처음 autophagy 조절7인 산화 단백질의 역할을 설명 합니다. 그러나, 1990 년대에서 ATGs ("분자 시대")의 발견과 포유류 ATG8 단백질의 첫 번째 특성, 후 microtubule 관련 단백질 1A/1B-라이트 체인 3 (LC3) 20008, ATG 단백질에 대 한 표식으로의 사용에에서는 autophagic 과정 신속 하 게 얻은 인기, 그리고 더 오래 되 고 더 힘 드는 생 화 확 적인 방법 뒤에 남았다. 사실, 지난 18 년 동안, 서쪽 오 점 및 LC3의 형광 현미경 분석 되었다 지금까지 가장 인기 있는 (그리고 많은 경우에) 공부 하는 포유류 세포에서 autophagy의 의미. 장점은 상대적으로 완화는 이러한 방법을 밖으로 실행 될 수 있다입니다. 단점은 저거 카트 구성 요소 (LC3)을 공부 하 고 실제 autophagic 화물 보다는. 이 상태 또는 격리 대 통로 통해 LC3의 유량과 화물의 유량의 관계를 매우 명확 하지 때문에 오히려 심각한 단점입니다. 사실, 우리는 대량 화물 유동 조건에서 높은 수준에서 유지 될 수 있다 나타났습니다 셀9에 활용 된 LC3의 존재에도 불구 하 고 아무 LC3 플럭스입니다. 또한, 우리는 대량 autophagy 효율적인 LC3 고갈에 의해 영향을 받지 않습니다 이며 따라서 가능성이 LC3 독립적인9시연. 이 찾는 나중 LC3 노크 아웃 연구10,11, 또한 나타낼 Parkin 종속 mitophagy (미토 콘 드리 아의 선택적 autophagy) LC310,11의 독립에 의해 확인 됐다 .
요약 하자면, 분명 있다 autophagic 활동을 모니터링 하 화물 기반 분석에 대 한 필요. 최적으로 적용, 정의 그리고 수행 하기 쉬운 이러한 분석 광범위 하 게 되어야 합니다. 지난 몇 년 동안 우리는 198012, 당 Seglen에 의해 개발 되었다 sedimentable, autophagic 공포 포함 된 셀을 cytosolic LDH의 전송 측정 기반 LDH 격리 분석 결과에 특별 한 관심을가지고 분수입니다. LDH는 안정, 수용 성 cytosolic 단백질 phagophores enwrap 세포질 화물 때에 압수 쉽게 공동. LDH의 격리 따라서 autophagic 격리의 일반적인 척도 이다. LDH는 autophagic lysosomal 통로가12에 의해 독점적으로 저하 됩니다. 따라서, lysosomal 저하 억제제, 예를 들어, bafilomycin A1 존재 (Baf)13, 실험적인 치료 효과 직접 autophagic 격리 활동에 변경 반영. 저하 억제제의 부재, LDH 격리와 저하에 변경의 그물 효과 측정할 수 있습니다.
LDH는 매우 고 편 모든 세포 유형에 표현 때문에 효소 분석 결과14,15LDH 수준을 정확 하 게 정해질 수 LDH 격리 분석 결과 광범위 하 게 적용 됩니다. 그러나, 원래12 프로토콜-기본 쥐 hepatocytes에 설립-오히려 소모 되었고 시작 물자로 만든 전기 방전 커패시터의 높은 금액을 요구. 단계별 방식으로, 우리는 점차적으로 변형 분석 결과 쉽고 다양 한 방법으로. 첫째, 원래 프로토콜 포유류 세포 라인16에 사용 하기 위해 적응 시켰다. 둘째, 방법은 실질적으로 downscaled3,9이었다. 셋째, 프로토콜의 여러 단계에서 탈락 했다,17단계 힘 드는 밀도 쿠션을 포함 하 여. 이 동시에 샘플 (즉, 적은 약 15 시작 당 12-잘 접시에서 한 우물을 사용 하 여 샘플16 당 10 cm 접시를 사용 하 여 원래 시작 지점에서 메서드의 더욱 상세화를 사용 소재)17. 넷째, 우리는 주문 품 전기 방전 커패시터17를 대체할 수 있는 상업 electroporation 기구 발견.
여기 우리의 최신 프로토콜의 LDH 격리 분석 결과, 이전에 게시17 비교 방법의 몇 가지 더 단순화를 포함 하는 제공 됩니다. 또한, 다른 세포 유형의 수에서 얻은 전형적인 결과 집합이 표시 되 고 중요 한 것은, 유전자 뿐 아니라 약리 최저 및 녹아웃 접근을 사용 하 여 메서드의 실험적인 검증의 여러 줄 제공 됩니다. 전체 프로토콜의 전체 흐름 체계를 위해 그림 1을 참조 하십시오.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

대량 autophagy 더블/멀티 membrane 구조에 autophagosomes 되 나 큰 부분의 세포질의 격리에 의해 특징입니다. 여기이 프로세스를 모니터링 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 일반적인 결과 및 경작된 한 포유류 세포의 다양 한 종류에서 autophagy 유도 조건 방법의 실험적인 검증 제공 됩니다. 대량 autophagy, 동안 autophagosomes cytosol, 그리고 그로 인하여 또한 다른 autophagic 화물 함께 녹는 cytosolic 단백질 격리. LDH는 안정적이 고 높은 비 선택적으로 autophagosomes에 분리 된 풍부 하 고, 녹는 cytosolic 효소 이다. LDH 격리의 양에 따라서 대량 autophagic 격리의 양을 반영합니다. 우리 cytosolic LDH, sedimentable의 효소 활동의 측정에 의해 뒤에서 sedimentable를 효과적으로 분리 하는 분류 electrodisruption-기반 프로토콜을 사용 하는 효율적이 고 정확 하 게 확인 하려면 LDH 격리 셀에, 전체 셀 샘플 대의 분수 Autophagic 격리 sedimentable 그에서 치료 세포 치료 셀에 LDH의 비율을 빼서 결정 됩니다. LDH 격리 분석 결과의 장점은 그것은 다른 방법에 반대 생 화물의 autophagic 격리의 양적 측정 하거나 격리 프로브 또는 반 양적 protease의 소성 식 포함 제공 autophagy 마커 또는 수용 체의 보호 분석입니다.

프로토콜을 사용 하 여 여기에 설명 된, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, 헬러, VCaP, H3122, Hec1A를 포함 하 여 다른 포유류 세포 선의 수에 대량 autophagic 격리 활동 MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ, 및 LNCaP 세포 측정 했다. 격리 (에 완전 한, 영양분이 풍부한 매체), 기저 조건 평가 또는 셀에 심하게 굶 어 혈 청 및 아미노산 (한 보 나 fide autophagy...

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The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

연구

생물학

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...