Name: saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Wij danken Laszlo Tora voor zijn steun en V. Fisher, K. Schumacher en F. El Saafin voor hun discussies. T.B. werd gesteund door een Marie Curie-ITN fellowship (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) en de Fondation ARC. Dit werk werd gesteund door fondsen van het Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Deze studie werd ook ondersteund door ANR-10-LABX-0030-INRT, een Franse staat Fonds beheerd door de Agence Nationale de la Recherche onder het frame programma Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. cel kweken en Rapamycin uitputting van een Subunit SAGA
<ol><li>Voor elke S. cerevisiae stam en repliceren enten met inbegrip van wild-type of control stammen, een één kolonie van een verse plaat op 5 mL van YPD medium (2% pepton, gistextract 1% en 2% glucose).</li>
	<li>S. cerevisiae cellen 's nachts bij 30 ° C met constante agitatie (150 rpm) groeien.</li>
	<li>Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) en Verdun de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 100 mL van...

<ol>
	<li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Run-On+Sequencing+(GRO-Seq).">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+elongating+transcript+sequencing+(NET-seq).">Native elongating transcript sequencing (NET-seq).</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Kenzelmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals.">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).</li><li>Radle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+genome-wide+RNA+synthesis+and+decay+rates+with+Dynamic+Transcriptome+Analysis+(DTA).">Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA).</a> Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+eukaryotic+mRNA+degradation+reveals+Xrn1-dependent+buffering+of+transcript+levels.">Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels.</a> Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+dynamic+transcriptome+analysis+(cDTA)+reveals+mutual+feedback+between+mRNA+synthesis+and+degradation.">Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation.</a> Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Eser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+metabolism+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+genome.">Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome.</a> Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).</li><li>Baptista, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAGA+Is+a+General+Cofactor+for+RNA+Polymerase+II+Transcription.">SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).</li><li>Bonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SAGA+coactivator+complex+acts+on+the+whole+transcribed+genome+and+is+required+for+RNA+polymerase+II+transcription.">The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription.</a> Genes &amp; Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).</li><li>Warfield, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+Nearly+All+Yeast+RNA+Polymerase+II-Transcribed+Genes+Is+Dependent+on+Transcription+Factor+TFIID.">Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID.</a> Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).</li><li>Huisinga, K. L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+housekeeping+role+for+TFIID+and+a+highly+regulated+stress-related+role+for+SAGA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).</li><li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+roles+for+the+TFIID+and+SAGA+complexes+in+global+transcription.">Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription.</a> Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).</li><li>Lenstra, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+and+topology+of+chromatin+interaction+pathways+in+yeast.">The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast.</a> Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).</li><li>Plaschka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Mediator+core+initiation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex.</a> Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).</li><li>Helenius, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TFIIH+kinase+subunit+Mat1+for+RNA+Pol+II+C-terminal+domain+Ser5+phosphorylation,+transcription+and+mRNA+turnover.">Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover.</a> Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).</li><li>Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Covalent+Inactivation+of+TFIIH-Kinase+Reveals+an+Elongation+Checkpoint+and+Results+in+Widespread+mRNA+Stabilization.">Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization.</a> Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).</li><li>Haimovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+is+circular:+factors+for+mRNA+degradation+also+foster+mRNA+synthesis.">Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis.</a> Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+RNA+kinetics+using+RATE-seq.">Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq.</a> RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).</li><li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spt5+Plays+Vital+Roles+in+the+Control+of+Sense+and+Antisense+Transcription+Elongation.">Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation.</a> Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Paf1C-TFIIS+transcription+elongation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex.</a> Nature Communications. 8, 15741 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).</li><li>Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+NET-seq+analysis+defines+nascent+RNA+profiles+and+associated+RNA+processing+genome-wide.">Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide.</a> Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).</li><li>Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+comprehensive+representation+of+uniqueness+for+next-generation+sequencing+by+minimum+unique+length+analyses.">Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses.</a> PloS One. 8 (1), 53822 (2013).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hundreds+of+novel+UPF1+target+transcripts+by+direct+determination+of+whole+transcriptome+stability.">Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability.</a> RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo.+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Palozola, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+transcription+and+waves+of+gene+reactivation+during+mitotic+exit.">Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit.</a> Science. 358 (6359), 119-122 (2017).</li><li>Ardehali, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+Repressive+Complex+2+Methylates+Elongin+A+to+Regulate+Transcription.">Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).</li><li>Schulz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+surveillance+by+selective+termination+of+noncoding+RNA+synthesis.">Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis.</a> Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Duffy, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Rutkowski, A. J., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing,+and+Decay+by+Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+Using+4-Thiouridine.">High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).</li><li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li><li>Fuchs, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+genome-wide+transcription+elongation+speeds+and+rates+of+RNA+polymerase+II+transition+into+active+elongation+with+4sUDRB-seq.">Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq.</a> Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome.">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li></ol>

Terwijl genoom-brede tools om te analyseren van wijzigingen in de transcriptie nog steeds verbeteren zijn, kan de enige analyse van transcriptome door middel van de kwantificering van de stationaire toestand niveaus van RNA niet nauwkeurig overeen wijzigingen in RNA polymerase II activiteit. Inderdaad, mRNA niveaus worden geregeld, niet alleen door RNA-synthese, maar ook door hun rijping en afbraak. Voor het meten van mRNA-synthese rekken van mRNA afbraak, zijn verschillende protocollen ontwikkeld in de afgelopen jaren v...

Cellen reageren op signalen van endogene en exogene, via de dynamische wijziging van hun gen expressie programma. In de afgelopen jaren kunt een enorme ontwikkeling van genoom-brede methodologieën de nauwkeurige en uitgebreide beschrijving van transcriptome wijzigingen in verschillende omstandigheden. In de meeste studies van de transcriptomic, microarray kruising of high-throughput sequencing worden gebruikt om RNA niveaus van een totale breuk van de stationaire toestand RNA te kwantificeren. Transcriptionele wijzigingen onder een specifieke perturbation kunnen een breed scala van mogelijke uitkomsten, met specifiek gen expressie veranderingen of een groot spectrum van genen up - of werden weergegeven. Genexpressie is het resultaat van een verfijnd evenwicht — of stationaire toestand — tussen RNA synthese van RNA polymerase en andere processen op het gebied van RNA niveaus. RNA polymerase II transcriptie, met inbegrip van haar drie verschillende fasen (initiatie, rek, en beëindiging), is zeer en ingewikkeld gekoppeld mRNA verwerking, cytoplasmatische export, vertaling en afbraak.
Verscheidene recente studies aangetoond dat mRNAs synthese en verval gekoppelde mechanismen en toonde dat transcriptionele effecten bij mutatie of onder prikkels worden over het hoofd gezien kunnen wanneer de totale steady-state RNA te kwantificeren. Ten eerste hangt de detectie van transcriptionele veranderingen door de analyses van de stationaire toestand niveaus van mRNA altijd mRNAs half-life. Zodra de verstoring wordt ingevoerd, zal de steady-state niveaus van mRNAs met lange halfwaardetijd veel minder dan die van mRNAs met korte halfwaardetijd worden beïnvloed. De detecteerbaarheid van de veranderingen in RNA-synthese is daarom sterk bevooroordeeld ten gunste van kortstondige afschriften, terwijl de analyse van langduriger mRNA soorten mislukken te onthullen van dynamische veranderingen in de transcriptie tarief. Ten tweede, verschillende rapporten is gebleken dat zowel in gist en zoogdieren, mondiale veranderingen in de transcriptie worden over het hoofd gezien kunnen bij het analyseren van de niveaus van de stationaire toestand van mRNA. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de mechanismen die link mRNA-synthese en degradatie resulterend in mRNA bufferen. Dit leidde tot de ontwikkeling van nieuwe protocollen te kwantificeren van mRNA-synthese rekken van degradatie, door de analyse van nieuwe getranscribeerde mRNA. In de afgelopen jaren zijn diverse alternatieven ingediend, met inbegrip van mondiale run-on sequencing (GRO-seq)1en inheemse rek transcript sequencing (NET-seq)2,3. Hier, presenteren we een protocol oorspronkelijk is ontwikkeld in zoogdiercellen4,5,6 en vervolgens aangepast aan gist7,8,9,10, 11, die is gebaseerd op RNA labelen met een thiolated nucleoside of base analoog, 4-thiouridine (4sU) of 4-thiouracil (4tU), respectievelijk.
Deze methode specifiek zuivert nieuw getranscribeerde RNA van cellen in welke RNA zijn pols-aangeduid met 4sU met vrijwel geen inmenging in de homeostase van de cel. Zodra de cellen worden blootgesteld aan 4sU, is het molecuul dus snel uptaken, phosphorylated aan 4sU-trifosfaat, en opgenomen in de RNAs wordt getranscribeerd. Als puls-label, is het mogelijk om uit te pakken van totale cellulaire RNA (overeenkomend met de steady-state niveaus van RNA) en vervolgens de 4sU-geëtiketteerden RNA breuk thiol-specifiek is gewijzigd, wat leidt tot de vorming van een Zwavelbrug tussen Biotine en de nieuw Getranscribeerd RNA4,5. 4sU kunnen echter alleen uptaken door de uiting van een nucleoside-vervoerder, zoals de menselijke equilibrative nucleoside vervoerder (hENT1), voorkomen van het directe gebruik ervan in de ontluikende of kernsplijting gist cellen. Terwijl men kon hENT1 S. pombe of S. cerevisiaeexpress, kan een eenvoudiger aanpak worden bereikt met behulp van de gewijzigde basis 4tU, aangezien de gistcellen kunnen duren van 4tU, zonder de behoefte aan expressie van een nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. In feite, het metabolisme van 4tU de activiteit van het enzym uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) vereist. In verschillende organismen, met inbegrip van gist maar niet zoogdieren, is UPRT essentieel voor een pyrimidine berging traject, uracil aan uridine monofosfaat recycling.
Een belangrijke vertekening in transcriptomic studies kan worden ingevoerd door de normalisatie tussen verschillende monsters geanalyseerd in parallel. Inderdaad, de vele afwijkende factoren kunnen invloed hebben op de vergelijkende analyse van de transcriptome van mutant en wild-type stammen: de efficiency van lysis van de cel, verschillen in de extractie en het herstel van RNA, en afwijkingen in de kalibratie van de scanner voor microarray analyse , onder anderen. Zoals hierboven besproken, kunnen dergelijke variaties vooral misleidend zijn als globale effecten op RNA polymerase II transcriptie worden verwacht. Een elegante betekenen voor het nauwkeurig vergelijken van mRNA synthese tarieven tussen de verschillende monsters werd ontworpen met behulp van de verte verwante kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe als een interne standaard. Daarvoor een vast aantal label S. pombe cellen wordt toegevoegd aan de S. cerevisiae monsters, wild-type of gemuteerde cellen, voorafgaand aan cellysis en RNA extractie10. Vervolgens worden zowel stationaire als nieuw samengestelde RNAs van S. pombe en S. cerevisiae gekwantificeerd door RT-qPCR of via het gebruik van spaanders microarray of high-throughput sequencing10. Het combineren van deze gegevens met kinetische modellering, kan absolute van mRNA-synthese en verval in de ontluikende gist worden gemeten.
In het kader van dit manuscript, zullen we laten zien hoe de analyse van nieuwe getranscribeerde RNA toegestaan te onthullen van een mondiale rol voor de coactivator complexen SAGA en TFIID in RNA polymerase II transcriptie in ontluikende14,15gist, 16. Bovenal afgelopen studies gekwantificeerd steady-state mRNA niveaus in S. cerevisiae en gesuggereerd dat SAGA speelt een overheersende functie op een beperkt aantal gist genen die sterk beïnvloed door mutaties in SAGA, maar relatief resistent tegen TFIID mutaties17,18,19. Verrassend, werden de SAGA enzymatische activiteiten getoond om op te treden op het hele getranscribeerde genoom, suggereren een bredere rol voor deze co activator in RNA polymerase II transcriptie. Verminderde RNA polymerase II recruitment meest uitgedrukte genen werd waargenomen op de inactivering van SAGA of TFIID, suggereren dat deze coactivators samen op de meeste genen werken. Vandaar, de kwantificering van nieuw getranscribeerde mRNA geopenbaard dat SAGA en TFIID nodig voor de transcriptie van bijna alle genen door RNA polymerase II14,15,16 zijn. De toepassing van compenserende mechanismen komt naar voren als een manier voor de cellen om te gaan met een algemene afname van de mRNA-synthese die door een gelijktijdige wereldwijde afname van de aantasting van het mRNA is gebufferd. SAGA toegevoegd aan de lijst van factoren die een globaal effect op RNA polymerase II transcriptie, zoals RNA Pol II subeenheden10, de bemiddelaar coactivator complexe20, de algemene transcriptie factor TFIIH21,22 , en indirect, elementen van de mRNA afbraak machines9,10,23. Dergelijke compenserende evenementen werden universeel waargenomen in SAGA mutanten, administratieve verwerking van de bescheiden en beperkte veranderingen in stationaire toestand mRNA niveaus ondanks een globale en ernstige daling in mRNA synthese14. Soortgelijke analyses werden ook uitgevoerd in een BRE1 schrapping stam, wat resulteert in een volledig verlies van Histon H2B ubiquitination. Interessant is dat kon een veel mildere maar consistent globaal effect op RNA polymerase II transcriptie worden opgespoord in de afwezigheid van Bre1, die aangeeft dat metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA in gist kan detecteren en kwantificeren van een breed scala van veranderingen in mRNA synthese tarieven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">4-Thiouracil</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 440736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:119px;">Euromedex</td>
			<td style="width:139px;">Cat# SYN-1185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:216px;">RiboPure RNA Purification kit, yeast</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# AM1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">EZ-Link HPDP Biotin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 21341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Thiolutin</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:139px;">ab143556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">&#181;MACS Streptavidin kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 130-074-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Transcriptor Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">03 531 295 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SYBR Green I Master</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Yeast Genome 2.0</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">900555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity

Global gebreken in RNA polymerase II transcriptie kunnen worden overzien door transcriptomic studies analyseren steady-state RNA. Inderdaad, de globale daling in mRNA-synthese is aangetoond te worden gecompenseerd door een gelijktijdige afname van de aantasting van het mRNA om te herstellen van de normale niveaus van de stationaire toestand. De genoom-brede kwantificering van mRNA-synthese, onafhankelijk van mRNA verval, is dus de beste directe reflectie van RNA polymerase II transcriptionele activiteit. Hier bespreken we een methode met behulp geen storing veroorzaakt metabole labeling van ontluikende RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In het bijzonder de cellen worden gekweekt voor 6 min met een uracil analoge 4-thiouracil en de gelabelde nieuw getranscribeerde RNAs worden gezuiverd en gekwantificeerd om te bepalen van de tarieven van de synthese van alle individuele mRNA. Bovendien, met behulp van label Schizosaccharomyces pombe cellen als interne standaard dit toelaat vergelijken van mRNA-synthese in verschillende S. cerevisiae stammen. Met behulp van dit protocol en de gegevens met een dynamisch kinetische model passend, kunnen de bijbehorende mRNA verval tarieven worden bepaald.

Bij het uitvoeren van metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA, verschillende aspecten moeten worden gecontroleerd: de tijd en de efficiëntie van de etikettering, de spike-in verhouding, het protocol van de extractie en de doeltreffendheid van de biotinylation (inclusief signal-to-noise verhouding), onder anderen. Deze voorwaarden zijn uitgebreid en methodisch aangetoond door anderen7,10,11</s...

Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het RNA polymerase II activiteit weerspiegelt door het meten van nieuw gesynthetiseerde mRNA die niet worden beïnvloed door RNA afbraak. Dit protocol werd oorspronkelijk beschreven met behulp van microarray hybridisatie, maar kan gemakkelijk worden aangenomen om high-throughout sequencing van nieuw getranscribeerd mRNA. Het aantonen van deze procedure zal Tiago Baptista, een voormalige grad student van ons laboratorium.Na het inenten van de S.cerevisiae cellen, groeien ze 's nachts op 30 graden Celsius met constante agitatie bij 150 RPM. De volgende dag, meet de optische dichtheid op 600 nanometer. Verdun de cultuur tot een OD600 van ongeveer 0,1 op 100 milliliter YPD-medium.Grow up de cellen tot de OD600 is ongeveer 0,8. Meet hierna de OD600 van de S.pombe overnight cultuur. Verdun deze cultuur tot een OD600 van ongeveer 0,1 op 500 milliliter YAS-medium en laat het opgroeien tot de OD600 ongeveer 0,8 is.Bereid eerst een nieuwe oplossing voor van twee kiesvierthiosacil. Houd de voorbereide oplossing op kamertemperatuur en beschermd tegen licht. Voeg de vier-thiouracil oplossing toe aan de S.cerevisiae en S.pombe culturen zodanig dat de uiteindelijke concentratie vijf millimolar is.Incubeer de S.cerevisiae en S.pombe culturen op 30 graden Celsius en 32 graden Celsius respectievelijk met constante agitatie gedurende zes minuten. Verwijder hierna een klein aliquot van elke cultuur en tel de cellen met behulp van een automatische celteller of een Neubauer-kamer. Centrifuge op 2, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de cellen te verzamelen.Gooi de supernatant weg en was de cellen een keer ijskoud. Centrifuge opnieuw op 2, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Vervolgens, resuspend de cellen in vijf milliliter ijskoud een keer PBS.Meng de S.cerevisiae en S.pombe cellen met een verhouding van drie tegen een. Centrifugeren de gemengde monsters op 2, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de PBS en flash bevriezen van de cellen in vloeibare stikstof.Bewaar het monster op negatieve 80 graden Celsius tot het gebruiksklaar is. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, ontdooien de cellen op ijs voor ongeveer 20 tot 30 minuten. Gebruik een aangepaste gist RNA extractie kit om het RNA te extraheren zoals beschreven in het tekstprotocol.Breng hierna de filtercartridge over naar de laatste opvangbuis. Elute het RNA met 50 microliters van DEPC-behandeld RNase-vrij water dat werd voorverwarmd tot 100 graden Celsius. Centrifuge op 16.000 keer g voor een minuut.Gebruik vervolgens 50 microliter voorverwarmde DEPC-behandeld rnase-vrij water om het RNA weer aan dezelfde buis te ontwijken. Centrifuge op 16.000 keer g gedurende een minuut om ervoor te zorgen dat het volledige monstervolume door het filter is gegaan. Als dat niet het niet is, centrifuge opnieuw voor een langere periode van tijd.Wanneer u klaar bent, kwantificeert en controleert u de zuiverheid van het monster met behulp van de juiste apparatuur. Gebruik dePC-behandeld nuclease-vrij water om de concentratie van het eerder verworven RNA aan te passen aan twee milligram per milliliter. Aliquot 200 microgram van totale RNA en verwarm het bij 60 graden Celsius gedurende 10 minuten.Onmiddellijk chill het op ijs gedurende twee minuten. Voeg 600 microliter met DEPC-behandeld RNase-vrij water toe. Voeg 100 microliters biotinylation buffer toe en voeg vervolgens 200 microliter biotine HPDP toe.Als de biotine HPDP-oplossing uit de oplossing neerslaat, verhoogt u het volume dmso of DMF tot 40% van het reactievolume zoals beschreven in het tekstprotocol. Bescherm het monster tegen licht en broed het drie uur lang op kamertemperatuur met zachte agitatie. Voeg hierna een ongeveer gelijk volume chloroform aan de buizen toe en meng krachtig.Centrifuge op 13.000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Breng vervolgens de bovenste fase voorzichtig over in nieuwe twee milliliterbuizen. Voeg een hoeveelheid van vijf molaire natriumchloride toe die gelijk is aan ongeveer 1/10 van het monstervolume.Meng vervolgens het monster. Verwarm eerst het biotinylated RNA op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Dan chill de monsters op ijs gedurende vijf minuten.Voeg 100 microliters met streptavidin-gecoate magnetische kralen toe aan het biotinylated RNA. Incubeer bij kamertemperatuur met lichte schudden gedurende 90 minuten. Plaats de kolommen voorzien van de kit in de magnetische standaard.Voeg vervolgens 900 microliters van de wasbuffer op kamertemperatuur toe aan de kolommen. Breng het mengsel van 200 microliterkraal en RNA aan op de kolommen. Verzamel de flow-through in 1,5 milliliter buizen en breng het vervolgens opnieuw aan op dezelfde magnetische kolom.Houd deze flow-through indien nodig als het vertegenwoordigt de niet-gelabelde RNA-fractie. Om te beginnen met RT-qPCR validatie van de verschillende fracties, eerst synthetiseren cDNA zoals beschreven in de tekst. Versterk vervolgens de cDNA door real-time qPCR met behulp van een standaardprotocol.De gemeten niveaus van transcripties in fracties gezuiverd uit wild-type cellen gekweekt met en zonder vier-thiouracil bevestigde deze procedure specifiek zuivert gelabeld RNA. Analyse van de spt20 delta stam blijkt dat de hoeveelheid van de totale steady-state RNA is grotendeels ongewijzigd of is slechts licht verminderd voor de geteste genen. Vergelijkbare resultaten worden gezien voor stammen geschrapt voor bre1.Echter, analyse van nieuw getranscribeerd RNA in de spt20 delta stam blijkt een drie tot vijf keer daling van de mRNA synthese voor alle geteste genen. Ondertussen leidt het verlies van bre1 tot een discretere maar nog steeds zichtbare afname. Bij inducible uitputting van spt7, een structurele subunit van de saga complex, nieuw getranscribeerd mRNA niveaus worden verminderd tot een mate vergelijkbaar met de verwijdering stam.Wanneer de totale RNA-niveaus worden gemeten door genoombrede analyse, worden slechts een paar genen gezien om hun expressieniveaus te laten veranderen bij het verwijderen van spt20, hetzij door omhoog te reguleren of naar beneden te reguleren. Echter, analyse van de nieuw getranscribeerde RNA blijkt dat de niveaus van meer dan 4, 000 genen zijn aanzienlijk verminderd ten minste twee keer na verwijdering van spt20 die een wereldwijd positief effect van saga op RNA polymerase II transcriptie in ontluikende gisten suggereert. Hoewel deze methode inzicht kan geven in transcriptie in Saccharomyces cerevisiae, werd het alleen toegepast met kleine variaties op Door dit protocol te gebruiken, konden we een globale afname van de mRNA-synthese detecteren die werd gecompenseerd door een wereldwijde afname van mRNA-afbraak.

Research

JoVE Journal

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabole Labeling en profilering van overdracht RNAs met behulp van Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...