Name: forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes at JoVE.com

Vi tackar Ella Weinert, Michelle Helms och Marlis Badusche för utmärkt teknisk assistans, Jessica Börstler för analyser av Culex myggor, Norbert Becker och Björn Pluskota för att tillhandahålla Aedes albopictus ägg och Olli Vapalahti för ger virus beståndet. ML stöddes av Leibniz samfundet; bevilja nummer SAW-2014-SGN-3.

1. Förbered kvinnliga myggor
<ol><li>Samla in myggor från en stor bur med hjälp av en insugningsventil (ungefärligt 400 myggor per stor bur).</li>
	<li>Söva myggor med koldioxid (CO2) för 7 s.</li>
	<li>Sortera 20 honor per plast injektionsflaska (Ø 50 mm × 100 mm). Obs: Om myggen vaknar, använda en annan 3 s co2.
</li>
	<li>Svälta myggen över natten.</li>
</ol>2. konstgjorda blodmjöl
Obs: Alla steg utförs BSL-3 villkor.
<ol><li>
Förbereda den smittsamma blodmjöl.
	<ol>
<li>Späd den virus materielen som koncentrationen av 1 x 108 plackbildande enheter (PFU) / mL. Obs: Lager koncentrationen var bestäms genom att utföra vävnadsodling infektion dos 50-metoden (TCID50) och beräknade av Spearman & Kärber algoritm10,11.</li>
		<li>Mix löpt ut blod (blod bevarande) från Blodbanken (inte lämplig för mänsklig längre, men användbar för myggor) med fruktos (8% lösning), filtermediat bovint serum (FBS) och fungerande lösning av virus beståndet (löpt ut mänskligt blod: fruktos: FBS: fungerande lösning = 5:3:1:1). Obs: Vi valde humanblod, eftersom detta är kända naturliga däggdjur värd för ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frysa 140 µL av blodmjöl mix för vidare analys via TCID50.</li>
	<li>
Utföra artificiell utfodring med olika utfodring metoder, beroende på Art:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: Använd ett membran matningssystem för 30 min (1 mL per feeder).</li>
		<li>
Culex spp.: ge smittsamma blodet via en bomullstuss pinne över natten och Värm inte upp blodet (300 µL per injektionsflaska).</li>
		<li>
Aedes albopictus: två droppar (50 µL varje) av blodmjöl mixen i injektionsflaskan med plast och låt myggen foder för 2 h. Värm inte upp blodet. Obs: Myggor kommer att ligga i den första 15 min. Långvarig inkubationstiden är nödvändigt av säkerhetsskäl. Blodet droppar är tömd efter 2 h, således förorening risken minskas under sorteringen av fed myggor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Söva myggor med CO2 för 7 s. Obs: Om myggen vaknar, använda en annan 3 s av CO2.</li>
	<li>Sortera och räkna helt överfyllda myggen in i en ny injektionsflaska.</li>
	<li>Lägg en bomullstuss, mättad med fruktos (8% lösning) mellan injektionsflaskan och en plugg.</li>
	<li>Håll myggen på utsedda temperatur av 18 ° C eller 27 ° C i luftfuktighet på 80% för 14 eller 21 dagar.</li>
	<li>Mata myggor med fruktos-mättade bomullsrondeller. Fylla på varje 72 h med 1,5 mL fruktos (8% lösning) per injektionsflaska (upp till 20 myggor, beroende på utfodring Betygsätt, se steg 2.5).</li>
</ol>3. tvingade salivering test på dag 14 eller 21
Obs: Alla steg utförs BSL-3 villkor.
<ol><li>Utsäde 2 x 104 Vero-celler / per brunn i en 96 väl tallrik med 200 µL av odlingsmedium (Dulbecco´s modifierad eagle medium (DMEM) kompletteras med 3% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 5 µg/mL amfotericin B, 2 mM L-glutamin 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 1% natrium pyruvat).</li>
	<li>
Förbereda salivering enheten:
	<ol>
<li>Placera en kvadrat glasskiva (20 × 20 cm) på bänken i en vinkel på 30°. Obs: Detta är nödvändigt på grund av undertryck i säkerhet labbet. Om plattan är horisontella eller vertikala, läcker vätska.</li>
		<li>Placera dubbelhäftande tejp ovanpå glasskivan.</li>
		<li>Roll modellering lera tills det når 0,5 cm i diameter och bifoga det vågrätt 1 cm från den dubbelhäftande tejpen.</li>
		<li>Skär av de första 0.3 cm av toppen av ett 10 µL filter tips. Obs: Det är klokt att förbereda detta innan experimentet utanför biosäkerhet laboratoriet.</li>
		<li>Fyll filtret tips med 10 µL fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Placera filtret på modellering lera med spetsen mot tejpen.</li>
		<li>Säkra de filter tips med lätt tryck.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Förbereda myggor:
	<ol>
<li>Söva myggor med CO2.</li>
		<li>Ta bort ben och vingar för att immobilisera myggor.</li>
		<li>Fixa den levande Myggan organ på tejpen ovanför ett filter tips.</li>
		<li>Placera snabel försiktigt filtret spetsen.</li>
		<li>Kör salivering analysen för 30 min.</li>
		<li>Ta bort filter tips och kasta lera och tejp.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. behandling av saliv
Obs: Steg 4.1 – 4.6.2 utförs BSL-3 villkor.
<ol><li>Utvisa innehållet in i reaktionsrören som innehåller 10 µL av PBS.</li>
	<li>Blanda försiktigt och överför innehållet i brunnar av beredda 96 väl plattan med hjälp av en väl per prov.</li>
	<li>Inkubera plattan i 7 dagar vid 37 ° C med 5% CO2.</li>
	<li>Använd kikaren för att kontrollera cellerna för förekomsten av cytopatisk effekt (CPE).</li>
	<li>Om brunnen är positivt för CPE, skörda supernatanten genom pipettering 140 µL till en reaktionsröret för RNA-extraktion.</li>
	<li>
Rena RNA med hjälp av en RNA extraktion kit.
	<ol>
<li>Mix 140 µL av supernatanten med 560 µL av AVL buffert (viral lyseringsbuffert) och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
		<li>Tillsätt 560 µL etanol (96%) och vortex provet. Obs: Proven inaktiveras efter detta steg och kan släppas ut ur BSL-3 laboratoriet.</li>
		<li>Pipettera 630 µL av provet på en kolumn och centrifugera med 6 000 x g i 1 min.</li>
		<li>Kassera filtratet, Pipettera den återstående 630 µL på kolumnen och upprepa centrifugeringen.</li>
		<li>Tvätta RNA, bundet till membranet i kolumnen, genom att lägga till 500 µL av tvätt buffert 1 i kolumn och centrifugera vid 6000 x g i 1 min.</li>
		<li>Kassera samling röret och placera kolumnen i en ny samling tub. Tillsätt 500 µL tvätt buffert 2 och centrifugera vid 12500 x g i 3 min.</li>
		<li>Kassera samling röret och placera kolumnen i en 1,5 mL reaktionsröret.</li>
		<li>Tillsätt 50 µL av eluering buffert och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.</li>
		<li>Centrifugera vid 6000 x g i 1 min och sedan kasta kolumnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysera proverna för ZIKV RNA via RT-qPCR.</li>
</ol>5. behandling av mygga organ
Obs: Steg 5.1 – 5.5 utförs BSL-3 villkor.
<ol><li>Ta bort organ av mygga och placera varje kropp i en reaktionsröret. Obs: Det är möjligt att pausa experimentet på denna punkt och förvara proverna vid-80 ° C.</li>
	<li>Tillsätt 500 µL av homogenisering media (DMEM utan någon supplementals) i reaktionsröret.</li>
	<li>Homogenisera kroppen med hjälp av stavmixer motor och använda en ny pistill för varje prov.</li>
	<li>Tillsätt 200 µL av Homogenatet i en 96-brunn-platta för rening. Obs: Det är möjligt att pausa experimentet på denna punkt och förvara proverna vid-80 ° C.</li>
	<li>Inaktivera plattan genom inkubation för 60 min vid 60 ° C.</li>
	<li>Rena RNA genom automatiserade nukleinsyra rening. Obs: Det är möjligt att pausa experimentet på denna punkt och förvara proverna vid-80 ° C.</li>
</ol>6. analys
<ol><li>Kvantifiera den Viral RNA kopior med RT-qPCR. Obs: RNA kopior var i genomsnitt över alla ZIKV-positiv mygga kroppar och utan inklusive ZIKV-negativa myggor.</li>
	<li>Beräkna IR, definierad som antalet ZIKV-positiv mygga organ per antal fed honor.</li>
	<li>Beräkna TR, definierad som antalet myggor med ZIKV-positiv saliv per antal ZIKV-positiv mygga organ. Överföringshastigheten kan inte beräknas för arter-temperatur kombinationer med ingen ZIKV-positivt organ.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus.">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li><li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+selected+African+mosquito+(Diptera:+Culicidae)+species+for+Rift+Valley+fever+virus.">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li><li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses.">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li><li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+salivation+and+virus+transmission.">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li><li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes.">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li><li>Heitmann, A., Jansen, S., L&#252;hken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe.">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li><li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).</li><li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kompendium+der+allgemeinen+Virologie.">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt f&#252;r Veterin&#228;rmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).</li><li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Det har tidigare visat att resultat som erhålls med Tvingad salivering är förenliga med klassiskt åter utfodring experiment6. Dock är åter utfodring experiment såväl i våra presenterade metoden av påtvingad salivering, det omöjligt att direkt bevis salivering aktivitet eller övervaka utgivningen av saliv. För att bevisa salivering aktivitet, prover kunde testas för andra komponenter som finns i saliven (t.ex., proteiner, kolhydrater, etc.). Dessutom skulle ytterligare qPCRs möjliggöra upptäckt av viral RNA kopior. Detta kräver dock dela av saliv prover för olika analyser, vilket kan begränsa känslighet i cell-kultur analysen vid mycket låga partikel nummer. Detta kan i sin tur leda till en underskattning av de beslutsamma överföringshastigheter.
För reproducerbara resultat är det nödvändigt att säkerställa att alla myggor överleva fram till slutet av experimentet. Detta styrs genom att visuellt övervaka aktiviteten kroppen rörelse av myggor. Att principen salivering analysen för en given mygga arter har dessutom testas genom utfodring kontroll virus som är kända för att överföras av denna specifika mygga art. Vice versa, har varje virus som införs i ett experiment som ska testas i en mottagliga mygga.
Tvingad salivering analyser har många fördelar. Kicken numrerar av myggor kan provas samtidigt på en enstaka exemplar som bas under kontrollerade standardiserade förhållanden utan konflikt med djurskydd förordningar9.
Metoden används av flera laboratorier. Exakta uppställningar kan dock variera, vilket kan leda till skillnader i resultaten mellan laboratorier. En kritisk komponent är kapillären att samla saliv, som kan vara gjorda av glas14 eller plast15. För att uppfylla de höga säkerhetsföreskrifterna av en biosäkerhet nivå 3 insectary, använde vi plast filter tips istället för glas kapillärer, vilket minskar risken för skador. Filter tips har dessutom den fördelen att den insamlade vätskan enkelt kan överföras med hjälp av en pipett.
Inställningen av påtvingad salivering analysen presenteras här baseras på två utredare arbetar tillsammans och dela arbetsuppgifter. Demobilisera av mygga utförs av en person, medan den andra förbereder samtidigt påtvingad salivering setup. Det avsevärt minskar hanteringstiden och minimerar risken av provet växling som att byta mellan demobilisering-arbetsplatsen och salivering-plattan är inte nödvändigt. Dessutom tillåter det att placera myggor på Tvingad salivering enheten omedelbart efter demobilisering. Denna ganska korta mygga Hanteringstid är avgörande för framgångsrik Tvingad salivering. Slutligen, myggor kan övervakas direkt för motilitet i hela hela experimentet.
Salivering analysen presenteras här används för att få insikter i vektor potential av mygga arter. Dock att besvara vissa andra särskilda frågor (t.ex., numrerar av myggbett som behövs för att infektera ryggradsdjur), djur experiment kan fortfarande krävas.

I 2015, zikavirus (ZIKV), en moskitburen virus (mobovirus) tillhör familjen flavivirus, uppstod i Columbia och Brasilien och spred sig snabbt över Amerika och Karibien, orsaka en epidemi med anmärkningsvärda antalet associerade kliniska fall av mikrocefali och Guillain – Barrés syndrom1. Myggor av arten Aedes aegypti och Aedes albopictus anses de primära och sekundära vektorerna ZIKV2, men andra arter av släktet Aedes har också visat sig ha experimentella vektor kompetens3 . I motsats till Aedes arter är de flesta av de Culex arter testat hittills inte kan överföra virus4. Data för Culex quinquefasciatus tillhandahålls endast, ofullständiga resultat3. För närvarande saknas information om mygga vektor behörighet för ZIKV vid måttlig temperatur (< 20 ° C). Denna information är dock betydande för riskbedömningarna för möjliga uppslag till områden med tempererat klimat såsom Centraleuropa.
En behörig vektor för ZIKV är att förvärva, bevara, förstärka och slutligen överför viruset. Därför är testning mygga kroppar eller delar av organ, inklusive ben, midgut, huvud eller spottkörtlar, för ZIKV inte tillräckligt att fastställa vektor kompetens. Det är obligatoriskt att testa för infektiösa viruspartiklar inom släppt saliv. För att bedöma vektor kompetens, måste både infektionsfrekvensen (IR, antal ZIKV-positiv mygga organ per antal svullna myggor) och överföringshastighet (TR, antal myggor med ZIKV-positiv saliv per antal ZIKV-positiv mygga organ), vara bestäms. IRs av myggor kan enkelt analyseras av enkelt homogeniserande myggor följt av en transkriptas realtid polymeras-kedjereaktion (RT-qPCR) inriktning ZIKV. Dessutom kan infektionen karakteriseras ytterligare genom att bestämma den virala kopia nummer per mygga. Däremot bygger analysen av överföringshastigheter på detektion av livskraftiga viruspartiklar i saliv från enskilda myggor. Detta kan uppnås genom utfodring av infekterade myggor på mottagliga värddjur, följt av analysen av viremi i värd5. Men denna metod förlitar sig på lämplig modellorganismer och är kostsamma och begränsad av djurskydd förordningar. Undvika användning av försöksdjur för att analysera överföringshastigheter och minska kostnaderna, med blod droppar har varit konstgjorda åter matningssystem beskrivs6. Tester på enskilda skala kombinerat med ett stort antal individer är dock svårt och tidskrävande. Den första beskrivningen av en salivering-analysen i enskilda skala publicerades 19667 och under de senaste åren blivit Tvingad salivering experiment metoden för val att utvärdera vektor behörighetsområde myggor3,8 .
Baserat på vår vektor kompetens studie av centraleuropeiska myggor nyligen publicerade9, beskriver vi Tvingad salivering som rapporterats av Anderson et al. 8 med vissa ändringar. Denna metod tillåter hög genomströmning standardiserade experiment hög biosäkerhet nivå villkor (BSL-3) och omfattar identifiering av aktiv virus av cell kultur baserat analyser. De experiment som beskrivs här inkluderar 856 myggor. De var smittade med ZIKV av konstgjorda blodmjöl och därefter analyseras för förekomst av infektiösa viruspartiklar i saliven. Myggen införs i experiment som består två väletablerade laboratorium populationerna av Ae. aegypti och Culex pipiens pipiens biotyper molestus (Cx. s. molestus), samt fältet Fångad Culex pipiens pipiens biotyp pipiens (Cx. s. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) och två Ae. albopictus populationer. Med undantag för en av de två Ae. albopictus befolkningarna, som samlades in i Italien, samlades alla myggor i Tyskland.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inject+matic Sleeper</td>
			<td>Inject+matic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td>
			<td>BugDorm Store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK11.2</td>
			<td>plastic vial for mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug for drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK15.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant climate chamber</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KBF-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont-Pincette Electronic SS</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>B40c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>BNITM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flash light aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td>
			<td>Ansell</td>
			<td></td>
			<td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td>
			<td>altona diagnostics</td>
			<td>591013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>4462359</td>
			<td>RNA isolation of mosquito bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td>RNA-Isolation of supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips (20 &#181;L)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>701,116,210</td>
			<td>Cut the first 3 mm of the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>sold out</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro pestles for hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>CXH8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td>P0403550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P06-0110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>4981.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0443100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NAA</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0832100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek Feeder</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler Software</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 SW 1.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King Fisher Flex Purification System</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes albopictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular light</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>MLC-150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

Vector kompetens definieras som en mygga arter potential att överföra en moskitburen virus (mobovirus) till en vertebrate värd. Livskraftig viruspartiklarna överförs under en blodmjöl via saliv från en infekterad mygga. Tvingad salivering analyser tillåter att fastställa vektor potential utifrån enstaka myggor, undvika användning av djurförsök. Metoden är lämplig att analysera ett stort antal myggor i ett experiment inom en kort tidsperiod. Tvingad salivering analyser användes för att analysera 856 enskilda myggor fångade i Tyskland, inklusive två olika Culex pipiens pipiens biotyper, Culex torrentium samt Aedes albopictus, som var experimentellt infekterade med zikaviruset (ZIKV) och inkuberas vid 18 ° C eller 27 ° C i två och tre veckor. Resultaten indikerade avsaknaden av vektor kompetens av de olika Culex taxa för ZIKV. Däremot var Aedes albopictus mottagliga för ZIKV, men endast vid 27 ° C, med dataöverföringen klassar liknar en Aedes aegypti laboratorium koloni testas parallellt.

Aedes aegypti är känd som en behöriga vektor för ZIKV minst under tropiska klimatförhållanden12. Därför använde vi Ae. aegypti som en positiv kontroll att fastställa analysen och analysera IRs samt TRs vid en inkubation temperatur på 27 ° C och en luftfuktighet på 80%. IR och TR definierades som tidigare beskrivs av Fortuna et al. 13. visade IR 50% och 72% och TR 42% och 31% på 14 till 21 dagar efter infektion (dpi), respektive målet utmanade Ae. aegypti (figur 1A och 1B). Därefter testades Europeiska myggor för ZIKV infektion och överföring med hjälp av såväl tropiska som tempererade klimatförhållanden.
Vid 27 ° C inkubation temperatur visade alla mygga arter ZIKV infektion vid 14 dpi samt 21 dpi, utom Cx. s. pipiens och Cx. torrentium individer, som var positivt med 14 dpi enbart. Alla Aedes arter visade högre IRs (mellan 50% och 72%) samt högre viral RNA-koncentrationen (106 upp till 109 RNA kopior-mosquito exemplar) i jämförelse med de olika Culex taxa, som avslöjade IRs mellan 0 % och 32% och virusbelastning 103 till 104 RNA kopior-mosquito exemplar. Alla Aedes arter visas ZIKV-positiv saliv (TR 13 – 42%), medan inga av de saliv proverna från de Culex taxa innehöll ZIKV (figur 1A och 1B). Intressant, överföringshastigheter på 21 dpi var liknande i Ae. aegypti och Ae. albopictus från Tyskland (30%), men var avsevärt lägre i Ae. albopictus från Italien (13%).
Inkubering av utmanade myggor på en dämpatemperatur av 18 ° C visade generellt lägre viruset laddar i Aedes arten (104– 106 RNA kopior/mygga) samt i de olika Culex taxa (102 –104 RNA kopior/mygga). Dock vid 18 ° C inkubation temperatur observerades överföring av ZIKV inte för någon av de mygga arter utredas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Figur 1: dataöverföringen klassar av myggor experimentellt infekterade med ZIKV. Studieresultat för vektor kompetens ZIKV i olika mygga arter. Sex olika mygga taxa var infekterade med ZIKV och inkuberas vid 27 ° C eller 18 ° C för 14 (A) eller 21 (B) dagar. TR definieras som antalet myggor med ZIKV-positiv saliv per antal ZIKV-positiv mygga organ. Det totala antalet myggor undersökt var 856, med ett minimum av 30 personer för varje tid punkt-temperatur/mosquito taxa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes at JoVE.com

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Tvingade salivering som en metod att analysera vektor kompetens av myggor

För effektiv kontroll av mygga borne virus överföring, är kunskapen av vektor potential respektive myggor av särskilt intresse. Vi beskriver Tvingad salivering som en metod att analysera vektor behörighetsområde Aedes albopictus och tre olika Culex taxa för överföring av zikavirus.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Injektion av ett. stephensi embryon till Generera malaria resistenta myggor

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Mikroinjektion av A. aegypti Embryon Skaffa Transgena myggor

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Förhindra spridning av malaria och denguefeber att använda genetiskt modifierade myggor

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Användning av Rotorod som en metod för kvalitativ analys av Walking i Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Mikroinjektion av Zebrafish embryon till Analysera genfunktion

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-detektion analys för Malaria Överföring Myggor

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion som en metod för vaskulär visualisering i<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Att upprätthålla Aedes aegypti myggor infekterade med Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoll för testning av romanen insektsbekämpning kemier mygg toxicitet

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...