Name: saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

אנו מודים לזלו תורה התמיכה שלו, נגד פישר, שומאכר ק ו פ Saafin El לדיונים שלהם. שחפת נתמכה על ידי מלגת מארי קירי-ITN (PITN-GA-2013-606806, נ-NET) ואת הקשת Fondation. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מ- סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). מחקר זה נתמך גם על ידי ANR-10-LABX-0030-INRT, קרן צרפתית המדינה ניהלה את סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש תחת d'Avenir Investissements תוכנית מסגרת ANR-10-IDEX-0002-02.

1. תא Culturing ו Rapamycin דלדול של יחידת משנה סאגה
<ol><li>לכל זן cerevisiae ס או שכפול, לרבות פראי-סוג או שליטה זנים, לחסן מושבה בודדת מצלחת טריים על 5 מ של YPD בינונית (2% Peptone, תמצית שמרים 1% ו-2% גלוקוז).</li>
	<li>לגדל תאים cerevisiae ס בן לילה ב 30 ° C עם עצבנות מתמדת (150 סל ד).</li>
	<li>מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD...

<ol>
	<li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Run-On+Sequencing+(GRO-Seq).">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+elongating+transcript+sequencing+(NET-seq).">Native elongating transcript sequencing (NET-seq).</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Kenzelmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals.">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).</li><li>Radle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+genome-wide+RNA+synthesis+and+decay+rates+with+Dynamic+Transcriptome+Analysis+(DTA).">Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA).</a> Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+eukaryotic+mRNA+degradation+reveals+Xrn1-dependent+buffering+of+transcript+levels.">Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels.</a> Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+dynamic+transcriptome+analysis+(cDTA)+reveals+mutual+feedback+between+mRNA+synthesis+and+degradation.">Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation.</a> Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Eser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+metabolism+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+genome.">Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome.</a> Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).</li><li>Baptista, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAGA+Is+a+General+Cofactor+for+RNA+Polymerase+II+Transcription.">SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).</li><li>Bonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SAGA+coactivator+complex+acts+on+the+whole+transcribed+genome+and+is+required+for+RNA+polymerase+II+transcription.">The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription.</a> Genes &amp; Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).</li><li>Warfield, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+Nearly+All+Yeast+RNA+Polymerase+II-Transcribed+Genes+Is+Dependent+on+Transcription+Factor+TFIID.">Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID.</a> Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).</li><li>Huisinga, K. L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+housekeeping+role+for+TFIID+and+a+highly+regulated+stress-related+role+for+SAGA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).</li><li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+roles+for+the+TFIID+and+SAGA+complexes+in+global+transcription.">Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription.</a> Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).</li><li>Lenstra, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+and+topology+of+chromatin+interaction+pathways+in+yeast.">The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast.</a> Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).</li><li>Plaschka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Mediator+core+initiation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex.</a> Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).</li><li>Helenius, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TFIIH+kinase+subunit+Mat1+for+RNA+Pol+II+C-terminal+domain+Ser5+phosphorylation,+transcription+and+mRNA+turnover.">Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover.</a> Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).</li><li>Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Covalent+Inactivation+of+TFIIH-Kinase+Reveals+an+Elongation+Checkpoint+and+Results+in+Widespread+mRNA+Stabilization.">Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization.</a> Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).</li><li>Haimovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+is+circular:+factors+for+mRNA+degradation+also+foster+mRNA+synthesis.">Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis.</a> Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+RNA+kinetics+using+RATE-seq.">Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq.</a> RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).</li><li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spt5+Plays+Vital+Roles+in+the+Control+of+Sense+and+Antisense+Transcription+Elongation.">Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation.</a> Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Paf1C-TFIIS+transcription+elongation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex.</a> Nature Communications. 8, 15741 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).</li><li>Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+NET-seq+analysis+defines+nascent+RNA+profiles+and+associated+RNA+processing+genome-wide.">Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide.</a> Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).</li><li>Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+comprehensive+representation+of+uniqueness+for+next-generation+sequencing+by+minimum+unique+length+analyses.">Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses.</a> PloS One. 8 (1), 53822 (2013).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hundreds+of+novel+UPF1+target+transcripts+by+direct+determination+of+whole+transcriptome+stability.">Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability.</a> RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo.+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Palozola, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+transcription+and+waves+of+gene+reactivation+during+mitotic+exit.">Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit.</a> Science. 358 (6359), 119-122 (2017).</li><li>Ardehali, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+Repressive+Complex+2+Methylates+Elongin+A+to+Regulate+Transcription.">Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).</li><li>Schulz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+surveillance+by+selective+termination+of+noncoding+RNA+synthesis.">Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis.</a> Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Duffy, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Rutkowski, A. J., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing,+and+Decay+by+Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+Using+4-Thiouridine.">High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).</li><li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li><li>Fuchs, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+genome-wide+transcription+elongation+speeds+and+rates+of+RNA+polymerase+II+transition+into+active+elongation+with+4sUDRB-seq.">Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq.</a> Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome.">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li></ol>

בעוד הגנום כולו כלים לנתח את השינויים בתעתיק עדיין מוכיחה, ניתוח הבלעדית של transcriptome באמצעות כימות של רמות מצב יציב של RNA אולי אינן משקפות במדויק את שינויים בפעילות השנייה של RNA פולימראז. אכן, רמות ה-mRNA מוסדרים לא רק על ידי סינתזה RNA, אלא גם על ידי שלהם התבגרות והשפלה. כדי למדוד את סינתזת mRNA חשי?...

התאים מגיבים רמזים אנדוגני, אקסוגני, דרך שינוי דינמי של התוכנית ביטוי גנים. בשנים האחרונות, התפתחות עצומה של הגנום כולו מתודולוגיות מאפשר תיאור מקיף ומדויק של transcriptome שינויים בתנאים שונים. במחקרים transcriptomic רוב, רצף הכלאה או תפוקה גבוהה microarray משמשים כדי לכמת את רמות ה-RNA מ שבריר הכולל של RNA מצב יציב. שינויים תעתיק תחת ההפרעות ספציפי באפשרותך להציג מגוון רחב של תוצאות אפשריות, עם שינויים בביטוי גנים ספציפיים או מגוון גדול של גנים להיות למעלה - או downregulated. ביטוי גנים הוא התוצאה של שיווי משקל מכויל — או מצב יציב – בין סינתזת RNA על ידי RNA polymerases ותהליכים אחרים המשפיעים על רמות ה-RNA. שעתוק rna פולימראז II, כולל שלושה שלבי ברורים שלה (חניכה, התארכות, סיום), קשורה מאוד, מסובכת mRNA עיבוד ייצוא cytoplasmic, תרגום, השפלה.
מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי mRNAs סינתזה ודעיכה הם מנגנונים בשילוב והראו כי ניתן להתעלם תעתיק אפקטים על מוטציה או תחת גירויים בעת לכימות הכולל RNA מצב יציב. ראשית, הגילוי של שינויים גנים ברמת השעתוק דרך הבדיקות של רמות מצב יציב של mRNA תמיד תלוי mRNAs half-life. פעם אחת הוא הציג את ההפרעות, רמות מצב יציב mRNAs עם זמן מחצית החיים יושפעו הרבה פחות מאלה של mRNAs עם מחצית החיים הקצר. לכן, detectability של השינויים סינתזה RNA חריפה מוטה לטובת תעתיקים קצרת ימים, בזמן הניתוח של מינים mRNA longer-lived עשוי להיכשל לחשוף שינוי דינמי בקצב שעתוק. שנית, מספר דיווחים הראו כי, גם שמרים וגם יונקים, שינויים כלליים בתעתיק עשוי להיות להתעלם בעת ניתוח רמות מצב יציב של mRNA. . זה ככל הנראה בגלל המנגנון לקשר סינתזת mRNA והשפלה וכתוצאה מכך mRNA אגירה. זה הוביל לפיתוח של פרוטוקולים חדשים לכמת סינתזת mRNA חשיפות מן השפלה, דרך הניתוח של mRNA החדש משועתקים. בשנים האחרונות, מספר חלופות הוצגו, כולל ריצה הכללית רצף (GRO-seq)1ותעתיק מקורי התארכות רצף (NET-seq)2,3. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול שפותחה לראשונה ב תאים בתרבית של4,5,6 ומותאמים ואז השמרים7,8,9,10, 11, אשר מבוסס על ה-RNA תיוג עם thiolated nucleoside או אנלוגי בסיס, 4-thiouridine (4sU) או 4-thiouracil (4tU), בהתאמה.
שיטה זו במיוחד מטהרת RNA משועתקים לאחרונה את התאים ב- RNA אשר נמצאים המסומנת הדופק 4sU עם כמעט ללא התערבות הומאוסטזיס תא. לכן, ברגע התאים נחשפים 4sU, המולקולה היא במהירות uptaken, phosphorylated אל 4sU-טריפוספט, שולבו RNAs עיבד. ברגע דופק עם התווית, זה אפשרי לחלץ סך RNA הסלולר (תואם לרמות מצב יציב של RNA), והיא, לאחר מכן, השבר RNA התווית על-ידי 4sU תיול-במיוחד משתנה, שמוביל להיווצרות קשר דיסולפידי בין ביוטין ו 4,לאחרונה משועתקים רנ א5. עם זאת, 4sU יכולה להיות רק uptaken על ידי התאים לבטא נהג nucleoside, כמו המשגר האנושי nucleoside equilibrative (hENT1), מניעת השימוש המיידי בו ניצני ביקוע או שמרים. בעוד אחד יכול להביע את hENT1 ס הביקוע או cerevisiae ס, גישה קלה יכולה להיות מושגת באמצעות 4tU את הבסיס שונה, שכן תאי שמרים עשויה להימשך עד 4tU, ללא הצורך של ביטוי של טרנספורטר nucleoside10, 11 , 12 , 13. למעשה, חילוף החומרים של 4tU דורש פעילות אנזים אורציל phosphoribosyltransferase (UPRT). מספר אורגניזמים, כולל שמרים אבל לא יונקים, UPRT הוא חיוני עבור מסלול הניצולת פירימידין, מיחזור אורציל כדי uridine monophosphate.
הטיה חשוב במחקרים transcriptomic יכול להיות הציג נירמול בין מדגמים שונים ניתח במקביל. אכן, גורמים deviating רבים יכולים להשפיע על ניתוח השוואתי של transcriptome של מוטציה וללחצים פראי-סוג: היעילות של פירוק התא, הבדלים החילוץ, שחזור של RNA וסטיות בתוך הסורק כיול עבור ניתוחים microarray , בין היתר. כפי שצוין לעיל, וריאציות כזה יכול להיות מטעה במיוחד כאשר צפויים אפקטים הכללית ב- RNA פולימראז II שעתוק. אומר אלגנטי להשוות במדויק mRNA מחירים סינתזה בין מדגמים שונים תוכנן על-ידי שימוש שמרים ביקוע קרובים רחוקים שמר הביקוע תקן פנימי. בשביל זה, מספר קבוע שכותרתו ס הביקוע תאים מתווסף הדגימות cerevisiae ס , או פראי-סוג או מוטציה בתאים, לפני פירוק התא ל- RNA החילוץ10. לאחר מכן, גם מצב יציב וגם לאחרונה מסונתז RNAs ס הביקוע , cerevisiae ס הם לכמת RT-qPCR או באמצעות שימוש microarray צ'יפס או רצף תפוקה גבוהה10. שילוב נתונים אלה עם מידול קינטי, שיעורי מוחלטת של סינתזת mRNA ודעיכה של ניצני שמרים ניתן למדוד.
במסגרת של כתב יד זה, נראה כיצד הניתוח של RNA לאחרונה משועתקים מותר לחשוף תפקיד גלובאלי עבור מתחמי coactivator SAGA, TFIID בתעתיק RNA פולימראז II בניצני שמרים14,15, 16. חשוב לציין, מחקרים שנעשו בעבר לכמת את רמות ה-mRNA מצב יציב cerevisiae ס והציע זה הסאגה ממלא פונקציה השולט על קבוצה מוגבלת של גנים שמרים אשר חריפה המושפעים על ידי מוטציות בסאגה, אבל יחסית עמידים בפני TFIID מוטציות17,18,19. באופן מפתיע, פעילויות אנזימטיות הסאגה הוצגו לפעול על הגנום כולו משועתקים, רומז תפקיד רחב יותר עבור activator זה שותף ב- RNA פולימראז II שעתוק. ירידה RNA פולימראז II גיוס-גנים ביטוי ביותר נצפתה על איון של הסאגה או TFIID, רומז כי אלה coactivators לעבוד ביחד-רוב הגנים. לפיכך, כימות של mRNA משועתקים לאחרונה חשף כי הסאגה, TFIID נדרשים עבור שעתוק של גנים כמעט כל RNA פולימראז II14,15,16. מימוש מנגנוני פיצוי מתגלה דרך עבור התאים להתמודד עם ירידה גלובלית סינתזת mRNA אשר נאגרת על ידי ירידה גלובלית סימולטני mRNA השפלה. הסאגה מוסיף לרשימה של גורמים שיש השפעה גלובלית על ה-RNA פולימראז II שעתוק, כגון ה-RNA Pol II subunits10, מתחם coactivator20את המתווך, הגנרל שעתוק מקדם TFIIH21,22 , בעקיפין, יסודות ה-mRNA השפלה מכונות9,10,23. הסאגה מוטציות, והיוו השינויים צנוע ומוגבל ברמות ה-mRNA מצב יציב למרות ירידה גלובלית וחמור סינתזת mRNA14אוניברסלית זו נצפתה אירועים כאלה הבולמוס. ניתוחים דומות בוצעו גם בזן מחיקה BRE1 , וכתוצאה מכך אובדן מוחלט של היסטון ויזת עבודה H2B ubiquitination. מעניין, הרבה מתון יותר אך עקבי הכללית השפעה על ה-RNA פולימראז II תמלול יכול להתגלות, בהעדר Bre1, המציין כי תיוג מטבולית של RNA משועתקים לאחרונה ב שמרים ניתן לזהות ולכמת מגוון רחב של שינויים ב- mRNA המחירים סינתזה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">4-Thiouracil</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 440736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:119px;">Euromedex</td>
			<td style="width:139px;">Cat# SYN-1185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:216px;">RiboPure RNA Purification kit, yeast</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# AM1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">EZ-Link HPDP Biotin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 21341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Thiolutin</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:139px;">ab143556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">&#181;MACS Streptavidin kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 130-074-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Transcriptor Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">03 531 295 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SYBR Green I Master</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Yeast Genome 2.0</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">900555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity

אולי אפשר להתעלם ליקויים גלובלית-RNA פולימראז II שעתוק על ידי מחקרים transcriptomic ניתוח מצב יציב RNA. אכן, הפחתת הגלובלית סינתזת mRNA הוכח פיצוי כספי על ידי ירידה בו זמנית ב- mRNA השפלה כדי לשחזר את רמות נורמליות של מצב יציב. ומכאן, כימות ברמת הגנום של סינתזת mRNA, באופן עצמאי מהשחתה mRNA, הוא הטוב ביותר השתקפות ישירה של RNA פולימראז II פעילות גנים ברמת השעתוק. כאן, אנו נדון שיטה באמצעות שאינם perturbing מטבולית תיוג של RNAs nascent ב האפייה (cerevisiae ס). באופן ספציפי, התאים מתורבתים במשך 6 דקות עם אורציל אנלוגי, 4-thiouracil, ואת RNAs לאחרונה משועתקים שכותרתו הם מטוהרים לכמת כדי לקבוע את קצבי סינתזת mRNA בודדות כל. יתר על כן, באמצעות תווית שמר הביקוע תאים כמו תקן פנימי מאפשר השוואת סינתזה mRNA שונה cerevisiae ס זנים. באמצעות פרוטוקול זה, הולם את הנתונים באמצעות מודל קינטי דינמי, יכול להיקבע mRNA הניוון המתאימים.

בעת ביצוע תיוג מטבולית של RNA לאחרונה משועתקים, מספר היבטים צריך להיות תחת פיקוח: הזמן ואת היעילות של תיוג שיעור בספייק, פרוטוקול החילוץ, היעילות biotinylation (כולל יחס אות לרעש), בין היתר. תנאים אלה בהרחבה ובאופן שיטתי הוכחו על ידי אחרים7,10,<su...

Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משקפת את פעילות RNA פולימראז II על ידי מדידת mRNA מסונתז חדש אשר אינם מושפעים השפלה RNA. פרוטוקול זה תואר במקור באמצעות הכלאה microarray, אבל יכול בקלות להיות מאומץ רצף גבוה לאורך כל mRNA שזה עתה תעתיק. הדגמת הליך זה תהיה טיאגו בטיסטה, סטודנט לשעבר מהמעבדה שלנו.לאחר חיסון תאי S.cerevisiae, לגדל אותם לילה ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת ב 150 סל"ד. למחרת, למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר. לדלל את התרבות OD600 של כ 0.1 ב 100 מיליליטר של מדיום YPD.לגדול את התאים עד OD600 הוא סביב 0.8. לאחר מכן, למדוד את OD600 של תרבות הלילה S.pombe. לדלל את התרבות הזאת OD600 של כ 0.1 ב 500 מיליליטר של אמצעי YAS ולתת לו לגדול עד OD600 הוא כ 0.8.ראשית, להכין פתרון טרי של שני טוחנות ארבע thiouracil. יש לשמור על הפתרון המוכן בטמפרטורת החדר והגנה מפני אור. הוסף את הפתרון ארבע thiouracil לתרבויות S.cerevisiae ו S.pombe כך הריכוז הסופי הוא חמישה מילימולר.הדגירה תרבויות S.cerevisiae ו S.pombe ב 30 מעלות צלזיוס ו 32 מעלות צלזיוס בהתאמה עם תסיסה מתמדת במשך שש דקות. לאחר מכן, הסר aliquot קטן של כל תרבות ולספור את התאים באמצעות מונה תא אוטומטי או תא Neubauer. צנטריפוגה ב 2, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לאסוף את התאים.השליכו את העל-טבעי ושטפו את התאים בקרח פעם אחת ב-PBS. צנטריפוגה שוב ב 2, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בתאים בחמישה מיליליטר של קרח קר פעם אחת PBS.מערבבים את תאי S.cerevisiae ו- S.pombe ביחס של שלושה לאחד. צנטריפוגה הדגימות המעורבות ב 2, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את PBS ופלאש להקפיא את התאים בחנקן נוזלי.לאחסן את המדגם ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן לשימוש. כאשר מוכן להמשיך, להפשיר את התאים על קרח במשך כ 20 עד 30 דקות. השתמש בערכת מיצוי RNA שמרים מותאמת כדי לחלץ את ה- RNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, העבר את מחסנית המסנן לצינור האיסוף הסופי. אלוט RNA עם 50 microliters של מים נטולי RNase שטופלו DEPC שחומם מראש ל 100 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g לדקה אחת.לאחר מכן השתמש 50 microliters של מים מחומם מראש DEPC-מטופלים RNase כדי לחמק RNA שוב לאותו צינור. צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g לדקה אחת לוודא כי נפח המדגם כולו עבר דרך המסנן. אם לא, צנטריפוגה שוב לתקופה ארוכה יותר של זמן.בסיום, לכמת ולבדוק את טוהר המדגם באמצעות הציוד המתאים. השתמש במים נטולי גרעין שטופלו ב- DEPC כדי להתאים את הריכוז של ה- RNA שנרכש בעבר לשני מיליגרם למיליליטר. Aliquot 200 מיקרוגרם של RNA הכולל לחמם אותו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.מיד מצננים אותו על קרח במשך שתי דקות. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase שטופלו ב-DEPC. הוסף 100 microliters של מאגר biotinylation ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של ביוטין HPDP.אם פתרון הביוטין HPDP יוצא מהפתרון, הגדל את נפח ה- DMSO או ה- DMF עד 40% מנפח התגובה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגן על המדגם מפני אור והדגירה אותו בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה במשך שלוש שעות. לאחר מכן, מוסיפים נפח שווה בערך של כלורופורם לצינורות ומערבבים במרץ.צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, העבר בזהירות את השלב העליון לשני צינורות מיליליטר חדשים. הוסף כמות של חמישה נתרן כלורי טוחן שווה כ 1/10 של נפח המדגם.ואז לערבב את הדגימה. ראשית, מחממים את ה-RNA הביוטינילציה ב-65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ואז לצנן את הדגימות על קרח במשך חמש דקות.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטבידין ל-RNA הביוטיניילציה. דגירה בטמפרטורת החדר עם רעידות קלות במשך 90 דקות. מניחים את העמודים המסופקים עם הערכה בכן המגנטי.לאחר מכן, הוסיפו לעמודים 900 מיקרוליטר של מאגר כביסה בטמפרטורת החדר. החל את 200 חרוז מיקרוליטר ותערובת RNA על העמודים. לאסוף את הזרימה דרך צינורות 1.5 מיליליטר ולאחר מכן להחיל אותו שוב על אותו עמודה מגנטית.שמור על זרימה זו אם יש צורך בכך שהיא מייצגת את שבר ה- RNA ללא תריס. כדי להתחיל באימות RT-qPCR של השברים השונים, סנתז תחילה את cDNA כמפורט בטקסט. לאחר מכן הגבר את ה- cDNA על-ידי qPCR בזמן אמת באמצעות פרוטוקול סטנדרטי.הרמות הנמדדות של תעתיקים בשברים מטוהרים מתאים מסוג בר מתורבתים עם ובלי ארבעה thiouracil אישר הליך זה במיוחד מטהר RNA שכותרתו. ניתוח של זן הדלתא spt20 מגלה כי כמות RNA מצב יציב הכולל הוא במידה רבה ללא שינוי או מצטמצם רק במתינות עבור הגנים שנבדקו. תוצאות דומות נראים עבור זנים שנמחקו עבור bre1.עם זאת, ניתוח של RNA שזה עתה תועתק בזן הדלתא spt20 מגלה ירידה של פי שלושה עד חמישה בסינתזת mRNA לכל הגנים שנבדקו. בינתיים, אובדן bre1 מוביל לירידה דיסקרטית יותר אך עדיין נראית לעין. עם דלדול בלתי ניתן לתיקון של spt7, תת-אחדות מבנית של מתחם הסאגה, רמות mRNA שזה עתה תעתקו מצטמצמות במידה דומה לזן המחיקה.כאשר רמות ה- RNA הכולל נמדדות על ידי ניתוח גנום רחב, רק גנים מעטים נראים יש רמות הביטוי שלהם השתנה עם מחיקת spt20 או על ידי ויסות או למטה ויסות. עם זאת, ניתוח של RNA שזה עתה מועתק מגלה כי רמות של מעל 4, 000 גנים מופחתים באופן משמעותי לפחות פי שניים עם מחיקת spt20 אשר מרמז על השפעה חיובית גלובלית של סאגה על RNA פולימראז II שעתוק שמרים ניצנים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה שעתוק Saccharomyces cerevisiae, זה יושם רק עם וריאציות קלות על ידי שימוש בפרוטוקול זה, אנו יכולים לזהות ירידה גלובלית סינתזה mRNA אשר היה פיצוי על ידי ירידה גלובלית השפלה mRNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...