Эта работа была финансовую поддержку научно-исследовательский совет Норвегии, в Университете Осло, фонда Anders Jahre, Фонд Нансена и наследие в памяти Хенрик Homan. Мы благодарим д-р Нобору Mizushima для ATG5 +/ + MEFs и ATG5-/-MEFs, доктор Масааки Komatsu для ATG7 +/ + MEFs и ATG7/MEFs и доктор Сидзуо Akira для ATG9A +/ + MEFs и ATG9A/MEFs. Мы благодарим Фрэнк Sætre для оказания технической помощи и д-р за Seglen O. для конструктивного обсуждения методологических.

1. клетки посева и лечение
<ol><li>
Культура адэрентных клеток в колбах культуры ткани2 75 см в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C, с использованием предпочтительного питательной среды для типа ячейки в вопросе. Позволяют клеткам расти до тех пор, пока они достигают слоя кл?...

В резюме протокол, описанные здесь представляет собой надежный и широко применяется метод для мониторинга активности сыпучих autophagic поглощения в mammalian клетках. По сравнению с оригинальной метод12,16, мы удалены несколько лишних шагов, упрощенный несколько ...

Autophagy (по-гречески «самостоятельной питания») является эволюционным процессом сохранены для вакуолярной/лизосомальных деградации внутриклеточных материала. После обнаружения связанных с autophagy («ГПТ») генов, которые являются важными для autophagy дрожжей и людей, и реализации что autophagy играет значительную роль в здоровье и болезни (подтверждено 2016 Нобелевской премии в области медицины или физиологии, чтобы Ёсинори Ohsumi), autophagy быстро стал одним из наиболее интенсивно изучаемых процессов в ячейки биологии1,2.
Macroautophagy (в дальнейшем именуемый «autophagy») характеризуется расширением и складной из межклеточная внутриклеточные мембраны («phagophores») в запечатанных, двойной или multi membrane структуры («autophagosomes»), которые эффективно поглощать enwrapped материал от остальной части цитоплазме. После слияния autophagosomes с лизосомы внутренний autophagosomal мембраны и поглощенных груз деградации и переработанных. Autophagosomes может поглощать цитоплазматических материал в случайных (неизбирательной autophagy) и манеры селективный (селективный autophagy). Основная autophagy скорее представляет собой смесь неизбирательной и селективного autophagy.
В 1960-х и 70-х годов («морфологические эра» autophagy исследований) autophagic поглощение оценивалось главным образом через ультраструктурных анализы. В 1980-х и начале 1990-х годов («биохимических эра») в Seglen и коллегами — кто изучал autophagy в первичной крыса гепатоцитов — разработал первый методы количественно измерить autophagic поглощение деятельности3. С помощью этих анализов, Seglen определены и охарактеризовал различные шаги autophagic лизосомальных пути4,5, обнаружил и придумал amphisome6 (продукт синтеза endosome-autophagosome) и был первым Опишите роль фосфорилирование белков в autophagy регулирование7. Однако, после обнаружения АТГС в 1990-х годов («молекулярная эра») и первая характеристика млекопитающих ATG8 белка, микротрубочки связанные белком 1A/1B-свет цепь 3 (LC3) в 2000 году8, использование ГПТ белков в качестве маркеров для autophagic процесс быстро завоевал популярность, и старше и более трудоемкий биохимические методы были выйдены позади. В самом деле, за последние 18 лет, Западная помарка и анализ микроскопии флуоресцирования LC3 стали на сегодняшний день наиболее популярные (и во многих случаях единственным) средства изучения autophagy в клетках млекопитающих. Преимуществом является относительная простота, в которой может осуществляться эти методы. Недостатком является то, что один учится корзину компонент (LC3) вместо фактических autophagic грузов. Это довольно серьезный недостаток, потому что отношения между государствами и/или потока LC3 через путь против поглощения и потока грузов весьма неясным. В самом деле, мы показали, что потока сыпучих грузов может поддерживаться на высоком уровне в условиях там, где нет LC3 потока, несмотря на присутствие конъюгированных LC3 в клетки9. Кроме того мы показали, что основная autophagy не зависит от эффективной LC3 истощения и таким образом вероятно LC3-независимые9. Этот вывод был позднее подтвержден LC3 исследования нокаут-10,11, которые также указывают, что Паркин зависимой mitophagy (селективный autophagy митохондрий) является независимым от LC310,11 .
Таким образом, существует явная необходимость грузов на основе анализов для мониторинга autophagic активности. Оптимально такие анализы должны быть широко применимы, четкие и легко выполнять. За последние несколько лет мы имели особый интерес в assay поглощение ЛДГ, который был разработан в Seglen в 1980-х12и основан на измерении передачи цитозольной ЛДГ sedimentable, autophagic вакуоль содержащих клеток фракции. LDH является стабильной, растворимые цитозольной белок, который легко совместно поглощенных при phagophores завертывать цитоплазматических грузов. Поглощение ЛДГ поэтому является мерой общего autophagic поглощения. LDH исключительно деградации autophagic лизосомальных пути12. Таким образом, в присутствии ингибиторов лизосомальных деградации, например, bafilomycin A1 (Baf)13, экспериментальное лечение эффекты непосредственно отражают изменения в деятельности autophagic поглощения. В отсутствие деградации ингибиторы чистый эффект изменений в ЛДГ поглощение и деградация может быть измерена.
Assay поглощение ЛДГ широко применимым, поскольку ЛДГ выражается высоко и повсеместно, во всех типах клеток, и ЛДГ уровни могут быть точно количественно ферментативные пробирного14,15. Однако, оригинал протокола12 — в первичной крыса гепатоцитов — довольно много времени и требует большого количества начиная материала, а также по индивидуальному заказу электрического разряда конденсатора. На основе поэтапного мы постепенно превратили assay в легкий и универсальный метод. Во-первых оригинальный протокол был адаптирован для использования в mammalian клетки линии16. Во-вторых метод был значительно уменьшенным разрешением3,9. В-третьих, несколько шагов в протоколе были ликвидированы, включая трудоемкий плотность подушке шаг17. Это одновременно позволило еще больше разукрупнение метода, от оригинального отправной точкой использованием плита 10 см за образец16 один колодец от 12-ну пластины на сэмпл (то есть, около 15 раз меньше начиная материал)17. В-четвертых мы определили коммерческий электропорации аппарат, который может заменить на заказ электрическим разрядом конденсатора17.
Здесь представлены наши самые современные протокол assay поглощение ЛДГ, который включает в себя некоторые дальнейшего упрощения метода по сравнению с ранее опубликованной17 . Кроме того показан набор типичных результаты, полученные в ряде различных типов клеток, и главное, предоставляются несколько строк экспериментальной проверки метода с использованием фармакологических, а также генетические сногсшибательно и нокаут подходы. Общая схема всего протокола см. Рисунок 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

Основная autophagy характеризуется поглощение значительная часть цитоплазмы в двойной/multi-membrane структуры, называют autophagosomes. Здесь описан простой протокол для контролировать этот процесс. Кроме того предоставляются типичные результаты и экспериментальной проверки метода autophagy склонение в условиях различных видов культивируемых клеток млекопитающих. Во время массовых autophagy autophagosomes секвестрировать в цитозоле и таким образом также растворимые цитозольной белков, наряду с другими autophagic груза. LDH является стабильной и очень обильные, растворимые цитозольной фермента, который неизбирательно поглощенных в autophagosomes. Таким образом, количество ЛДГ поглощение отражает количество массовых autophagic поглощения. Эффективно и точно определить уровень ЛДГ поглощения в клетках, мы используем протокол на основе electrodisruption фракционирования, который эффективно отделяет sedimentable от цитозольной ЛДГ, следуют измерения ферментативной активности в sedimentable фракции против поклеточного образцы. Autophagic поглощение определяется путем вычитания доли sedimentable ЛДГ в необработанной клеток из что в обработанных клеток. Преимущество пробирного поглощение ЛДГ, что это дает количественную меру autophagic поглощения эндогенного грузов, в отличие от других методов либо привлекать внематочная выражение связывания зондов или полуколичественного протеазы анализ защиты autophagy маркеры или рецепторов.

С помощью протокола описанных здесь, основная autophagic поглощение активности в ряде различных млекопитающих клеточных линий, включая LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, мышь эмбриональных фибробластов (MEFs), ПЭС-1, HEK293, BJ и LNCaP клетки была измерена. Поглощение оцен...

Watch this Scientific Journal Video about The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay Ã¢â‚¬â€ A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells at 

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Лактатдегидрогеназа Assay поглощение — Простой и надежный метод для определения активности сыпучих Autophagic поглощения в клетках млекопитающих

Здесь описан простой и хорошо проверенных протокол для измерения активности сыпучих autophagic поглощения в mammalian клетках. Метод основан на количественной оценки доли Лактатдегидрогеназа (LDH) в sedimentable клеток фракций по сравнению с общей сотовой уровня ЛДГ.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Пиросеквенирования: Простой метод для точного генотипирования

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Использование протеазы Флуоресцентный Kit обнаружения для определения протеазы активность

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Матригель основе труб Формирование Пробирной для оценки Vasculogenic активность опухоли

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Анализ сотового Позиция цикла в клетках млекопитающих

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Визуализация эндоплазматического ретикулума Локализованные мРНК в клетках млекопитающих

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Простой метод ДНК флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация, чтобы раздавил хромосом

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Простой Массовая считывания цифровых нуклеиновых кислот количественного определения Анализы

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...