Name: saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

우리 그의 지원에 대 한 라 즐로 토 라와 V. 피셔, K. 슈마허와 F. 엘 Saafin 그들의 토론에 대 한 감사합니다. 결핵은 마리 퀴리-ITN 화목 (PITN-가-2013-606806, NR 그물)에 의해 지원 되었다 Fondation 아크. 이 작품은 직원 회 드 라 검색 (ANR-15-CE11-0022 SAGA2)에서 기금에 의해 지원 되었다. 이 연구는 ANR-10-LABX-0030-INRT, 관리 프레임 프로그램 Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 아래 직원 회 드 라 검색 하는 프랑스 국가 기금에 의해 또한 지원 되었다.

1. 세포 배양 Rapamycin의 그리고 소모 사가 소 단위
<ol><li>각 S. cerevisiae 스트레인 및 복제에 대 한 야생-타입을 포함 하 여 또는 컨트롤 긴장 접종 YPD 매체 (2% 펩, 1% 효 모 추출 물, 및 2% 포도 당)의 5 mL에 신선한 접시에서 단일 식민지.</li>
	<li>일정 한 동요 (150 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 S. cerevisiae 세포 성장.</li>
	<li>600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) OD600 YPD 매체의 약 0.1에서 1...

<ol>
	<li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Run-On+Sequencing+(GRO-Seq).">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. 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전사에 대 한 변경 내용을 분석 하는 게놈 넓은 도구는 여전히, 개선 하는 동안 정상 수준의 RNA의 정량화를 통해 transcriptome의 유일한 분석 수 있습니다 정확 하 게 반영 하지 변경 RNA 중 합 효소 II 활동에. 실제로, mRNA 수준 RNA 합성에 의해 뿐만 아니라 그들의 성숙과 저하에 의해 통제 된다. 측정 하려면 mRNA 합성 mRNA 저하에서 연결, 고유 프로토콜 효 모와 포유류에 초기 전사의 분석에 대 한 최근 몇...

세포는 유전자 식 프로그램의 동적 변경 통해 내 인 성 및 외 인 신호에 응답. 최근 몇 년 동안, 게놈 넓은 방법론의 엄청난 개발 다른 조건 transcriptome 변화의 정확 하 고 포괄적인 설명 수 있습니다. 대부분 transcriptomic 연구, microarray 교 잡 또는 높은 처리량 시퀀싱 총 정상 RNA 분수에서 RNA 수준을 측정 하는 데 사용 됩니다. 특정 섭 동 아래 transcriptional 변경 가능한 결과, 특정 유전자 표현 변경 또는 업 또는 downregulated 되 고 유전자의 큰 스펙트럼의 넓은 범위를 표시할 수 있습니다. 유전자 발현은 미세 조정된 균형의 결과 이다-또는 정상-RNA polymerases에 의해 RNA 합성 및 RNA 수준에 영향을 미치는 다른 프로세스 사이. Rna 중 합 효소 II 전사, mRNA 처리와 세포질 수출, 번역, 저하 고 복잡 하 게 연결 됩니다 (개시, 신장, 그리고 종료), 그것의 세 가지 단계를 포함 하 여.
여러 최근 연구 mRNAs 합성 및 부패는 결합된 메커니즘을 설명 하 고 총 정상 RNA를 측정 하는 때 돌연변이 또는 자극 아래 transcriptional 효과 간과 될 수 보였다. 첫째, 항상 정상 수준의 mRNA의 분석을 통해 transcriptional 변화의 감지는 mRNAs 반감기에 따라 달라 집니다. 섭 동을 도입 되 면 긴 반감기를 가진 mRNAs의 정상 수준 것입니다 훨씬 덜 영향을 보다 짧은 반감기를 가진 mRNAs의. 따라서, 단기 성적에 찬성 하 여 RNA 합성에 변경의 검출 바이어스 강하게 동안 최소로 mRNA 종 분석 전사 율에서 동적인 변화를 공개를 실패할 수 있습니다. 둘째, 여러 개의 보고서, 모두 효 모와 포유류에서 전사에 글로벌 변화 수 있습니다 간과 mRNA의 정상 수준을 분석할 때 나타났습니다. 이것은 mRNA 합성 및 mRNA 버퍼링 결과 저하를 연결 하는 메커니즘으로 인해입니다. 이 mRNA 합성 저하, 새로 베 껴 진된 mRNA의 분석을 통해에서 상태로 계량 하 새로운 프로토콜의 개발을 자극. 최근 몇 년 동안, 여러 가지 대안 되었습니다 제시, 글로벌 실행 시퀀싱 (GRO-seq)1및 네이티브 신장 시퀀싱 (NET-seq)2,3를 포함 하 여. 여기, 우리는 포유류 세포4,,56 에서 처음 개발 하 고 다음 효 모7,,89,10에 적용 하는 프로토콜을 제시 11, thiolated nucleoside 또는 기본 아날로그로 RNA 기반 4-thiouridine (4sU) 또는 4-thiouracil (4tU), 각각.
이 메서드는 특별히 새로 베 껴 진된 RNA는 RNA의 세포에서 정화 펄스 장애 요소가 없으면 세포 항상성에서 4sU로 표시 됩니다. 따라서, 일단 셀 4sU에 노출은, 분자는 빠르게 uptaken, 4sU 3 인산 염에 phosphorylated 및 RNAs 변하게 되 고에 통합. 일단 수정 펄스-분류, 추출 총 세포질 RNA (RNA의 정상 수준에 해당), 수 이며, 그 후, 4sU 라는 RNA 분수 thiol 특히 biotin 사이 이황화 결합의 형성으로 이어지는 고 새로 베 껴 진된 RNA4,5. 그러나, 4sU는 인간의 equilibrative nucleoside 운송업 자 (hENT1), 신진 또는 분열 효 모에의 즉시 사용을 방지 같은 nucleoside 전송기를 표현 하는 세포에 의해 uptaken를 하실 수 있습니다. 하나는 S. pombe 또는 S. cerevisiae에서 hENT1을 표현할 수 있는, 하는 동안 쉽게 접근 달성 될 수 있다 효 모 세포 nucleoside 전송10, 의 식의 필요 없이 4tU 최대 걸릴 수 있습니다 이후 수정 된 기본 4tU를 사용 하 여 11 , 12 , 13. 4tU의 대사 효소 uracil phosphoribosyltransferase (UPRT)의 활동을 필요로 하는 사실. 효 모만 아니라 포유류를 포함 한 여러 유기 체에서 UPRT uridine monophosphate uracil 재활용 pyrimidine 회수 경로 대 한 필수적입니다.
동시에 분석 하는 다른 견본 사이의 정규화 transcriptomic 연구에 중요 한 바이어스를 도입 수 있습니다. 실제로, 많은 일탈 요인 돌연변이 및 야생-타입 긴장의 transcriptome의 비교 분석을 영향을 미칠 수: 세포 세포의 용 해 효율 추출 및 RNA, 및 분산 microarray 분석에 대 한 스캐너 교정에서의 복구에 차이 다른 사람의 사이에서. 위에서 설명 했 듯이, RNA 중 합 효소 II 전사에 글로벌 효과 예상 되는 등 유사 특히 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 정확 하 게 다른 견본 사이의 mRNA 합성 레이트를 비교 하는 우아한 의미 내부 표준으로 먼 관련된 분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 를 사용 하 여 설계 되었다. 고정 된 수의 표시 S. pombe 셀 S. cerevisiae 샘플, 야생-타입 또는 돌연변이 세포, 세포 세포의 용 해 및 RNA 추출10이전에 추가 됩니다. 그 후, S. pombe 와 S. cerevisiae 에서 정상 상태와 새로 합성 RNAs 실시간 정량 또는 통해 microarray 칩 또는 높 처리량 연속10의 사용에 의해 정량은. 이러한 데이터를 결합 하 여 운동 모델링, mRNA 합성 및 싹 트는 효 모에는 감퇴의 절대 속도 측정할 수 있습니다.
이 원고 틀에서 새로 베 껴 진된 RNA 분석 신진에 RNA 중 합 효소 II 전사에서 coactivator 단지 사가 TFIID14,15, 효 모에 대 한 글로벌 역할을 허용 하는 방법을 살펴보겠습니다. 16. 중요 한 것은, 과거의 연구 S. cerevisiae 에서 정상 mRNA 레벨을 계량 및 제안 사가 사가 돌연변이 의해 강하게 영향을 하지만 상대적으로 TFIID를 저항 하는 효 모 유전자의 제한 된 집합에 주된 기능을 담당 변이17,,1819. 놀랍게도, 사가 효소 활동 전체 베낀된 게놈 RNA 중 합 효소 II 전사에이 공동 활성이 제에 대 한 광범위 한 역할을 제안에 따라 행동을 표시 했다. 가장 표현된 유전자에서 감소 RNA 중 합 효소 II 모집 사가 또는 이러한 coactivators 대부분 유전자에서 함께 일 하는 것을 건의 하는 TFIID의 비활성화에 관찰 되었다. 따라서, 새로 베 껴 진된 mRNA의 정량화 사가 TFIID RNA 중 합 효소 II14,,1516에 의해 거의 모든 유전자의 전사에 대 한 요구는 밝혔다. 보상 메커니즘의 구현 mRNA 저하에서 동시 글로벌 감소에 의해 버퍼링 되는 mRNA 합성의 글로벌 감소에 대처 하기 위해 셀에 대 한 방법으로 나온다. 사가 녹음 방송 요인 TFIIH21,22에 RNA 중 합 효소 II 전사, RNA Pol II subunits10등 글로벌 효과, 중재자 coactivator 복잡 한20, 일반 요인의 목록에 추가 , 그리고 간접적으로, mRNA 저하 기계9,,1023의 요소. 이러한 보상 이벤트 사가 돌연변이, 정상 mRNA 수준의 mRNA 합성14글로벌 하 고 심각한 감소에도 불구 하 고 겸손 하 고 제한 된 변화에 대 한 회계에서 보편적으로 관찰 되었다. 비슷한 분석 또한 히스톤 H2B ubiquitination의 완전 한 손실을 BRE1 삭제 스트레인에서 수행 했다. 흥미롭게도, 많은 온화한 그러나 일관 된 글로벌에 대 한 효력이 RNA 중 합 효소 II 전사는 감지 하 고 다양 한 mRNA에 변화를 계량 수 있습니다. 효에서 새로 베 껴 진된 RNA의 대사 라벨을 나타내는 Bre1의 부재에서 검출 될 수 있습니다. 합성 비율입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">4-Thiouracil</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 440736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:119px;">Euromedex</td>
			<td style="width:139px;">Cat# SYN-1185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:216px;">RiboPure RNA Purification kit, yeast</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# AM1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">EZ-Link HPDP Biotin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 21341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Thiolutin</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:139px;">ab143556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">&#181;MACS Streptavidin kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 130-074-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Transcriptor Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">03 531 295 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SYBR Green I Master</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Yeast Genome 2.0</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">900555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity

RNA 중 합 효소 II 전사 글로벌 결함 transcriptomic 연구 분석 정상 RNA에 의해 간과 수 있습니다. 실제로, mRNA 합성의 글로벌 감소 정상 정상 수준 복원 mRNA 저하에서 동시 감소에 의해 보상을 보여줘 왔다. 따라서, mRNA 감퇴에서 독립적으로 mRNA 합성의 게놈 넓은 정량화 RNA 중 합 효소 II transcriptional 활동의 가장 직접적인 반영 이다. 여기, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)에서 초기 RNAs의 대사 라벨 비 perturbing를 사용 하는 방법을 다루겠습니다. 특히, 셀 thiouracil-uracil 아날로그, 4와 6 분에 대 한 교양 및 레이블이 새로 베낀된 RNAs는 정화 모든 개별 mRNA의 합성 레이트를 결정 하기 위해 계량. 또한, 사용 하 여 표시 된 Schizosaccharomyces pombe 셀 내부 표준 허용 다른 S. cerevisiae 에 mRNA 합성 비교 긴장. 이 프로토콜을 사용 하는 동적 운동 모델 데이터를 피팅, 대응 mRNA 감퇴 속도 확인할 수 있습니다.

여러 측면을 통제 될 필요가 새로 베 껴 진된 RNA의 대사 라벨을 수행할 때: 시간과 효율 라벨, 스파이크에 비례하여, 추출 프로토콜 및 biotinylation 효능 (포함 한 신호 대 잡음 비율) 중에서 다른 사람. 이러한 조건이 광범위 하 고 조직적으로 표시 되었습니다 다른 사람에 의해7,,1011. 여기 우리는 주로 해?...

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Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

이 기술의 주요 장점은 RNA 분해에 의해 영향을 받지 않는 새로 합성된 mRNA를 측정하여 RNA 폴리머라제 II 활성을 반영한다는 것이다. 이 프로토콜은 원래 마이크로어레이 혼성화를 사용하여 설명되었지만 새로 전사된 mRNA의 고온 시퀀싱에 쉽게 채택될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 티아고 침례교, 우리의 실험실에서 전 졸업생이 될 것입니다.S.cerevisiae 세포를 접종 한 후, 150 RPM에서 지속적인 동요와 섭씨 30도에서 하룻밤 을 성장. 다음 날, 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. YPD 배지의 100 밀리리터에서 약 0.1의 OD600으로 배양을 희석시.OD600이 약 0.8이 될 때까지 세포를 성장시다. 그 후, S.pombe 하룻밤 문화의 OD600을 측정합니다. 이 배양을 YAS 배지의 500밀리리터에서 약 0.1의 OD600으로 희석하고 OD600이 약 0.8이 될 때까지 자랄 수 있도록 한다.먼저, 두 개의 어금니 4-티오라실의 신선한 솔루션을 준비한다. 준비된 솔루션을 실온에서 유지하고 빛으로부터 보호하십시오. 최종 농도가 5 밀리머인 S.cerevisiae 및 S.pombe 문화에 4-티오라실 용액을 추가합니다.S.cerevisiae와 S.pombe 문화를 각각 섭씨 30도, 섭씨 32도에서 배양하고 6분 동안 지속적인 동요를 합니다. 그 후, 각 배양의 작은 알리쿼트를 제거하고 자동 세포 카운터 또는 노이바우어 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 원심분리기는 세포를 수집하는 데 5분 동안 2, 500배, 섭씨 4도에서 분리됩니다.상체를 버리고 얼음 차가운 한 번 PBS로 세포를 씻으십시오. 원심분리기는 다시 2, 500배, 섭씨 4도에서 5분간 다시 원심분리기를 사용한다. 다음으로, 얼음 의 5 밀리리터에 세포를 다시 일시 중단 한 번 PBS.S.cerevisiae 및 S.pombe 세포를 3 대 1의 비율로 혼합합니다. 혼합 샘플을 2, 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 액체 질소로 세포를 동결 플래시.사용 준비가 될 때까지 샘플을 음수 섭씨 80도에 저장합니다. 진행 준비를 마쳤을 때, 약 20~30분 동안 얼음 에 세포를 해동하십시오. 적응된 효모 RNA 추출 키트를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNA를 추출합니다.이 후 필터 카트리지를 최종 수집 튜브로 옮기습니다. 100섭씨까지 예열된 DEPC 처리 RNase 프리 워터 50 마이크로리터로 RNA를 엘테. 16, 000배 에서 1분간 원심분리기.그런 다음 예열된 DEPC 처리 RNase 프리 워터 50 마이크로리터를 사용하여 RNA를 동일한 튜브로 다시 엘로트합니다. 원심분리기는 16, 000배 g에서 1분 동안 전체 샘플 볼륨이 필터를 통과했는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 원심분리기는 더 오랜 시간 동안 다시 원심분리기를 다시 합니다.완료되면 적절한 장비를 사용하여 샘플의 순도를 정량화하고 확인하십시오. DEPC 처리 된 뉴클레아제없는 물을 사용하여 이전에 획득 한 RNA의 농도를 밀리리터 당 2 밀리그램으로 조정하십시오. Aliquot 200 마이크로그램의 총 RNA를 10분 동안 섭씨 60도에서 가열합니다.즉시 2 분 동안 얼음에 차가운. DEPC 처리 RNase 가 없는 물 600마이크로리터를 추가합니다. 바이오타이니션 버퍼 100마이크로리터를 추가한 다음 200마이크로리터의 비오틴 HPDP를 추가합니다.비오틴 HPDP 솔루션이 용액에서 침전되는 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 량의 최대 40%까지 DMSO 또는 DMF의 볼륨을 증가시합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 3시간 동안 부드러운 교반으로 실온에서 배양합니다. 그 후, 튜브에 약 동일한 부피의 클로로폼을 추가하고 적극적으로 섞는다.원심분리기는 13, 000배, 섭씨 4도에서 5분간. 다음으로 상층을 새로운 2밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮기십시오. 시료 부피의 약 1/10에 해당하는 5개의 어금다 나트륨을 추가합니다.그런 다음 샘플을 혼합합니다. 먼저 생체화 RNA를 섭씨 65도에서 10분간 가열합니다. 그런 다음 얼음에 샘플을 5 분 동안 식힙니다.생체 화 RNA에 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 구슬 100 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 90분 동안 약간의 흔들림으로 배양하세요. 키트와 함께 제공된 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓습니다.다음으로, 열에 실온 세척 버퍼의 900 마이크로 리터를 추가합니다. 200 마이크로리터 비드 및 RNA 혼합물을 컬럼에 적용합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 흐름을 수집한 다음 동일한 자기 컬럼에 다시 적용합니다.라벨이 없는 RNA 분획을 나타내기 때문에 필요한 경우 이 흐름을 유지합니다. 다른 분획의 RT-qPCR 유효성 검사를 시작하려면 먼저 텍스트에 설명된 대로 cDNA를 합성합니다. 그런 다음 표준 프로토콜을 사용하여 실시간 qPCR으로 cDNA를 증폭시합니다.4-티우라실의 유무에 관계없이 배양된 야생형 세포로부터 정제된 분획에서 측정된 성적증명서 수준은 이 절차가 특별히 표지된 RNA를 정화하는 것을 확인하였다. spt20 델타 균주의 분석은 총 정상 상태 RNA의 양이 크게 변하지 않거나 테스트 된 유전자에 대해서만 약간 감소한다는 것을 보여줍니다. bre1에 대해 삭제된 균주에 대해도 유사한 결과가 나오게 됩니다.그러나, spt20 델타 균주에서 새로 전사된 RNA의 분석은 모든 시험된 유전자를 위한 mRNA 합성에 있는 3 5 배 감소를 제시합니다. 한편, bre1의 손실은 더 신중하지만 여전히 눈에 띄는 감소로 이어집니다. spt7의 유도 가능한 고갈시, 사가 복합체의 구조적 서브유닛, 새로 전사된 mRNA 수준은 삭제 균주와 유사한 정도로 감소된다.총 RNA 수준이 게놈 전체 분석에 의해 측정될 때, 단지 몇몇 유전자는 spt20의 삭제 시 그들의 발현 수준이 위로 조절또는 아래로 조절에 의해 변경되는 것을 보입니다. 그러나, 새로 전사된 RNA의 분석은 4, 000 이상의 유전자의 수준이 신진 효모에서 RNA 폴리머라제 II 전사에 사가의 글로벌 긍정적 인 효과를 시사 하는 spt20의 삭제시 적어도 두 배 이상 감소되는 것으로 나타났습니다. 이 방법은 Saccharomyces cerevisiae에 있는 전사에 있는 통찰력을 제공할 수 있더라도, 이 프로토콜을 사용하여에 약간 변이로만 적용되었습니다, 우리는 mRNA 분해에 있는 글로벌 감소에 의해 보상된 mRNA 합성에 있는 글로벌 감소를 검출할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

연구

유전학

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

효 모 S. cerevisiae Hypoxic 응답 하는 동안 시간이 지남에 mRNA 수준 측정

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...