Detta arbete stöddes ekonomiskt av Norges forskningsråd, Oslo universitet, Anders Jahre Foundation, Stiftelsen Nansen och arvet till minne av Henrik Homan. Vi tackar Dr. Noboru Mizushima för ATG5 +/ + MEFs och ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu för ATG7 +/ + MEFs och ATG7-/-MEFs och Dr Shizuo Akira för ATG9A +/ + MEFs och ATG9A-/-MEFs. Vi tackar Frank Sætre för tekniskt bistånd och Dr Per O. Seglen för konstruktiva metodologiska diskussioner.

1. cell sådd och behandling
<ol><li>
Kultur vidhäftande celler i 75 cm2 vävnadsodling kolvar i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C, med rekommenderad odlingssubstratet för Celltypen i fråga. Att cellerna att växa tills de når en nära-konfluenta cellager. Obs: Använd RPMI 1640 medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) för LNCaP, HEK293, mus embryonala fibroblaster (MEFs), BJ, MCF-7 och RPE-1 celler.<ol>
<li>Tvätta cellerna med 3 mL 37 ° C fosfatbuf...

Sammanfattningsvis utgör protokollet beskrivs här en tillförlitlig och allmänt tillämplig metod att följa bulk autophagic kvarstad i däggdjursceller. Jämfört med den ursprungliga metod12,16, har vi tagit bort ett antal onödiga steg, förenklad flera av de återstående stegen och introducerade en betydande nedskalning. Som ett resultat, protokollet förbättrad väsentligt i förhållande till kostnader - och tid-effektivitet, och samma mängd prover ka...

Autofagi (grekiska för ”äta själv”) är en evolutionärt bevarade process för vakuolär/lysosomal nedbrytning av intracellulära material. Vid upptäckt av de gener som autofagi-relaterade (”ATG”), som är viktiga för autofagi i jäst och människor, och insikten att autofagi spelar en betydande roll för människors hälsa och sjukdom (erkänt av 2016 Nobelpriset i medicin eller fysiologi till Yoshinori Ohsumi), autofagi har snabbt blivit en av de mest intensivt studerade processerna i cellbiologi1,2.
Macroautophagy (hädanefter benämnd ”autofagi”) är kännetecknas av expansion och vikning av intracellulära membran cisternae (”phagophores”) i förseglade, dubbel - eller multi - membrane strukturer (”autophagosomes”) som effektivt binda den omsluten material från resten av cytoplasman. Vid fusion av autophagosomes med lysosomer, är inre autophagosomal membranet och konfiskerade gods degraderad och återvinnas. Autophagosomes kan binda cytoplasmiska material i både slumpmässiga (icke-selektiva autofagi) och selektiv (selektiv autofagi) seder. Bulk autofagi sannolikt representerar en blandning av icke-selektiva och selektiva autofagi.
1960-och 70-talet (”morfologiska eran” av autofagi forskning) utvärderades främst autophagic kvarstad genom ultrastrukturella analyser. 1980-talet och början av 1990-talet (”den biokemiska eran”) Per Seglen och medarbetare – som studerat autofagi i primära råtta hepatocyter — utvecklade de första metoderna för att kvantitativt mäta autophagic kvarstad aktivitet3. Med dessa analyser, Seglen definieras och kännetecknas olika steg av autophagic-lysosomala väg4,5, upptäckte myntade de amphisome6 (produkten av endosome-autophagosome fusion) och var först att beskriva rollen av protein fosforylering i autofagi förordning7. Dock efter upptäckten av ATGs i 1990-talet (”den molekylära eran”) och den första karakteriseringen av ett däggdjur ATG8 protein, mikrotubuli-associerade protein 1A/1B-light kedja 3 (LC3) i 20008, användning av ATG proteiner som markörer för den autophagic process snabbt vunnit popularitet och de äldsta och mer arbetskrävande biokemiska metoderna var kvar. I själva verket under de senaste 18 åren, western blot och fluorescence mikroskopi analyser av LC3 har blivit den överlägset mest populära (och i många fall den enda) sätt att studera autofagi i däggdjursceller. Fördelen är den relativa lätthet med vilken dessa metoder kan utföras. Nackdelen är att man studerar en vagn komponent (LC3) snarare än faktiska autophagic Last. Detta är en ganska allvarlig nackdel, eftersom förhållandet mellan stater och/eller flux av LC3 via vägen kontra kvarstad och flux Last är mycket oklart. I själva verket har vi visat att merparten Last flux kan upprätthållas på höga nivåer under förhållanden där det finns ingen LC3 flux, trots närvaron av konjugerade LC3 i celler9. Dessutom visade vi att bulk autofagi är opåverkad av effektiv LC3 utarmning, och därmed sannolikt är LC3-oberoende9. Detta konstaterande har senare bekräftats av LC3 knock-out studier10,11, också ange att Parkin-beroende mitophagy (den selektiva autofagi av mitokondrier) är oberoende av LC310,11 .
Sammanfattningsvis, det finns ett klart behov för Last-baserade analyser att övervaka autophagic aktivitet. Optimalt bör sådana analyser vara brett tillämpliga, väldefinierade och enkelt att utföra. De senaste åren har vi tagit ett särskilt intresse för LDH kvarstad analysen, som utvecklades av Per Seglen i 1980-talet12, och bygger på att mäta överföringen av cytosoliska LDH till sedimentable, autophagic vakuol-innehållande cell fraktioner. LDH är en stabil, lösligt cytosoliska protein som är lätt Co binds när phagophores innesluta cytoplasmiska Last. Beslagtagande av LDH är därför en allmän åtgärd autophagic kvarstad. LDH bryts endast av de autophagic-lysosomala väg12. Således, i närvaro av lysosomal nedbrytning-hämmare, t.ex., bafilomycin A1 (Baf)13, experimentell behandlingseffekter direkt återspeglar förändringar i autophagic kvarstad aktivitet. I avsaknad av nedbrytning-hämmare, kan nettoeffekten av förändringar i LDH kvarstad och nedbrytning mätas.
LDH kvarstad analysen är i stort sett tillämplig, eftersom LDH uttrycks mycket och ubiquitously i alla celltyper och LDH nivåer kan kvantifieras korrekt av en enzymatisk analys14,15. Dock ursprungligen protokoll12 — etablerade i primära råtta hepatocyter — var ganska tidskrävande och krävs en stor mängd start material liksom en skräddarsydd elektrisk urladdning kondensator. I en stegvis sätt, har vi gradvis omvandlas analysen till en lätt och mångsidig metod. Första, ursprungliga protokollet var anpassad för användning i däggdjursceller linjerna16. Andra var metoden kraftigt nedskalad3,9. Tredje, flera steg i protokollet eliminerades, inklusive en mödosam densitet kudde steg17. Detta gjorde samtidigt en ytterligare nedskalning av metoden, från ursprungliga startpunkten för att använda en 10 cm platta per prov16 till att använda en enda brunn från en 12-well platta per prov (dvs.ungefär 15-fold mindre startas material)17. För det fjärde har identifierat vi en kommersiell elektroporation apparat som kan ersätta de skräddarsydda elektriska urladdning kondensator17.
Här presenteras våra senaste protokollet av LDH kvarstad analysen, vilket inkluderar vissa ytterligare förenklingar av metoden jämfört med den tidigare publicerade17 . Dessutom visas en uppsättning typiska resultat erhålls i ett antal olika celltyper, och ännu viktigare, flera rader med experimentell validering av metoden som använder farmakologiska samt genetiska knockdown och knockout metoder tillhandahålls. För en övergripande flödesschemat i hela protokollet, se figur 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

Bulk autofagi kännetecknas av beläggs med stora delar av cytoplasman i dubbel/multi-membrane strukturer som kallas autophagosomes. Här beskrivs ett enkelt protokoll att övervaka denna process. Dessutom finns typiska resultat och experimentell validering av metoden autofagi-inducerande villkor i olika typer av odlade däggdjursceller. Under bulk autofagi binda autophagosomes cytosol, och därmed också lösliga cytosoliska proteiner, tillsammans med andra autophagic Last. LDH är en stabil och mycket riklig, lösligt cytosoliska enzym som är icke-selektivt binds till autophagosomes. Beloppet av LDH kvarstad avspeglar därför mängden bulk autophagic kvarstad. För att effektivt och korrekt avgöra LDH kvarstad i cellerna, anställer vi en electrodisruption-baserade fraktionering protokoll som effektivt separerar sedimentable från cytosoliska LDH, följt av mätning av enzymatisk aktivitet i sedimentable fraktioner kontra hela-cell prover. Autophagic kvarstad bestäms genom att subtrahera andelen av sedimentable LDH i obehandlad celler från det i behandlade celler. Fördelen med LDH kvarstad analysen är att det ger ett kvantitativt mått på den autophagic kvarstad av endogena Last, i motsats till andra metoder att antingen innebära ektopisk uttryck för kvarstad sonder eller semikvantitativt proteas skydd analyser av autofagi markörer eller receptorer.

Protokollet beskrivs här, bulk autophagic kvarstad aktivitet i ett antal olika däggdjur cellinjer, inklusive LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, T47D, PC3, U2OS, MCF-7, G361, mus embryonala fibroblaster (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ och LNCaP celler mättes. Kvarstad var bedömts under basala förhållanden (i kompletta, näringsrika medium) eller i celler akut svultit för serum och aminosyror (en bona fide autofagi-inducerande skick22). Re...

Watch this Scientific Journal Video about The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay Ã¢â‚¬â€ A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells at 

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Laktatdehydrogenas kvarstad analysen — En enkel och tillförlitlig metod för att bestämma Bulk Autophagic kvarstad aktivitet i däggdjursceller

Här beskrivs ett enkelt och väl validerat protokoll för mätning av bulk autophagic kvarstad aktivitet i däggdjursceller. Metoden är baserad på kvantifiera andelen av laktatdehydrogenas (LDH) i sedimentable cell fraktioner jämfört med totala cellular LDH nivåer.

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: En enkel metod för noggrann Genotypning

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Användning av Protease Fluorescent Detection Kit Avgöra Protease aktivitet

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Klonogena analysen: Vidhäftande Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

En Matrigel-Based Tube Formation analys för att bedöma vaskulär aktivitet av tumörceller

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analys av cellcykeln Position i däggdjursceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Visualisering av endoplasmatiska nätverket Lokaliserade mRNA i däggdjursceller

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonomt Bioluminescent däggdjursceller för kontinuerlig och övervakning i realtid av cytotoxicitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkel metod för fluorescens-DNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering till kläm Kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Enkel Bulk Avläsning av digitala Nucleic Acid Kvantifiering Analyser

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...