Name: saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Wir danken Laszlo Tora für seine Unterstützung und V. Fisher, K. Schumacher und F. El Saafin für ihre Gespräche. T.B. wurde unterstützt durch ein Stipendium der Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) und der Fondation Bogen. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der Agence Nationale De La Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) unterstützt. Diese Studie wurde auch von ANR-10-LABX-0030-INRT, französische Staat von der Agence Nationale De La Recherche unter den Rahmen Programm Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 verwalteten Fonds unterstützt.

(1) Zelle Kultivierung und Rapamycin Erschöpfung der SAGA-Untereinheit
<ol><li>Für jede S. Cerevisiae -Stamm und replizieren impfen einschließlich der Wildtyp oder vergleichslinien, eine einzige Kolonie von einem frischen Teller auf 5 mL YPD Medium (2 % Pepton, Hefeextrakt 1 % und 2 % Glukose).</li>
	<li>S. Cerevisiae Zellen über Nacht bei 30 ° C mit ständiger Bewegung (150 u/min) wachsen.</li>
	<li>Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und verdünnen Sie die Kultur, die eine...

<ol>
	<li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Run-On+Sequencing+(GRO-Seq).">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+elongating+transcript+sequencing+(NET-seq).">Native elongating transcript sequencing (NET-seq).</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Kenzelmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals.">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).</li><li>Radle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+genome-wide+RNA+synthesis+and+decay+rates+with+Dynamic+Transcriptome+Analysis+(DTA).">Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA).</a> Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+eukaryotic+mRNA+degradation+reveals+Xrn1-dependent+buffering+of+transcript+levels.">Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels.</a> Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+dynamic+transcriptome+analysis+(cDTA)+reveals+mutual+feedback+between+mRNA+synthesis+and+degradation.">Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation.</a> Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Eser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+metabolism+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+genome.">Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome.</a> Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).</li><li>Baptista, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAGA+Is+a+General+Cofactor+for+RNA+Polymerase+II+Transcription.">SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).</li><li>Bonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SAGA+coactivator+complex+acts+on+the+whole+transcribed+genome+and+is+required+for+RNA+polymerase+II+transcription.">The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription.</a> Genes &amp; Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).</li><li>Warfield, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+Nearly+All+Yeast+RNA+Polymerase+II-Transcribed+Genes+Is+Dependent+on+Transcription+Factor+TFIID.">Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID.</a> Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).</li><li>Huisinga, K. L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+housekeeping+role+for+TFIID+and+a+highly+regulated+stress-related+role+for+SAGA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).</li><li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+roles+for+the+TFIID+and+SAGA+complexes+in+global+transcription.">Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription.</a> Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).</li><li>Lenstra, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+and+topology+of+chromatin+interaction+pathways+in+yeast.">The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast.</a> Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).</li><li>Plaschka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Mediator+core+initiation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex.</a> Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).</li><li>Helenius, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TFIIH+kinase+subunit+Mat1+for+RNA+Pol+II+C-terminal+domain+Ser5+phosphorylation,+transcription+and+mRNA+turnover.">Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover.</a> Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).</li><li>Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Covalent+Inactivation+of+TFIIH-Kinase+Reveals+an+Elongation+Checkpoint+and+Results+in+Widespread+mRNA+Stabilization.">Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization.</a> Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).</li><li>Haimovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+is+circular:+factors+for+mRNA+degradation+also+foster+mRNA+synthesis.">Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis.</a> Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+RNA+kinetics+using+RATE-seq.">Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq.</a> RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).</li><li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spt5+Plays+Vital+Roles+in+the+Control+of+Sense+and+Antisense+Transcription+Elongation.">Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation.</a> Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Paf1C-TFIIS+transcription+elongation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex.</a> Nature Communications. 8, 15741 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).</li><li>Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+NET-seq+analysis+defines+nascent+RNA+profiles+and+associated+RNA+processing+genome-wide.">Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide.</a> Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).</li><li>Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+comprehensive+representation+of+uniqueness+for+next-generation+sequencing+by+minimum+unique+length+analyses.">Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses.</a> PloS One. 8 (1), 53822 (2013).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hundreds+of+novel+UPF1+target+transcripts+by+direct+determination+of+whole+transcriptome+stability.">Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability.</a> RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo.+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Palozola, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+transcription+and+waves+of+gene+reactivation+during+mitotic+exit.">Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit.</a> Science. 358 (6359), 119-122 (2017).</li><li>Ardehali, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+Repressive+Complex+2+Methylates+Elongin+A+to+Regulate+Transcription.">Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).</li><li>Schulz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+surveillance+by+selective+termination+of+noncoding+RNA+synthesis.">Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis.</a> Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Duffy, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Rutkowski, A. J., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing,+and+Decay+by+Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+Using+4-Thiouridine.">High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).</li><li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li><li>Fuchs, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+genome-wide+transcription+elongation+speeds+and+rates+of+RNA+polymerase+II+transition+into+active+elongation+with+4sUDRB-seq.">Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq.</a> Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome.">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li></ol>

Während genomweite Tools, um Veränderungen in der Transkription zu analysieren noch zu verbessern sind, könnte die einzige Analyse des transkriptoms durch die Quantifizierung der Steady-State Ebenen der RNA nicht Änderungen in RNA Polymerase II Aktivität widerspiegeln. MRNA-Niveaus sind in der Tat nicht nur durch die RNA-Synthese, sondern auch durch ihre Reifung und Abbau geregelt. Zur Messung der mRNA-Synthese von mRNA Abbau abgekoppelt wurden unterschiedliche Protokolle in den letzten Jahren für die Analyse der i...

Zellen reagieren auf endogene und exogene Signale durch die dynamische Veränderung ihrer Gen-Ausdruck-Programm. In den letzten Jahren ermöglicht eine enorme Entwicklung der genomweiten Methoden die genaue und umfassende Beschreibung der Transkriptom Änderungen unter verschiedenen Bedingungen. In den meisten transkriptomischen Studien Microarray-Hybridisierung oder Hochdurchsatz-Sequenzierung werden verwendet, um RNA Levels von einem gesamten stationären RNA Bruchteil zu quantifizieren. Transcriptional Änderungen unter einer bestimmten Störung können eine Vielzahl von Möglichkeiten, mit Veränderungen der spezifischen Genexpression oder ein großes Spektrum von Genen wird entweder auf- oder herunterreguliert anzeigen. Gen-Ausdrucks ergibt sich aus einem fein abgestimmten Gleichgewicht – oder stationären — zwischen RNS-Synthese von RNA-Polymerasen und andere Prozesse, die RNA-Ebene. RNA-Polymerase II Transkription, einschließlich seiner drei Phasen (Einleitung, Verlängerung und Kündigung) ist hoch und aufwendig mit mRNA Verarbeitung, zytoplasmatischen Export, Übersetzung und Abbau verbunden.
Mehrere neuere Studien gezeigt, dass mRNAs Synthese und Verfall gekoppelten Mechanismen und zeigte, dass transkriptionelle Effekte auf Mutation oder unter Reize bei der Quantifizierung der gesamten stationären RNA übersehen werden können. Erstens hängt die Erkennung von transcriptional Änderungen durch die Analysen der Steady-State Ebenen der mRNA immer mRNAs Halbwertszeit. Sobald die Störung eingeführt wird, werden die Steady-State Ebenen der mRNAs mit langen Halbwertszeiten viel weniger als die der mRNAs mit kurzen Halbwertszeiten betroffen sein. Daher ist die Nachweisbarkeit der Veränderungen in der RNS-Synthese stark zu Gunsten der kurzlebigen Transkripte, voreingenommen, während die Analyse der langlebigeren mRNA-Spezies Scheitern könnte, um dynamische Veränderungen der Transkription Rate zu offenbaren. Zweitens: mehrere Berichte haben gezeigt, dass sowohl in Hefe und Säugetiere, globale Veränderungen in der Transkription übersehen werden könnten, wenn die Steady-State Ebenen der mRNA zu analysieren. Dies ist wahrscheinlich auf die Mechanismen, die mRNA-Synthese und Degradation mRNA Pufferung zu verknüpfen. Dies veranlasste die Entwicklung neuer Protokolle, mRNA-Synthese, die losgelöst vom Abbau durch die Analyse der neu transkribierte mRNA zu quantifizieren. In den letzten Jahren wurden mehrere Alternativen vorgestellt, darunter globale Nachlauf Sequenzierung (GRO-Seq)1und native Dehnung Transkript Sequenzierung (NET-Seq)2,3. Hier präsentieren wir ein Protokoll zunächst in Säugerzellen4,5,6 entwickelt und dann an Hefe7,8,9,10, 11, basiert auf RNA, die Kennzeichnung mit einem Thiolated Nukleosid oder base Analog, 4-Thiouridine (4sU) oder 4-Thiouracil (4tU), beziehungsweise.
Diese Methode reinigt speziell neu transkribierten RNA aus den Zellen in die RNA mit 4sU mit praktisch keine Einmischung in die Zelle Homöostase Puls gekennzeichnet sind. Daher, sobald die Zellen 4sU ausgesetzt sind, ist das Molekül schnell Uptaken, um 4sU-Triphosphat phosphoryliert, und in RNA transkribiert wird. Sobald Puls-Label, es ist möglich, insgesamt zelluläre RNA (entsprechend Steady-State Ebenen der RNA) extrahieren und anschließend mit der Bezeichnung von 4sU RNA ist Thiol-speziell modifiziert, was zur Bildung einer Disulfid Bindung zwischen Biotin und die neu transkribierten RNA4,5. 4sU kann jedoch nur Uptaken durch die Zellen einen Nukleosid-Transporter, wie der menschliche equilibrative Nukleosid-Transporter (hENT1), verhindert den unmittelbaren Einsatz in Knospung oder Spaltung Hefe zum Ausdruck zu bringen. Während eines hENT1 in S. Pombe oder S. Cerevisiaeausdrücken könnte, kann ein einfacher Ansatz erreicht werden durch die modifizierte base 4tU da 4tU, ohne die Notwendigkeit des Ausdrucks eines Nukleosid-Transporter-10, Hefe-Zellen aufnehmen kann 11 , 12 , 13. In der Tat, der Stoffwechsel von 4tU erfordert die Aktivität des Enzyms Uracil-Phosphoribosyltransferase (UPRT). In einigen Organismen, einschließlich Hefe aber keine Säugetiere ist UPRT für eine Pyrimidine Salvage Pathway recycling Uracil, Uridin Monophosphate.
Eine wichtige Voreingenommenheit in transkriptomischen Studien kann durch die Normalisierung zwischen verschiedenen Proben analysiert parallel eingeführt werden. In der Tat können viele abweichende Faktoren beeinflussen die vergleichende Analyse des transkriptoms Mutanten und Wildtyp Stämme: die Effizienz der Zelle Lysis, Unterschiede in der Gewinnung und Verwertung von RNA und Abweichungen in der Scanner-Kalibrierung für Microarray Analysen , unter anderem. Wie oben besprochen, können solche Schwankungen besonders irreführend sein, wenn globale Auswirkungen auf RNA-Polymerase II Transkription zu erwarten sind. Eine eleganteste Mittel genau mRNA Synthese Preise zwischen verschiedenen Proben vergleichen wurde mithilfe der weitläufig verwandten Spalthefe Schizosaccharomyces Pombe als interner Standard entwickelt. Dafür eine feste Anzahl von S. Pombe beschriftet S. Cerevisiae Proben, Wildtyp oder mutierte Zellen vor der Zelle Lysis und RNA-Extraktion10Zellen hinzugefügt wird. Anschließend werden Steady-State und neugebildete RNAs von S. Pombe und S. Cerevisiae durch RT-qPCR oder über die Verwendung von Microarray-Chips oder Hochdurchsatz-Sequenzierung10quantifiziert. Zusammenführung dieser Daten mit kinetische Modellierung, können absolute Preise der mRNA-Synthese und des Verfalls in der angehenden Hefe gemessen werden.
Im Rahmen dieser Handschrift zeigen wir, wie die Analyse der neu transkribierten RNA erlaubt, um eine globale Rolle zu offenbaren, weil die Coactivator komplexe SAGA und TFIID RNA Polymerase II Transkription in angehende-14,15Hefe, 16. Wichtig ist, frühere Studien Steady-State mRNA-Niveaus in S. Cerevisiae quantifiziert und vorgeschlagen, dass SAGA spielt eine vorherrschende Funktion auf eine begrenzte Anzahl von Hefe Gene die stark betroffenen durch Mutationen im SAGA, aber relativ resistent gegenüber TFIID Mutationen,17,18,19. Überraschenderweise zeigten die SAGA enzymatischen Aktivitäten auf dem gesamten transkribierten Genom, was auf eine größere Rolle für diese Coaktivator in RNA Polymerase II Transkription handeln. Verminderte RNA Polymerase II Rekrutierung an am meisten exprimierten Genen wurde beobachtet, bei der Inaktivierung von SAGA oder TFIID, was darauf hindeutet, dass diese Koaktivatoren auf die meisten Gene zusammenarbeiten. Daher zeigte die Quantifizierung der neu transkribierte mRNA, SAGA und TFIID für die Transkription von fast allen Genen durch RNA-Polymerase II14,15,16erforderlich. Die Umsetzung der Kompensationsmechanismen entpuppt sich als eine Möglichkeit für die Zellen mit einem globalen Rückgang der mRNA-Synthese durch eine gleichzeitige weltweite Abnahme der mRNA Abbau gepuffert ist zu kämpfen. SAGA fügt in die Liste der Faktoren, die eine globale Auswirkung auf RNA Polymerase II Transkription, wie z. B. RNA Pol II Untereinheiten10, der Mediator Coactivator Komplex20, die allgemeine Transkription Faktor TFIIH21,22 , und indirekt, Elemente der mRNA Abbau Maschinen9,10,23. In SAGA Mutanten, Bilanzierung von bescheiden und begrenzte Änderungen im Steady-State mRNA-Niveaus trotz eines globalen und schweren Rückgangs der mRNA-Synthese-14wurden allgemein solche kompensatorische Ereignisse beobachtet. Ähnliche Untersuchungen wurden auch in einem BRE1 Löschung Stamm, was zu einem vollständigen Verlust des Histon H2B Ubiquitination durchgeführt. Interessanterweise konnte wesentlich milder, aber konsequente globale Auswirkungen auf RNA-Polymerase II Transkription nachgewiesen werden, bei fehlender Bre1, darauf hinweist, dass metabolische Kennzeichnung neu transkribierten RNA in Hefe erkennen und eine Vielzahl von Änderungen in mRNA zu quantifizieren Synthese-Preise.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">4-Thiouracil</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 440736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:119px;">Euromedex</td>
			<td style="width:139px;">Cat# SYN-1185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:216px;">RiboPure RNA Purification kit, yeast</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# AM1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">EZ-Link HPDP Biotin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 21341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Thiolutin</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:139px;">ab143556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">&#181;MACS Streptavidin kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 130-074-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Transcriptor Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">03 531 295 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SYBR Green I Master</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Yeast Genome 2.0</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">900555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity

Globale Mängel in der RNA-Polymerase II Transkription könnte durch transkriptomischen Studien analysieren stationären RNA überblickt werden. Der weltweite Rückgang der mRNA-Synthese ist in der Tat nachweislich durch eine gleichzeitige Abnahme der mRNA Abbau zu normalen stationären wiederherstellen kompensiert werden. Daher ist die genomweite Quantifizierung der mRNA-Synthese, unabhängig von mRNA Decay, die beste direkte Reflexion der RNA-Polymerase II transkriptionelle Aktivität. Hier diskutieren wir eine Methode verwenden, nicht störend metabolische Kennzeichnung der im Entstehen begriffenen RNAs in Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae). Insbesondere die Zellen sind für 6 min. mit einem Uracil analog, 4-Thiouracil kultiviert, und die beschrifteten neu transkribierten RNAs sind gereinigt und quantifiziert, um die Synthese von allen einzelnen mRNA zu bestimmen. Darüber hinaus mit Schizosaccharomyces Pombe Zellen beschriftet, als interner Standard ermöglicht Vergleich der mRNA-Synthese in verschiedenen S. Cerevisiae Stämme. Mithilfe dieses Protokolls und Anpassung der Daten mit einem dynamischen kinetischen Modell, können die entsprechende mRNA Decay Tarife ermittelt werden.

Bei der metabolischen Kennzeichnung neu transkribierten RNA mehrere Aspekte kontrolliert werden müssen: die Zeit und Effizienz die Kennzeichnung der Spike-Anteil, die Extraktion-Protokoll und die biotinylierungen Wirksamkeit (einschließlich Signal-Rausch-Verhältnis), unter anderem. Diese Bedingungen wurden ausgiebig und methodisch von anderen7,10,11gezeigt. Hier konzentrieren wir uns hauptsäc...

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Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der genomweiten Quantifizierung der neugebildete mRNA von Hefezellen mit 4-Thiouracil beschriftet gereinigt. Diese Methode ermöglicht die Messung der mRNA-Synthese von mRNA Decay abgekoppelt und schafft somit eine genaue Messung der RNA-Polymerase II Transkription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die AKTIVITÄT der RNA-Polymerase II widerspiegelt, indem sie neu synthetisierte mRNA misst, die nicht durch den RNA-Abbau beeinflusst werden. Dieses Protokoll wurde ursprünglich mit Hilfe der Mikroarray-Hybridisierung beschrieben, kann aber leicht zur hochdurchdachten Sequenzierung von neu transkribierter mRNA übernommen werden. Demonstriert wird dieses Verfahren von Tiago Baptista, einem ehemaligen Grad-Studenten aus unserem Labor.Nach der Impfung der S.cerevisiae Zellen, wachsen sie über Nacht bei 30 Grad Celsius mit konstanter Agitation bei 150 U/min. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte bei 600 Nanometern. Verdünnen Sie die Kultur auf eine OD600 von etwa 0,1 in 100 Milliliter YPD Medium.Wachsen Sie die Zellen, bis die OD600 ist etwa 0,8. Danach messen Sie die OD600 der S.pombe Übernachtungskultur. Verdünnen Sie diese Kultur auf eine OD600 von etwa 0,1 in 500 Milliliter YAS-Medium und lassen Sie es wachsen, bis die OD600 etwa 0,8 ist.Zuerst bereiten Sie eine frische Lösung von zwei molaren Vierthiouracil. Halten Sie die vorbereitete Lösung bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Fügen Sie die Vier-Thiouracil-Lösung zu den S.cerevisiae und S.pombe Kulturen, so dass die endgültige Konzentration beträgt fünf Millimolar.Die S.cerevisiae und S.pombe Kulturen bei 30 Grad Celsius bzw. 32 Grad Celsius mit ständiger Agitation für sechs Minuten inkubieren. Danach entfernen Sie ein kleines Aliquot jeder Kultur und zählen Sie die Zellen entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einer Neubauer-Kammer. Zentrifuge bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen zu sammeln.Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit eiskalt ein mal PBS. Zentrifuge wieder bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Als nächstes, setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter eiskalt ein Mal PBS.Mischen Sie die S.cerevisiae und S.pombe Zellen in einem Verhältnis von drei zu eins. Zentrifugieren Sie die gemischten Proben bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dann entfernen Sie die PBS und blitzen die Zellen in flüssigem Stickstoff einfrieren.Bewahren Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, tauen Sie die Zellen auf Demeis für etwa 20 bis 30 Minuten auf. Verwenden Sie ein angepasstes Hefe-RNA-Extraktionskit, um die RNA zu extrahieren, wie im Textprotokoll beschrieben.Danach die Filterpatrone in das endgnohe Entnahmerohr übertragen. Elute die RNA mit 50 Mikroliter DEPC-behandeltem RNase-freiem Wasser, das auf 100 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute.Verwenden Sie dann 50 Mikroliter vorgewärmtes, mit DEM DEPC behandeltes RNase-freies Wasser, um die RNA wieder in dieselbe Röhre zu bringen. Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenvolumen durch den Filter gegangen ist. Ist dies nicht der Fall, zentrifugieren Sie wieder für einen längeren Zeitraum.Nach Fertigstellung die Reinheit der Probe mit der entsprechenden Ausrüstung zu quantifizieren und zu überprüfen. Verwenden Sie DEPC-behandeltes nukleasefreies Wasser, um die Konzentration der zuvor erworbenen RNA auf zwei Milligramm pro Milliliter einzustellen. Aliquot 200 Mikrogramm gesamter RNA und erhitzen sie bei 60 Grad Celsius für 10 Minuten.Sofort zwei Minuten auf Eis abkühlen lassen. Fügen Sie 600 Mikroliter DEPC-behandeltes RNase-freies Wasser hinzu. Fügen Sie 100 Mikroliter Biotinylierungspuffer hinzu und fügen Sie dann 200 Mikroliter Biotin HPDP hinzu.Wenn die Biotin HPDP-Lösung aus der Lösung herausfällt, erhöhen Sie das Volumen von DMSO oder DMF um bis zu 40 % des Reaktionsvolumens, wie im Textprotokoll beschrieben. Schützen Sie die Probe vor Licht und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung für drei Stunden. Danach ein ungefähr gleiches Chloroformvolumen in die Rohre geben und kräftig mischen.Zentrifuge bei 13.000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Als nächstes übertragen Sie die obere Phase vorsichtig in neue Zwei-Milliliter-Röhren. Fügen Sie eine Menge von fünf molarem Natriumchlorid in Höhe von etwa 1/10 des Probenvolumens hinzu.Mischen Sie dann die Probe. Zuerst erhitzen Sie die biotinylierte RNA bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann kühlen Sie die Proben auf Eis für fünf Minuten.Fügen Sie der biotinylierten RNA 100 Mikroliter Streptavidin-beschichteter Magnetperlen hinzu. Bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln 90 Minuten bebrüten. Legen Sie die mit dem Kit gelieferten Säulen in den magnetischen Ständer.Als Nächstes fügen Sie 900 Mikroliter Raumtemperatur-Waschpuffer zu den Säulen hinzu. Tragen Sie die 200 Mikroliter Perle und RNA-Mischung auf die Spalten auf. Sammeln Sie den Durchfluss in 1,5 Milliliter-Röhren und wenden Sie ihn dann erneut auf dieselbe Magnetsäule an.Halten Sie diesen Durchfluss bei Bedarf, da er die unbeschriftete RNA-Fraktion darstellt. Um mit der RT-qPCR-Validierung der verschiedenen Fraktionen zu beginnen, synthetisieren Sie zunächst cDNA, wie im Text beschrieben. Verstärken Sie dann die cDNA durch Echtzeit-qPCR mit einem Standardprotokoll.Die gemessenen Transkripte in Fraktionen, die von Wildzellen gereinigt wurden, die mit und ohne Vierthiouracil kultiviert wurden, bestätigten dieses Verfahren, das speziell markierte RNA reinigt. Die Analyse des spt20 Deltastamms zeigt, dass die Menge der gesamten stationären RNA weitgehend unverändert ist oder für die getesteten Gene nur leicht reduziert wird. Ähnliche Ergebnisse werden für Stämme gesehen, die für bre1 gelöscht wurden.Die Analyse der neu transkribierten RNA im spt20-Delta-Stamm zeigt jedoch eine drei- bis fünffache Abnahme der mRNA-Synthese für alle getesteten Gene. In der Zwischenzeit führt der Verlust von bre1 zu einem diskreteren, aber immer noch sichtbaren Rückgang. Bei unzerstörbarer Erschöpfung von spt7 wird eine strukturelle Untereinheit des Saga-Komplexes, neu transkribierte mRNA-Spiegel, in einem Ausmaß reduziert, das dem Löschstamm ähnelt.Wenn die gesamten RNA-Spiegel durch genomweite Analyse gemessen werden, werden nur wenige Gene gesehen, dass ihre Expressionsniveaus beim Löschen von spt20 entweder durch Regulierung oder Down-Regulierung verändert werden. Die Analyse der neu transkribierten RNA zeigt jedoch, dass die Konzentrationen von über 4.000 Genen bei der Deletion von spt20 signifikant um das Zweifache reduziert werden, was auf eine globale positive Wirkung der Saga auf die Transkription der RNA-Polymerase II bei angehenden Hefen hindeutet. Obwohl diese Methode Einblicke in die Transkription in Saccharomyces cerevisiae liefern kann, wurde sie nur mit leichten Variationen angewendet, durch die Verwendung dieses Protokolls konnten wir eine globale Abnahme der mRNA-Synthese feststellen, die durch eine globale Abnahme des mRNA-Abbaus kompensiert wurde.

Research

JoVE Journal

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Forschung

Genetik

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...