Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Norges forskningsråd, Universitetet i Oslo, Anders Jahres Foundation, Nansen grunnlaget og arven i minnet til Henrik Homan. Vi takker Dr. Noboru Mizushima for ATG5 +/ + MEFs og ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu for ATG7 +/ + MEFs og ATG7/MEFs og Dr. Shizuo Akira for ATG9A +/ + MEFs og ATG9A/MEFs. Vi takker Frank Sætre for teknisk assistanse, og Dr. Per O. Seglen for konstruktiv metodologiske diskusjoner.

1. celle såing og behandling
<ol><li>
Kultur tilhenger cellene i 75 cm2 vev kultur flasker i en fuktet inkubator med 5% CO2 på 37 ° C med den foretrukne kultur mediet for den aktuelle cellen. At cellene å vokse til de når en nær confluent celle lag. Merk: Bruk RPMI 1640 medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) for LNCaP, HEK293, mus embryonale fibroblaster (MEFs), BJ, MCF-7 og RPE-1 celler.<ol>
<li>Vask cellene med 3 mL 37 ° C fosfat-bufret saltvann (PBS), pH 7.4. Erst...

Oppsummert representerer protokollen beskrevet her en pålitelig og allment gjeldende metode å overvåke bulk autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller. Sammenlignet med den opprinnelige metoden12,16, har vi fjernet en rekke unødvendige trinn, forenklet flere av de gjenværende trinnene og introduserte en betydelig avskalling. Resultatet protokollen er kraftig forbedret i forhold til pris - og time-effektivitet, og samme mengde prøver kan nå håndteres p?...

Autophagy (gresk for «Self-spising») er en bevart evolusjonsprosessen for mer/lysosomale nedbrytning av intracellulær materiale. Etter oppdagelsen av autophagy-relaterte ("ATG") genene, som er viktig for autophagy i gjær og mennesker, og realisering at autophagy spiller en viktig rolle i helse og sykdom (anerkjent av Nobelprisen i medisin eller fysiologi til i 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagy har raskt blitt en av de mest intenst studerte prosessene i cellen biologi1,2.
Macroautophagy (heretter kalt "autophagy") er preget av utvidelse og folding av intracellulær membran cisternae ("phagophores") i forseglet, dobbel - eller multi - membrane strukturer ("autophagosomes") som effektivt beslaglegge det enwrapped materiale fra resten av cytoplasma. Ved blanding av autophagosomes med lysosomer, er indre autophagosomal membranen og sequestered lasten degradert og resirkulert. Autophagosomes kan beslaglegge cytoplasmatiske materiale i både tilfeldig (ikke-selektive autophagy) og selektiv (selektiv autophagy) oppførsel. Bulk autophagy mest sannsynlig representerer en blanding av ikke-selektive og selektive autophagy.
I 1960 og 70-tallet («morfologiske æra"av autophagy forskning), ble autophagic lagring hovedsakelig vurdert gjennom ultrastructural analyser. På 1980-tallet og begynnelsen av 1990-tallet («den biokjemiske era") Per Seglen og kolleger, som studerte autophagy i primære rotte hepatocytter-utviklet første metodene kvantitativt mål autophagic lagring aktivitet3. Bruker disse analyser, Seglen definert og preget forskjellige trinnene av autophagic-lysosomale veien4,5, oppdaget skapt amphisome6 (produktet av endosome-autophagosome fusion) og var først Beskriv rollen protein fosforylering i autophagy regulering7. Men etter oppdagelsen av ATGs på 1990-tallet («den molekylære era") og første karakterisering av et pattedyr ATG8 protein, microtubule-assosiert protein 1A/1B-lys kjeden 3 (LC3) i 20008, bruk av ATG proteiner som markører for den autophagic prosessen raskt vunnet popularitet, og de eldre og mer arbeidskrevende biokjemiske metodene ble igjen. Faktisk over de siste 18 år og western blot fluorescens mikroskopi analyser av LC3 har blitt den desidert mest populære (og i mange tilfeller den eneste) måte å studere autophagy i pattedyrceller. Fordelen er det er relative enkelt som disse metodene kan utføres. Ulempen er at man studerer en handlevogn komponent (LC3) i stedet for faktiske autophagic Last. Dette er en ganske alvorlig ulempe, fordi forholdet mellom USA og/eller fluks av LC3 gjennom sti mot lagring og fluks av Last er svært uklart. Faktisk vi har vist at bulk Last flux kan opprettholdes på høye nivåer under forhold der det er ingen LC3 forandring, til tross for tilstedeværelsen av konjugert LC3 i cellene9. Videre viste vi at bulk autophagy påvirkes ikke av effektiv LC3 utarming, og dermed sannsynligvis er uavhengig av LC39. Dette funnet har senere blitt bekreftet av LC3 bank-out studier10,11, som også indikere at Parkin-avhengige mitophagy (den selektive autophagy i mitokondrier) er uavhengig av LC310,11 .
I sammendraget, det er et klart behov for Last-baserte analyser å overvåke autophagic aktivitet. Optimalt bør slike analyser være bredt aktuelt, veldefinerte og lett å utføre. De siste årene har vi tatt en spesiell interesse LDH lagring analysen, som ble utviklet av Per Seglen i 198012, og er basert på måling overføring av cytosolic LDH til sedimentable, autophagic vacuole inneholder cellen brøker. LDH er en stabil, løselig cytosolic protein som er lett co sequestered når phagophores enwrap cytoplasmatiske Last. Lagring av LDH er derfor et generelt mål på autophagic lagring. LDH er utelukkende nedverdiget ved autophagic-lysosomale veien12. Således, i nærvær av lysosomale fornedrelse hemmere, f.eks bafilomycin A1 (Baf)13, eksperimentell behandling effekter direkte gjenspeile endringer i autophagic lagring aktivitet. I fravær av nedbrytning hemmere, kan virkningen endringer i LDH lagring og fornedrelse måles.
LDH lagring analysen er bredt aktuelt, siden LDH er svært og overalt uttrykt i alle celletyper, og LDH nivåer kan kvantifiseres nøyaktig ved en enzymatisk analysen14,15. Men originalen protokoll12 -etablert i primære rotte hepatocytter, var ganske tidkrevende og krevde en høy mengde starter materiale samt en skreddersydd elektrisk utladning kondensator. På en step-wise måte, har vi gradvis forvandlet analysen til en enkel og allsidig metode. Først var den originale protokollen tilpasset for bruk i pattedyr cellen linjer16. Andre var metoden vesentlig downscaled3,9. Tredje, flere trinn i protokollen ble eliminert, inkludert en arbeidskrevende tetthet pute trinn17. Dette aktivert samtidig en ytterligere nedskalering av metoden, fra det opprinnelige startpunktet for å bruke en 10 cm plate per eksempel16 å bruke en enkelt brønn fra en 12-vel plate per prøve (dvs.ca 15-fold mindre starter materiale)17. Fjerde identifisert vi en kommersiell electroporation apparater som kan erstatte de skreddersydde elektriske utladning kondensator17.
Her er vår nyeste protokollen av LDH lagring analysen, som omfatter noen flere forenklinger av metoden i forhold til de tidligere publiserte17 presentert. Videre et sett med typiske resultatene i en rekke ulike celletyper vises, og viktigst, flere linjer med eksperimentelle valideringene av metoden bruker farmakologiske samt genetisk knockdown og knockout innfallsvinkler tilbys. Hvis en samlet flyt plan for hele protokollen, kan du se figur 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

Bulk autophagy er preget av lagring av store deler av cytoplasma i dobbel/multi-membrane strukturer kalt autophagosomes. Her er en enkel protokoll for å overvåke denne prosessen beskrevet. Dessuten, typiske resultater og eksperimentelle validering av metoden under autophagy-inducing forhold i ulike typer kulturperler pattedyrceller tilbys. Under bulk autophagy beslaglegge autophagosomes stoffer, og dermed også løselig cytosolic proteiner, sammen med andre autophagic Last. LDH er en stabil og rikelig, løselig cytosolic enzym som er ikke-selektivt sequestered i autophagosomes. Mengden av LDH lagring gjenspeiler mengden bulk autophagic lagring. Å effektivt og nøyaktig bestemme LDH lagring i celler, bruker vi en electrodisruption-baserte fraksjoneres protokoll som effektivt skiller sedimentable fra cytosolic LDH, etterfulgt av måling av enzymatisk aktivitet i sedimentable fraksjoner mot hele celle prøver. Autophagic lagring bestemmes ved å trekke andelen sedimentable LDH i ubehandlet celler fra de i behandlet cellene. Fordelen av LDH lagring analysen er at det gir et kvantitativt mål for autophagic lagring av endogene Last, i motsetning til andre metoder at enten innebære ektopisk uttrykk for lagring sonder eller semi kvantitative protease beskyttelse analyser av autophagy markører eller reseptorer.

Ved hjelp av protokollen beskrevet her, bulk autophagic lagring aktivitet i en rekke ulike pattedyr cellelinjer, inkludert LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, jakten, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, mus embryonale fibroblaster (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ og LNCaP ble målt. Lagring ble vurdert under basale forhold (i komplett, næringsrike medium), eller i celler akutt sultet for serum og aminosyrer (et bona fide autophagy-inducing tilstand22). Resu...

Watch this Scientific Journal Video about The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay Ã¢â‚¬â€ A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells at 

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Laktat Dehydrogenase lagring analysen-En enkel og pålitelig metode å avgjøre Bulk Autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller

Her er en enkel og godt validert protokoll for å måle bulk autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller beskrevet. Metoden er basert på kvantifisere andelen av laktat dehydrogenase (LDH) i sedimentable celle fraksjoner sammenlignet med totale mobilnettet LDH nivåer.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse av Cell Cycle Posisjon i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Visualisering av endoplasmatisk retikulum Lokalisert mRNAs i pattedyrceller

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonomt Bioluminescent mammalieceller for Kontinuerlig og sanntids overvåking av Cytotoksisitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkel metode for fluorescens DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til knust Kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Enkelt Bulk Avlesning av digitale Nukleinsyre Kvantifisering Analyser

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...