Name: saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Vi takker Laszlo Tora for hans støtte og V. Fisher, K. Schumacher og F. El Saafin for deres drøftelser. T.B. blev støttet af et Marie Curie-ITN fellowship (PITN-GA-2013-606806, NN-NET) og Fondation ARC. Dette arbejde blev støttet af midler fra den Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Denne undersøgelse blev også støttet af ANR-10-LABX-0030-INRT, en fransk statens fond forvaltet af Agence Nationale de la Recherche under ramme program Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. celle dyrkning og Rapamycin udtømning af en SAGA Subunit
<ol><li>For hver S. cerevisiae stamme og kopiere podes herunder wild-type eller kontrol stammer, en enkelt koloni fra en frisk plade på 5 mL af YPD-medium (2% pepton, 1% gærekstrakt og 2% glukose).</li>
	<li>Vokse S. cerevisiae celler natten over ved 30 ° C med konstant agitation (150 rpm).</li>
	<li>Måle den optisk tæthed på 600 nm (OD600) og fortyndes kultur til en OD600 af ca. 0,1 i 100 mL YPD medium og lad det...

<ol>
	<li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Run-On+Sequencing+(GRO-Seq).">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+elongating+transcript+sequencing+(NET-seq).">Native elongating transcript sequencing (NET-seq).</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Kenzelmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals.">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).</li><li>Radle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+genome-wide+RNA+synthesis+and+decay+rates+with+Dynamic+Transcriptome+Analysis+(DTA).">Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA).</a> Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+eukaryotic+mRNA+degradation+reveals+Xrn1-dependent+buffering+of+transcript+levels.">Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels.</a> Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+dynamic+transcriptome+analysis+(cDTA)+reveals+mutual+feedback+between+mRNA+synthesis+and+degradation.">Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation.</a> Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Eser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+metabolism+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+genome.">Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome.</a> Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).</li><li>Baptista, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAGA+Is+a+General+Cofactor+for+RNA+Polymerase+II+Transcription.">SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).</li><li>Bonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SAGA+coactivator+complex+acts+on+the+whole+transcribed+genome+and+is+required+for+RNA+polymerase+II+transcription.">The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription.</a> Genes &amp; Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).</li><li>Warfield, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+Nearly+All+Yeast+RNA+Polymerase+II-Transcribed+Genes+Is+Dependent+on+Transcription+Factor+TFIID.">Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID.</a> Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).</li><li>Huisinga, K. L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+housekeeping+role+for+TFIID+and+a+highly+regulated+stress-related+role+for+SAGA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).</li><li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+roles+for+the+TFIID+and+SAGA+complexes+in+global+transcription.">Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription.</a> Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).</li><li>Lenstra, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+and+topology+of+chromatin+interaction+pathways+in+yeast.">The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast.</a> Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).</li><li>Plaschka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Mediator+core+initiation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex.</a> Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).</li><li>Helenius, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TFIIH+kinase+subunit+Mat1+for+RNA+Pol+II+C-terminal+domain+Ser5+phosphorylation,+transcription+and+mRNA+turnover.">Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover.</a> Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).</li><li>Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Covalent+Inactivation+of+TFIIH-Kinase+Reveals+an+Elongation+Checkpoint+and+Results+in+Widespread+mRNA+Stabilization.">Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization.</a> Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).</li><li>Haimovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+is+circular:+factors+for+mRNA+degradation+also+foster+mRNA+synthesis.">Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis.</a> Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+RNA+kinetics+using+RATE-seq.">Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq.</a> RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).</li><li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spt5+Plays+Vital+Roles+in+the+Control+of+Sense+and+Antisense+Transcription+Elongation.">Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation.</a> Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Paf1C-TFIIS+transcription+elongation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex.</a> Nature Communications. 8, 15741 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).</li><li>Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+NET-seq+analysis+defines+nascent+RNA+profiles+and+associated+RNA+processing+genome-wide.">Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide.</a> Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).</li><li>Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+comprehensive+representation+of+uniqueness+for+next-generation+sequencing+by+minimum+unique+length+analyses.">Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses.</a> PloS One. 8 (1), 53822 (2013).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hundreds+of+novel+UPF1+target+transcripts+by+direct+determination+of+whole+transcriptome+stability.">Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability.</a> RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo.+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Palozola, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+transcription+and+waves+of+gene+reactivation+during+mitotic+exit.">Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit.</a> Science. 358 (6359), 119-122 (2017).</li><li>Ardehali, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+Repressive+Complex+2+Methylates+Elongin+A+to+Regulate+Transcription.">Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).</li><li>Schulz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+surveillance+by+selective+termination+of+noncoding+RNA+synthesis.">Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis.</a> Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Duffy, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Rutkowski, A. J., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing,+and+Decay+by+Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+Using+4-Thiouridine.">High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).</li><li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li><li>Fuchs, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+genome-wide+transcription+elongation+speeds+and+rates+of+RNA+polymerase+II+transition+into+active+elongation+with+4sUDRB-seq.">Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq.</a> Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome.">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li></ol>

Mens genome-wide værktøjer til at analysere ændringer i transskription bliver stadig bedre, kan den eneste analyse af transkriptom gennem kvantificering af steady state niveauer af RNA ikke præcist afspejler ændringer i RNA polymerase II aktivitet. Faktisk, mRNA niveauer er reguleret af RNA syntese, men også af deres modning og nedbrydning. For at måle mRNA syntese sammenkædet fra mRNA nedbrydning, er adskilte protokoller blevet udviklet i de seneste år til analyse af spirende transskription i både gær og patt...

Celler reagerer på endogene og eksogene stikord, gennem den dynamiske ændring af deres gen expression program. I de seneste år tillader en enorm udvikling af genome-wide metoder en præcis og omfattende beskrivelse af transkriptom ændringer i forskellige betingelser. I de fleste transkriptom undersøgelser, microarray hybridisering eller høj overførselshastighed sekventering bruges til at kvantificere RNA niveauer fra en total steady-state RNA brøkdel. Transkriptionel ændringer under en bestemt undertrykkelse af netbårne kan vise en bred vifte af mulige udfald, med enten bestemt gen expression ændringer eller et stort spektrum af gener er enten op- eller downregulated. Genekspression er resultatet af en finjusteret ligevægt — eller steady-state — mellem RNA syntese af RNA polymeraser og andre processer, der påvirker RNA niveauer. RNA-polymerase II transskription, herunder dens tre særskilte faser (indledning, strækforlængelse og opsigelse), er stærkt og uløseligt forbundet med mRNA behandling, cytoplasmatisk eksport, oversættelse og nedbrydning.
Flere nyere undersøgelser viste, at mRNAs syntese og tænderne er koblet mekanismer og viste at transcriptional effekter ved mutation eller under stimuli kan blive overset, når kvantificere samlede steady-state RNA. Første afhænger påvisning af transcriptional ændringer gennem analyser af steady state niveauer af mRNA altid mRNAs half-life. Når den undertrykkelse af netbårne er indført, vil steady state niveauer af mRNAs med lange halveringstider langt mindre påvirket end mRNAs med korte halveringstider. Derfor, sporbarhed af ændringer i RNA syntese er kraftigt forudindtaget til fordel for kortvarig udskrifter, mens analyse af teknologiinvesteringer mRNA arter kan mislykkes at afsløre dynamiske ændringer i transskription sats. Andet, flere rapporter har vist, at både i gær og pattedyr, globale ændringer i transskription kan blive overset når analyserer steady state niveauer af mRNA. Dette er sandsynligvis på grund af de mekanismer, der knytter mRNA syntese og nedbrydning som følge i mRNA buffering. Dette bedt om udviklingen af nye protokoller at kvantificere mRNA syntese sammenkædet fra nedbrydning, gennem en analyse af nyligt transskriberede mRNA. I de seneste år, er blevet præsenteret flere alternativer, herunder globale køre sekventering (GRO-seq)1og indfødte brudforlængelse udskrift sekventering (NET-seq)2,3. Her, fremlægger vi en protokol i første omgang udviklet i pattedyrceller4,5,6 og derefter tilpasset gær7,8,9,10, 11, som er baseret på RNA mærkning med en thiolated nucleoside eller base analog, 4-thiouridine (4sU) eller 4-thiouracil (4tU), henholdsvis.
Denne metode specielt renser nyligt transskriberede RNA fra cellerne i hvilke RNA er puls-mærket med 4sU med næsten ingen indblanding i celle homøostase. Derfor, når cellerne er udsat for 4sU, molekylet er hurtigt uptaken, fosforyleret til 4sU-trifosfat, og indarbejdet i RNA'er er transskriberet. Når puls-mærket, det er muligt at udtrække samlede cellulære RNA (svarende til steady state niveauer af RNA), og efterfølgende 4sU-mærket RNA brøkdel er thiol-specielt ændret, fører til dannelsen af en disulfid obligation mellem biotin og de nyligt transskriberet RNA4,5. 4sU kan dog kun være uptaken af de celler, der udtrykker en nucleoside transportøren, som den menneskelige equilibrative nucleoside transporter (hENT1), forhindrer dets umiddelbare anvendelse i spirende eller fission gær. Mens man kunne udtrykke hENT1 i enten S. pombe eller S. cerevisiae, kan en lettere tilgang opnås ved hjælp af den ændrede base 4tU, da gærceller kan 4tU, uden savn i udtryk for en nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. I virkeligheden, metabolismen af 4tU kræver aktiviteten af enzymet uracil phosphoribosyltransferase (UPRT). I mange organismer, herunder gær men ikke pattedyr, er UPRT afgørende for en pyrimidin bjærgning pathway, genbrug uracil til uridine monophosphate.
En vigtig skævhed i transkriptom undersøgelser kan indføres ved normalisering mellem forskellige prøver analyseres samtidig. Faktisk, mange afvigende faktorer kan påvirke den sammenlignende analyse af transkriptom mutant og vildtype stammer: effektiviteten af cellen lysis, forskelle i udvinding og genanvendelse af RNA, og afvigelser i scanner kalibrering for microarray analyser , blandt andre. Som beskrevet ovenfor, kan sådanne variationer især vildledende, når der forventes globale virkninger på RNA polymerase II transskription. En elegant betyder præcist at sammenligne mRNA syntese satser mellem forskellige prøver blev udviklet ved hjælp af fjernt beslægtede fission gær Schizosaccharomyces pombe som en intern standard. For at et fast antal mærket S. pombe celler føjes til S. cerevisiae prøver, enten wild-type eller muterede celler, før cellen lysis og RNA udvinding10. Efterfølgende, er både steady-state og nyligt syntetiserede RNA'er fra S. pombe og S. cerevisiae kvantificeret enten af RT-qPCR eller via brugen af microarray chips eller høj overførselshastighed sekventering10. Ved at kombinere disse data med kinetic modellering, kan absolut satser af mRNA syntese og nedbrydning i spirende gær måles.
Inden for rammerne af dette manuskript, vil vi vise, hvordan analysen af nyligt transskriberede RNA lov til at afsløre en global rolle for coactivator komplekser SAGA og TFIID i RNA polymerase II transskription i spirende gær14,15, 16. Vigtigere, tidligere undersøgelser kvantificeret steady-state mRNA niveauer i S. cerevisiae og foreslog, at SAGA spiller en fremherskende funktion på et begrænset sæt af gær gener, som er stærkt berørt af mutationer i SAGAEN, men relativt resistente over for TFIID mutationer17,18,19. Overraskende, blev SAGA enzymaktiviteter vist til at handle på det hele transskriberede genom, tyder på en bredere rolle for denne Co aktivator i RNA polymerase II transskription. Nedsat RNA polymerase II ansættelse på mest udtrykte gener blev observeret ved inaktivering af SAGA eller TFIID, hvilket tyder på, at disse coactivators arbejde sammen på de fleste gener. Dermed, kvantificering af nyligt transskriberede mRNA afslørede, at SAGA og TFIID er nødvendige for transskription af næsten alle gener af RNA polymerase II14,15,16. Gennemførelsen af kompenserende mekanismer fremstår som en måde for cellerne til at håndtere en global nedgang i mRNA-syntese, der er adskilt af en samtidig global nedgang i mRNA nedbrydning. SAGA tilføjer til listen over faktorer at have en global indvirkning på RNA polymerase II transskription, såsom RNA Pol II underenheder10, mægler coactivator komplekse20, generelt transskription faktor TFIIH21,22 , og indirekte elementer af mRNA nedbrydning maskiner9,10,23. Sådanne kompensatoriske begivenheder var universelt observeret i SAGA mutanter, tegner sig for de beskedne og begrænsede ændringer i steady-state mRNA niveauer på trods af en global og alvorlige nedgang i mRNA syntese14. Lignende analyser er også udført i en BRE1 sletning stamme, hvilket resulterede i et fuldstændigt tab af Histon H2B ubiquitination. Interessant, der kunne påvises en meget mildere, men konsekvent globale virkning på RNA polymerase II transskription i mangel af Bre1, der angiver, at metaboliske mærkning af nyligt transskriberede RNA i gær kan detektere og kvantificere en lang række ændringer i mRNA syntese satser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">4-Thiouracil</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 440736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:119px;">Euromedex</td>
			<td style="width:139px;">Cat# SYN-1185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:216px;">RiboPure RNA Purification kit, yeast</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# AM1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">EZ-Link HPDP Biotin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 21341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Thiolutin</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:139px;">ab143556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">&#181;MACS Streptavidin kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 130-074-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Transcriptor Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">03 531 295 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SYBR Green I Master</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Yeast Genome 2.0</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">900555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity

Globale defekter i RNA polymerase II transskription kan blive overset af transkriptom undersøgelser analysere steady-state RNA. Faktisk, den globale fald i mRNA syntese har vist sig at blive opvejet af et samtidigt fald i mRNA nedbrydning at genoprette normale steady state niveauer. Genome-wide kvantificering af mRNA syntese, uafhængigt af mRNA i tænderne, er derfor den bedste direkte afspejling af RNA polymerase II transcriptional aktivitet. Her diskuterer vi en metode ved hjælp af ikke-forstyrrende metaboliske mærkning af spirende RNA'er i Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifikt, cellerne er kulturperler i 6 min. med en uracil analog, 4-thiouracil, og at mærket nyligt transskriberede RNA'er er renset og kvantificeret Bestem syntese satser for alle individuelle mRNA. Desuden ved hjælp af mærket Schizosaccharomyces pombe celler som intern standard giver mulighed for sammenligning af mRNA syntese i forskellige S. cerevisiae stammer. Ved hjælp af denne protokol og montering data med en dynamisk kinetiske model, kan de tilsvarende mRNA henfald satser bestemmes.

Når du udfører metaboliske mærkning af nyligt transskriberede RNA, flere aspekter skal kontrolleres: tid og effektivitet mærkning, spike-i andelen, udvinding protokol og biotinylation effektivitet (herunder signal-støj-forhold), blandt andre. Disse betingelser har været omfattende og metodisk vist af andre7,10,11. Her fokuserer vi hovedsageligt på fortolkning og umiddelbar analyser, der ka...

Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Protokollen beskrevet her er baseret på en genome-wide kvantificering af nyligt syntetiserede mRNA renset fra gærceller mærket med 4-thiouracil. Denne metode gør det muligt for at måle mRNA syntese sammenkædet fra mRNA i tænderne og således giver en nøjagtig måling af RNA polymerase II transskription.

Saccharomyces cerevisiae Metaboliske mærkning med 4-thiouracil og kvantificering af nyligt syntetiserede mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Den største fordel ved denne teknik er, at den afspejler RNA polymerase II aktivitet ved at måle nyligt syntetiseret mRNA, som ikke er påvirket af RNA nedbrydning. Denne protokol blev oprindeligt beskrevet ved hjælp af microarray hybridisering, men kan nemt vedtages til høj-hele sekventering af nyligt transskriberede mRNA. Demonstrere denne procedure vil være Tiago Baptista, en tidligere Grad studerende fra vores laboratorium.Efter podning af S.cerevisiae celler, dyrke dem natten over ved 30 grader Celsius med konstant agitation ved 150 RPM. Den næste dag, måle den optiske tæthed ved 600 nanometer. Fortynd kulturen til en OD600 på ca. 0,1 i 100 milliliter YPD-medium.Vokse op cellerne, indtil OD600 er omkring 0,8. Efter dette, måle OD600 af S.pombe natten kultur. Fortynd denne kultur til en OD600 på ca. 0,1 i 500 milliliter YAS-medium og lad den vokse op, indtil OD600 er ca. 0,8.Først forberede en frisk løsning på to molar fire-thiouracil. Hold den forberedte opløsning ved stuetemperatur og beskyttet mod lys. Tilsæt fire-thiouracil løsning til S.cerevisiae og S.pombe kulturer sådan, at den endelige koncentration er fem millimolar.Inkuber S.cerevisiae og S.pombe kulturer ved 30 grader Celsius og 32 grader Celsius henholdsvis med konstant agitation i seks minutter. Derefter fjernes en lille undersag af hver kultur og tælle cellerne ved hjælp af enten en automatisk celletæller eller et Neubauer kammer. Centrifuge ved 2, 500 gange g og fire grader Celsius i fem minutter for at indsamle cellerne.Kassér supernatanten og vask cellerne med iskold en gang PBS. Centrifuge igen ved 2, 500 gange g og fire grader Celsius i fem minutter. Dernæst resuspenderede cellerne i fem milliliter iskold en gang PBS.Bland S.cerevisiae og S.pombe celler i et forhold på tre til en. Centrifuge de blandede prøver på 2, 500 gange g og fire grader Celsius i fem minutter. Fjern derefter PBS og flash fryse cellerne i flydende nitrogen.Prøven opbevares ved negative 80 grader Celsius, indtil den er klar til brug. Når du er klar til at fortsætte, tø cellerne på is i ca 20 til 30 minutter. Brug et tilpasset gær-RNA-ekstraktionssæt til at udtrække RNA'et som beskrevet i tekstprotokollen.Derefter overføres filterpatronen til det endelige opsamlingsrør. Eluter RNA med 50 mikroliter DEPC-behandlet RNase-frit vand, der blev forvarmet til 100 grader Celsius. Centrifuge ved 16,000 gange g i et minut.Brug derefter 50 mikroliter forvarmet DEPC-behandlet RNase-frit vand til at fremkalde RNA'et igen til det samme rør. Centrifuge ved 16.000 gange g i et minut, og sørg for, at hele prøvevolumenet er passeret gennem filteret. Hvis det ikke er tilfældet, centrifuge igen i en længere periode.Når prøven er færdig, kvantificeres og kontrolleres dens renhed ved hjælp af det relevante udstyr. Brug DEPC-behandlet nukleasefrit vand til at justere koncentrationen af det tidligere erhvervede RNA til to milligram pr. milliliter. Aliquot 200 mikrogram af den samlede RNA og varme det ved 60 grader Celsius i 10 minutter.Chill det straks på is i to minutter. Der tilsættes 600 mikroliter DEPC-behandlet RNase-frit vand. Tilsæt 100 mikroliter biotinylation buffer og derefter tilføje 200 mikroliter af biotin HPDP.Hvis biotin-HPDP-opløsningen udfældes ud af opløsningen, skal du øge mængden af DMSO eller DMF op til 40 % af reaktionsvolumenet som beskrevet i tekstprotokollen. Beskyt prøven mod lys og inkuber den ved stuetemperatur med forsigtig omrøring i tre timer. Derefter tilsættes et omtrent lige stort chloroform til rørene og blandes kraftigt.Centrifuge ved 13, 000 gange g og fire grader Celsius i fem minutter. Derefter forsigtigt overføre den øverste fase i nye to milliliter rør. Der tilsættes en mængde fem molarnatriumchlorid svarende til ca. 1/10 af prøvevolumenet.Bland derefter prøven. Først opvarmes det biotinylerede RNA ved 65 grader Celsius i 10 minutter. Chill derefter prøverne på is i fem minutter.Der tilsættes 100 mikroliter Streptavidin-belagte magnetiske perler til det biotinylede RNA. Inkuberes ved stuetemperatur med let omrystning i 90 minutter. Anstrej de kolonner, der er forsynet med sættet, i den magnetiske stander.Dernæst tilsættes 900 mikroliter af rumtemperatur vask buffer til kolonnerne. Påfør 200 mikroliterperlen og RNA-blandingen på kolonnerne. Opsaml flow-through i 1,5 milliliter rør og derefter anvende det igen til den samme magnetiske kolonne.Hold denne flow-through, hvis det er nødvendigt, da det repræsenterer den umærkede RNA fraktion. For at begynde RT-qPCR validering af de forskellige brøker, først syntetisere cDNA som skitseret i teksten. Ampyr derefter cDNA ved qPCR i realtid ved hjælp af en standardprotokol.De målte niveauer af udskrifter i fraktioner renset fra vilde celler dyrket med og uden fire-thiouracil bekræftet denne procedure specifikt renser mærket RNA. Analyse af spt20 deltastammen viser, at mængden af total steady-state RNA stort set er uændret eller kun er let reduceret for de testede gener. Lignende resultater ses for stammer slettet for bre1.Men, analyse af nyligt transskriberede RNA i spt20 delta stamme afslører en tre til fem gange fald i mRNA syntese for alle testede gener. I mellemtiden, tabet af bre1 fører til en mere diskret, men stadig synlig fald. Ved inducerelig udtømning af spt7 reduceres en strukturel underenhed af sagakomplekset, nyligt transskriberede mRNA-niveauer i et omfang, der svarer til sletningsstammen.Når det samlede RNA-niveau måles ved genomanalyse, ses kun nogle få gener at have deres ekspressionsniveauer ændret ved sletning af spt20 enten ved opregulering eller nedregulering. Men, analyse af den nyligt transskriberede RNA afslører, at niveauet af over 4, 000 gener er væsentligt reduceret mindst to gange ved sletning af spt20 hvilket tyder på en global positiv effekt af sagaen på RNA polymerase II transskription i spirende gær. Selvom denne metode kan give indsigt i transskription i Saccharomyces cerevisiae, blev den kun anvendt med små variationer til Ved hjælp af denne protokol kunne vi detektere et globalt fald i mRNA-syntesen, som blev kompenseret af et globalt fald i mRNA-nedbrydningen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-medieret Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genom-bred kortlægning af protein-DNA-interaktioner med ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Måling af mRNA niveauer Over tid under gær S. cerevisiae hypoksiske svar

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliske mærkning og profilering af overførsel RNA'er ved hjælp af Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kvantitative opdagelse af RNA-afhængige RNA Polymerase aktivitet af menneskelige Telomerase Reverse transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) af Histon ændringer fra Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metoder til nøjagtig detektering af mitokondrie-DNA methylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering af en universel indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion til påvisning af Lyssavira

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstige RNA polymerase II forlængede komplekser til dissekering af co-transkriptionelle RNA-behandlings hændelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...