Name: forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes at JoVE.com

Vi takker Ella Weinert, Michelle Helms og Marlis Badusche for fremragende teknisk bistand, Jessica Börstler analyser af Culex myg, Norbert Becker og Björn Pluskota for at give Aedes albopictus æg og Olli Vapalahti for leverer virus materiel. ML blev støttet af sammenslutningen Leibniz; give nummer SAW-2014-SGN-3.

1. Forbered kvindelige myg
<ol><li>Indsamle myg fra et stort bur ved hjælp af en betjent sug (ca. 400 myg pr. store bur).</li>
	<li>Bedøver myg med kuldioxid (CO2) til 7 s.</li>
	<li>Sortere 20 hunner pr. plastik hætteglas (Ø 50 mm × 100 mm). Bemærk: Hvis myg vågner op, bruge en anden 3 s Co2.
</li>
	<li>Sulte myg natten over.</li>
</ol>2. kunstig blod måltid
Bemærk: Alle trin er udført under BSL-3 forhold.
<ol><li>
Forberede den smitsomme blodmel.
	<ol>
<li>Fortyndet virus materiel til koncentrationen af 1 x 108 plak danner enheder (PFU) / mL. Bemærk: Stock koncentrationen var bestemmes ved at udføre vævskultur infektion dosis 50 metode (TCID50) og beregnes af den Spearman & Kärber algoritme10,11.</li>
		<li>Mix udløbet humant blod (blodet bevaring) fra blodbank (ikke egnet til menneskelige længere, men nyttig for myg) med fruktose (8% opløsning), filtreres bovint serum (FBS) og brugsopløsning af virus stock (udløbet menneskelige blod: fructose: FBS: brugsopløsning = 5:3:1:1). Bemærk: Vi valgte menneskeblod, fordi det er kendte naturlige pattedyr vært for ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fryse 140 µL af blodmel mix for yderligere analyse via TCID50.</li>
	<li>
Udføre kunstig fodring ved hjælp af forskellige fodring metoder, afhængigt af arten:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: Brug en membran fodring system for 30 min (1 mL per feeder).</li>
		<li>
Culex spp.: give smitsomme blodet via en bomuld pind natten over og ikke varme op blod (300 µL pr. hætteglas).</li>
		<li>
Aedes albopictus: sat to dråber (50 µL) af blodmel mix i plast hætteglasset og lad myg feed for 2 h. Ikke varme op blod. Bemærk: Myg vil indgå i de første 15 min. Den langvarige Inkubationstiden er nødvendige af sikkerhedsmæssige årsager. Blod dråber er drænet efter 2 h, således at forurening risikoen reduceres under sortering af fodret myg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bedøver myg med CO2 til 7 s. Bemærk: Hvis myg vågner op, bruge en anden 3 s af CO2.</li>
	<li>Form og antal fuldt engorged myg til en ny hætteglas.</li>
	<li>Tilføje en vatrondel, mættet med fruktose (8% opløsning) mellem hætteglasset og et stik.</li>
	<li>Holde myggene ved den angivne temperatur på 18 ° C eller 27 ° C i luftfugtighed på 80% for 14 eller 21 dage.</li>
	<li>Feed myggene med fruktose-mættet vatrondeller. Opfyld alle 72 h med 1,5 mL af fruktose (8% opløsning) pr. hætteglas (op til 20 myg, afhængigt af fodring rate, se trin 2.5).</li>
</ol>3. tvunget spytsekretion Assay dag 14 eller 21
Bemærk: Alle trin er udført under BSL-3 forhold.
<ol><li>Frø 2 x 104 Vero celler / pr. brønd i en 96 godt plade med 200 µL af vækstmediet (Dulbecco´s modificeret eagle medium (DMEM) suppleret med 3% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 5 µg/mL amphotericin B, 2 mM L-glutamin 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1% natrium pyruvat).</li>
	<li>
Forberede spytsekretion enheden:
	<ol>
<li>Placer en kvadrerede glasplade (20 × 20 cm) på bænken i en vinkel på 30°. Bemærk: Dette er nødvendigt på grund af undertryk i sikkerhed lab. Hvis pladen er vandret eller lodret, vil væske sive.</li>
		<li>Placer dobbeltklæbende tape på glaspladen.</li>
		<li>Rolle modeling clay indtil det når en diameter på 0,5 cm og vedhæfte det vandret 1 cm fra den dobbeltklæbende tape.</li>
		<li>Afskære de første 0,3 cm af spidsen af en 10 µL filter tip. Bemærk: Det anbefales at forberede dette før du starter eksperimentet uden for Biosikkerhed laboratorium.</li>
		<li>Fyld filter tips med 10 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Placer filter tips på modeling ler med spids mod den klæbende tape.</li>
		<li>Sikre filter tips med blide tryk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Forberede myg:
	<ol>
<li>Bedøver myg med CO2.</li>
		<li>Fjern ben og vinger til at immobilisere myg.</li>
		<li>Fix levende myg organer på den selvklæbende tape over et filter tip.</li>
		<li>Sted Snabel forsigtigt ind i filter spidsen.</li>
		<li>Køre spytsekretion assay i 30 min.</li>
		<li>Fjern filter tips og kassér ler og tape.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. behandling af spyt
Bemærk: Trin 4.1 – 4.6.2 udføres BSL-3 betingelser.
<ol><li>Udvise indhold i de reaktion rør indeholdende 10 µL af PBS.</li>
	<li>Bland forsigtigt og overføre indholdet til wells af rede 96 godt plade ved hjælp af et godt pr. prøve.</li>
	<li>Inkuber pladen i 7 dage ved 37 ° C med 5% CO2.</li>
	<li>Bruge kikkerten til at kontrollere celler for tilstedeværelsen af cytopatisk effekt (CPE).</li>
	<li>Hvis brønden er positive for CPE, høste supernatanten af pipettering 140 µL til en reaktion tube for RNA udvinding.</li>
	<li>
Rense RNA ved hjælp af et RNA udvinding kit.
	<ol>
<li>Mix 140 µL af supernatanten med 560 µL af AVL buffer (viral lysisbuffer) og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.</li>
		<li>Tilføje 560 µL af ethanol (96%) og vortex prøven. Bemærk: Prøverne er inaktiveret efter dette trin og kan udledes af BSL-3 laboratoriet.</li>
		<li>Med pipette overfoeres 630 µL af prøven på en kolonne og centrifuger med 6.000 x g i 1 min.</li>
		<li>Kassér filtratet afpipetteres den resterende 630 µL på kolonnen og gentage centrifugeringen.</li>
		<li>Vask RNA, bundet til membranen af kolonnen, ved at tilføje 500 µL af vask buffer 1 til kolonnen og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 min.</li>
		<li>Kassér collection tube og placere kolonnen i en ny collection tube. Tilføje 500 µL vask buffer 2 og centrifugeres ved 12.500 x g i 3 min.</li>
		<li>Kassér collection tube og placere kolonnen i en 1,5 mL reaktion tube.</li>
		<li>Tilsæt 50 µL af eluering buffer og inkuberes i 1 min. ved stuetemperatur.</li>
		<li>Der centrifugeres ved 6.000 x g i 1 min og derefter slette kolonnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysere prøverne for ZIKV RNA via RT-qPCR.</li>
</ol>5. behandling af myg organer
Bemærk: Trin 5.1-5,5 udføres BSL-3 betingelser.
<ol><li>Fjerne ligene af myg og placere hvert organ i en reaktion tube. Bemærk: Det er muligt at afbryde forsøget på dette tidspunkt og gemme prøver på-80 ° C.</li>
	<li>Tilføje 500 µL af homogenisering media (DMEM uden hvilken som helst supplementals) ind i reaktion rør.</li>
	<li>Homogeniseres kroppen med håndmikser motor og bruge en ny Støvvejen for hver prøve.</li>
	<li>Tilføje 200 µL af homogenatet ind i en 96-brønd-plade til rensning. Bemærk: Det er muligt at afbryde forsøget på dette tidspunkt og gemme prøver på-80 ° C.</li>
	<li>Inaktivere pladen ved inkubation i 60 min. ved 60 ° C.</li>
	<li>Rense RNA af automatiserede nukleinsyre rensning. Bemærk: Det er muligt at afbryde forsøget på dette tidspunkt og gemme prøver på-80 ° C.</li>
</ol>6. analyse
<ol><li>Kvantificere den Viral RNA kopier ved hjælp af RT-qPCR. Bemærk: RNA kopier blev gennemsnit over alle ZIKV-positive myg organer og uden herunder ZIKV-negative myg.</li>
	<li>Beregne IR, defineret som antallet af ZIKV-positive myg organer pr. antal fodret hunner.</li>
	<li>Beregne TR, defineret som antallet af myg med ZIKV-positive spyt pr. antal ZIKV-positive myg organer. Overførselshastigheden kunne ikke beregnes for kombinationer af arter og temperatur med ingen ZIKV-positive organer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus.">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li><li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+selected+African+mosquito+(Diptera:+Culicidae)+species+for+Rift+Valley+fever+virus.">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li><li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses.">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li><li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+salivation+and+virus+transmission.">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li><li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes.">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li><li>Heitmann, A., Jansen, S., L&#252;hken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe.">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li><li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).</li><li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kompendium+der+allgemeinen+Virologie.">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt f&#252;r Veterin&#228;rmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).</li><li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Det er tidligere påvist, at resultater opnået med tvungen spytsekretion er i tråd med klassisk re fodring eksperimenter6. Men både i re fodring eksperimenter og i vores præsenteret metode til tvungen spytsekretion, det er umuligt at direkte bevis spytsekretion aktivitet eller overvåge udgivelsen af spyt. Prøver for at bevise spytsekretion aktivitet, kunne blive testet for andre komponenter til stede i spyt (fx., proteiner, kulhydrater, osv.). Desuden vil yderligere qPCRs tillade påvisning af viral RNA kopier. Dette kræver dog, opdeling af spytprøver til forskellige analyser, der kan begrænse følsomheden i celle kultur assay i meget lav partikel numre. Igen, kan dette føre til en undervurdering af de beslutsomme overførselshastigheder.
For reproducerbare resultater er det nødvendigt at sikre, at alle myg forbliver i live indtil slutningen af forsøget. Dette styres af visuelt overvågning krop bevægelse aktivitet af myg. Princippet om anvendelse af spytsekretion assay for en given myg arter har desuden skal testes ved at fodre kontrol virus, der er kendt til sendes med dette specifikke myg arter. Omvendt, har hver virus tilføres et eksperiment afprøves i en modtagelig myg.
Tvungen spytsekretion assays har mange fordele. Høje antal myg kan testes samtidigt på en enkelt model base under kontrollerede standardiserede betingelser uden konflikt med dyrevelfærd forordninger9.
Metoden bruges af flere laboratorier. Dog afvige nøjagtige opsætninger, som kan føre til forskelle i resultaterne mellem laboratorier. En kritisk komponent er kapillær at indsamle spyt, som kan være lavet af glas14 eller plast15. For at overholde de høje sikkerhedsbestemmelser for en biosikkerhed niveau 3 insectary, brugte vi plast filter tips i stedet for glas kapillærer, dermed reducere risikoen for skader. Filter tips har desuden den fordel, de indsamlede væske let overføres, ved hjælp af en pipette.
Opsætningen af den tvungne spytsekretion assay præsenteres her er baseret på to efterforskere arbejde sammen og dele opgaver. Tilbagetrækningen af myg er udført af én person, mens den anden samtidig forbereder tvungen spytsekretion setup. Dette væsentligt reducerer tid, håndtering og minimerer risikoen af prøven Skift som skiftende mellem demobilisering-arbejdspladsen og savlen-pladen er ikke nødvendigt. Desuden, det giver mulighed for markedsføring myg tvungen spytsekretion enhed umiddelbart efter hjemsendelsen. Denne temmelig korte myg Ekspeditionstiden er afgørende for vellykket tvungen savlen. Endelig kan myg overvåges direkte til motilitet gennem hele eksperimentet.
Savlen analysen præsenteres her bruges til at få indsigt i vektor potentiale af myg arter. Dog at besvare nogle andre specifikke spørgsmål (fx., antallet af myggestik, der er nødvendige for at smitte hvirveldyr), animalsk eksperimenter kan stadig være påkrævet.

I 2015, Zika virus (ZIKV), en myg-bårne virus (mobovirus) tilhører familien Flaviviridae, opstået i Columbia og Brasilien og spredes hurtigt over hele Amerika og Caribien, forårsager en epidemi med bemærkelsesværdige numre af forbundet kliniske tilfælde af mikrocefali og Guillain-Barre syndrom1. Myg arter Aedes aegypti og Aedes albopictus betragtes som de primære og sekundære vektorer af ZIKV2, men andre arter af slægten Aedes har også vist sig for at have eksperimentel vektor kompetence3 . I modsætning til Aedes arter er de fleste af Culex arter testet indtil videre ikke købedygtig overføre virus4. Blot, givet data for Culex quinquefasciatus inkonklusive resultater3. I øjeblikket mangler oplysninger om myg vektor kompetence for ZIKV under moderate temperaturforhold (< 20 ° C). Disse oplysninger er imidlertid væsentlig for risikovurderinger af mulige breder sig til områder med tempereret klima såsom Centraleuropa.
Kompetente vektor for ZIKV er i stand til at erhverve, vedligeholde, forstærke og endelig overføre virus. Derfor er test myg organer eller dele af organer, herunder ben, midgut, hoved eller spytkirtler, for ZIKV ikke tilstrækkeligt at fastslå vektor kompetence. Det er obligatorisk at teste for smitsomme viruspartikler inden for frigivne spyt. For at vurdere vektor kompetence, skal både infektion sats (IR, antallet af ZIKV-positive myg organer pr. antal engorged myg) og transmission sats (TR, antallet af myg med ZIKV-positive spyt pr. antal ZIKV-positive myg organer), være bestemmes. IRs af myg kan analyseres nemt ved blot homogenisering myg efterfulgt af en reverse transkriptase real-time polymerase kæde reaktion (RT-qPCR) rettet mod ZIKV. Derudover kan infektionen karakteriseres yderligere ved at bestemme de virale kopi numre pr. myg. Derimod bygger analyse af overførselshastigheder på påvisning af levedygtige viruspartikler i spyt af enkelte myg. Dette kan opnås ved fodring med inficerede myg på modtagelige vært dyr, efterfulgt af en analyse af viræmi i vært5. Dog denne metode bygger på passende modelorganismer, og er dyrt og begrænset af dyrevelfærd forordninger. Undgå brugen af forsøgsdyr til at analysere overførselshastigheder og reducere omkostningerne, kunstige re fodring systemer ved hjælp af blod dråber har været beskrevet6. Test på individuelle skala kombineret med et stort antal individer er dog vanskeligt og tidskrævende. Den første beskrivelse af en spytsekretion assay på individuelle skala blev offentliggjort i 19667 og i løbet af de seneste år, blevet tvunget spytsekretion eksperimenter metode til at evaluere vektor kompetence myg3,8 .
Baseret på vores vektor kompetence undersøgelse af centraleuropæiske myg offentliggjort for nylig9, vi beskriver tvungen spytsekretion, som rapporteret af Anderson mfl. 8 med nogle ændringer. Denne metode giver høj overførselshastighed standardiseret eksperimenter under høj biosikkerhed ensartede betingelser (BSL-3) og omfatter identifikation af aktive virus af celle kultur baseret assays. Eksperimenter beskrevet her omfatter 856 myg. De var smittet med ZIKV af kunstige blodmel og efterfølgende analyseres for forekomst af smitsomme viruspartikler i spyt. Myg tilføres forsøg omfattede to veletablerede laboratorium populationer af Ae. aegypti og Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus), samt felt fanget Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) og to Ae. albopictus populationer. Med undtagelse af en af de to populationer, Ae. albopictus , som blev indsamlet i Italien, blev alle myg indsamlet i Tyskland.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inject+matic Sleeper</td>
			<td>Inject+matic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td>
			<td>BugDorm Store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK11.2</td>
			<td>plastic vial for mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug for drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK15.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant climate chamber</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KBF-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont-Pincette Electronic SS</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>B40c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>BNITM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flash light aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td>
			<td>Ansell</td>
			<td></td>
			<td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td>
			<td>altona diagnostics</td>
			<td>591013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>4462359</td>
			<td>RNA isolation of mosquito bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td>RNA-Isolation of supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips (20 &#181;L)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>701,116,210</td>
			<td>Cut the first 3 mm of the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>sold out</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro pestles for hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>CXH8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td>P0403550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P06-0110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>4981.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0443100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NAA</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0832100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek Feeder</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler Software</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 SW 1.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King Fisher Flex Purification System</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes albopictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular light</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>MLC-150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

Vektor kompetence er defineret som en myg arter potentiale til at overføre en myg-bårne virus (mobovirus) til en hvirveldyr vært. Levedygtige viruspartikler er forsendt under en blodmel via spyt af en inficeret myg. Tvungen spytsekretion assays tillade bestemmelse af vektor potentiale på grundlag af enkelt myg, undgå brugen af dyreforsøg. Metoden er egnet til at analysere et stort antal af myg i et eksperiment inden for en kort periode. Tvungen spytsekretion assays blev anvendt til at analysere 856 enkelte myg fanget i Tyskland, herunder to forskellige Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium samt Aedes albopictus, der blev eksperimentelt inficeret med Zika virus (ZIKV) og rugede på 18 ° C eller 27 ° C i to og tre uger. Resultaterne angives manglen vektor kompetence i de forskellige Culex taxa til ZIKV. Derimod var Aedes albopictus modtagelige for ZIKV, men kun på 27 ° C, med overførselshastigheder svarende til en Aedes aegypti laboratorium koloni testet parallelt.

Aedes aegypti er kendt som en kompetent vektor for ZIKV i det mindste under tropiske klimaforhold12. Derfor brugte vi Ae. aegypti som positiv kontrol at etablere analysen og analysere IRs samt TRs ved en inkubation temperatur på 27 ° C og en luftfugtighed på 80%. IR og TR blev defineret som tidligere beskrevet af Fortuna mfl. 13. bestred Ae. aegypti viste IR på 50% og 72% og TR på 42% og 31% på 14 og 21 dage efter infektion (dpi), henholdsvis (figur 1A og 1B). Efterfølgende blev europæiske myg testet for ZIKV infektion og transmission ved hjælp af tropiske samt tempererede klimaforhold.
På 27 ° C inkubation temperatur viste alle myg arter ZIKV infektion på 14 dpi samt 21 dpi, undtagen Cx. p. pipiens og Cx. torrentium personer, som var positiv på 14 dpi kun. Alle Aedes arter viste højere IRs (mellem 50% og 72%) samt højere viral RNA-koncentrationen (106 op til 109 RNA kopier/myg prøver) i forhold til de forskellige Culex taxa, som afslørede IRs spænder mellem 0 % og 32% og viral masser af 103 104 RNA kopier/myg enheder. Alle Aedes arter vises ZIKV-positive spyt (TR 13 – 42%), hvorimod ingen af spytprøver fra Culex taxa indeholdt ZIKV (figur 1A og 1B). Interessant, overførselshastigheder på 21 dpi var ens i Ae. aegypti og Ae. albopictus fra Tyskland (30%), men var væsentligt lavere i Ae. albopictus fra Italien (13%).
Inkubation af udfordret myg ved en moderat temperatur på 18 ° C afslørede generelt lavere virus indlæser i Aedes arter (104– 106 RNA kopier/myg) samt i de forskellige Culex taxa (102-104 RNA kopier/myg). Dog ved 18 ° C inkubation temperatur, blev transmission af ZIKV ikke observeret for nogen af de myg arter undersøges.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Figur 1: overførselshastigheder af myg eksperimentelt inficeret med ZIKV. Resultaterne af vektor kompetence undersøgelser med ZIKV i forskellige myg arter. Seks forskellige myg taxa var inficeret med ZIKV og inkuberes ved 27 ° C eller 18 ° C til 14 (A) eller 21 dage, (B). TR er defineret som antallet af myg med ZIKV-positive spyt pr. antal ZIKV-positive myg organer. Det samlede antal myg undersøgt blev 856, med et minimum af 30 individer for hver gang punkt/temperatur/myg taxa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes at JoVE.com

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Tvunget spytsekretion som en metode til at analysere vektor kompetence af myg

Effektiv kontrol af myg bårne virus transmission, er kendskab til vektor potentiale af respektive myg af særlig interesse. Vi beskriver tvungen spytsekretion som en metode til at analysere vektor kompetence af Aedes albopictus og tre forskellige Culex taxa til transmission af Zika virus.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-påvisningsassay for Malaria Fremsendende Myg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion som en metode til vaskulær visualisering i<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Opretholdelse af Aedes aegypti myg inficeret med Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for afprøvning toksicitet af roman insektbekæmpelsesmidler kemi til myg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...