Name: saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Agradecemos a Laszlo Tora pelo seu apoio e V. Fisher, K. Schumacher e F. El Saafin para suas discussões. Tuberculose foi apoiado por uma bolsa Marie Curie-ITN (documento PITN-GA-2013-606806, NR-NET) e o arco de Fondation. Este trabalho foi financiado por fundos da Agence Nationale de la Recherche (SAGA2 ANR-15-CE11-0022). Este estudo foi suportado também por ANR-10-LABX-0030-INRT, um fundo de Estado francês, gerido pela Agence Nationale de la Recherche sob o quadro programa Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. célula de cultivo e rapamicina depleção de uma subunidade da SAGA
<ol><li>Para cada cepa de S. cerevisiae e replicar, incluindo o selvagem-tipo ou cepas de controle, inocular uma única colônia de um prato fresco em 5 mL de meio YPD (2% de peptona, extrato de levedura 1% e 2% de glicose).</li>
	<li>Desenvolvem-se células de S. cerevisiae durante a noite a 30 ° C, com agitação constante (150 rpm).</li>
	<li>Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) e diluir a cultura para uma OD...

<ol>
	<li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Run-On+Sequencing+(GRO-Seq).">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. 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Enquanto ainda estão a melhorar todo o genoma de ferramentas para analisar as alterações na transcrição, a análise exclusiva da transcriptoma através da quantificação dos níveis de estado estacionário de RNA pode não refletir com precisão as alterações na atividade do RNA polymerase II. Com efeito, os níveis do mRNA são regulados não só pela síntese do RNA, mas também pela sua maturação e degradação. Para medir a síntese de mRNA desacoplada da degradação do mRNA, protocolos distintos foram des...

As células respondem a sinais endógenos e exógenos, através da alteração dinâmica do seu programa de expressão do gene. Nos últimos anos, um enorme desenvolvimento das metodologias de todo o genoma permite a descrição precisa e abrangente de transcriptoma mudanças em condições diferentes. Na maioria dos estudos transcriptomic, sequenciamento de hibridação ou elevado-throughput de microarray são usadas para quantificar os níveis de RNA de uma fração de RNA total estado estacionário. Transcriptional mudanças sob uma perturbação específica podem exibir uma ampla gama de resultados possíveis, com um amplo espectro de genes sendo - up ou ativador ou mudanças de expressão de genes específicos. Expressão do gene é o resultado de um equilíbrio de aperfeiçoá-lo — ou estado estacionário — entre a síntese de RNA pela ARN-polimerase e outros processos que afetam os níveis de RNA. Transcrição de RNA polimerase II, incluindo suas três fases distintas (iniciação, alongamento e término), é altamente e intricadamente associado com processamento, exportação citoplasmática, tradução e degradação do mRNA.
Vários estudos recentes demonstraram que a decadência e a síntese de mRNAs são mecanismos acoplados e mostraram que efeitos transcriptional sobre mutação ou sob estímulos podem ser negligenciados quando quantificar o RNA total de estado estacionário. Em primeiro lugar, a detecção de alterações transcricionais através da análise dos níveis de estado estacionário de mRNA sempre depende de mRNAs Half-Life. Uma vez que a perturbação é introduzida, os níveis de estado estacionário de mRNAs com meia-vida longa serão muito menos afetados do que aqueles dos mRNAs com meia-vida curta. Portanto, a capacidade de detecção das alterações na síntese do RNA é fortemente tendencioso em favor de transcrições de curta duração, enquanto a análise das espécies de mRNA caudais pode falhar para revelar alterações dinâmicas na taxa de transcrição. Em segundo lugar, vários relatos têm demonstrado que, tanto em leveduras e mamíferos, mudanças globais na transcrição podem ser negligenciadas ao analisar os níveis de estado estacionário de mRNA. Isto é provavelmente devido os mecanismos que vinculam a síntese de mRNA e degradação, resultando em buffer de mRNA. Isto levou ao desenvolvimento de novos protocolos para quantificar a síntese de mRNA desacoplada da degradação, através da análise do mRNA recentemente transcrito. Nos últimos anos, foram apresentadas várias alternativas, incluindo sequenciamento pperigoso global (GRO-seq)1e transcrição de alongamento nativo sequenciamento (NET-seq)2,3. Aqui, apresentamos um protocolo desenvolvido inicialmente em células de mamíferos4,5,6 e em seguida adaptado para levedura7,8,9,10, 11, que é baseado no RNA etiquetando com um nucleosídeo thiolated ou base analógica, 4-thiouridine (4sU) ou 4-thiouracil (4tU), respectivamente.
Esse método especificamente purifica recém transcrito de RNA das células no qual ARN são pulso-etiquetadas com 4sU com virtualmente nenhuma interferência na homeostase da célula. Portanto, uma vez que as células são expostas a 4sU, a molécula rapidamente é captação, fosforilada para 4sU-trifosfato e incorporada em RNAs sendo transcritos. Uma vez rotulado de pulso, é possível extrair o RNA celular total (correspondente aos níveis de estado estacionário do RNA), e, posteriormente, a fração de RNA 4sU-rotulado thiol-especificamente modificado, levando à formação de uma ligação dissulfureto entre biotina e a recentemente transcrito de RNA4,5. No entanto, 4sU só pode ser a captação pelas células expressando um transporte de nucleosídeo, como o transporte de nucleosídeo equilibrative humano (hENT1), impedindo a sua utilização imediata em leveduras brotamento ou fissão. Enquanto um pode expressar a hENT1 em S. pombe ou S. cerevisiae, uma abordagem mais fácil pode ser alcançada usando o 4tU base modificado, uma vez que as células de levedura podem demorar até 4tU, sem a necessidade de expressão de um transporte de nucleosídeos10, 11 , 12 , 13. na verdade, o metabolismo do 4tU exige a atividade da enzima uracila Fosforibosiltransferase (UPRT). Em vários organismos, incluindo o fermento mas não mamíferos, UPRT é essencial para uma via de salvamento de pirimidina, reciclagem uracil para monofosfato de uridina.
Um viés importante em estudos de transcriptomic pode ser introduzido pela normalização entre diferentes amostras analisadas em paralelo. De fato, muitos fatores diferentes podem afetar a análise comparativa da transcriptoma do mutante e as estirpes de tipo selvagem: a eficiência do lysis da pilha, as diferenças na extração e recuperação de RNA e desvios na calibração de scanner para análise de microarray , entre outros. Como discutido acima, essas variações podem ser particularmente enganosas, quando são esperados efeitos globais na transcrição do RNA polimerase II. Uma elegante significa precisão comparar taxas de síntese de mRNA entre diferentes amostras foi projetada usando o fermento de fissão distantemente relacionados Schizosaccharomyces pombe como padrão interno. Por isso, um número fixo de rotulado S. pombe células é adicionado para as amostras de S. cerevisiae , células selvagem-tipo ou mutantes, antes da lise celular e de extração de RNA10. Posteriormente, RNAs de estado estacionário e recentemente sintetizadas de S. pombe e S. cerevisiae são quantificados por RT-qPCR ou através do uso de chips de microarray ou arranjar em sequência do elevado-throughput10. Combinando estes dados com modelagem cinética, absolutas taxas de síntese de mRNA e decadência em leveduras brotamento podem ser medidas.
No âmbito do presente manuscrito, vamos mostrar como a análise do RNA transcrito recentemente autorizados a revelar um papel global para os complexos coactivator SAGA e TFIID na transcrição de RNA polimerase II em brotamento fermento14,15, 16. Importante, após estudos quantificar os níveis de RNAm de estado estacionário em S. cerevisiae e sugeriram que a SAGA desempenha uma função predominante em um conjunto limitado de genes de fermento que são fortemente afetadas por mutações na SAGA, mas relativamente resistente à TFIID mutações17,18,19. Surpreendentemente, as atividades enzimáticas SAGA foram mostradas para agir sobre o genoma inteiro transcrito, sugerindo um papel mais amplo para esse ativador co na transcrição do RNA polimerase II. Observou-se diminuição da recrutamento de II de polimerase de RNA em genes mais expressos mediante a inativação da SAGA ou TFIID, sugerindo que estes coactivators trabalham juntos na maioria dos genes. Portanto, a quantificação de mRNA recentemente transcrito revelou que a SAGA e TFIID são necessários para a transcrição dos genes quase todos pela RNA polimerase II14,15,16. A implementação de mecanismos compensatórios emerge como uma maneira para que as células lidar com uma diminuição global da síntese de mRNA que é armazenado em buffer por uma simultânea redução global na degradação do mRNA. SAGA adiciona à lista de fatores, tendo um efeito global na transcrição do RNA polimerase II, a tais como subunidades de RNA Pol II10, o mediador coactivator complexo20, o general transcrição fator TFIIH21,22 e indirectamente, de elementos de degradação do mRNA máquinas9,10,23. Tais eventos compensatórios foram observados universalmente em mutantes SAGA, contabilidade para as modestas e limitadas alterações nos níveis de RNAm de estado estacionário apesar de uma diminuição global e grave na síntese de mRNA14. Análises semelhantes também foram realizadas em uma cepa de exclusão BRE1 , resultando em uma perda completa da ubiquitination histona H2B. Curiosamente, um tanto mais suave mas consistente efeito global na transcrição do RNA polimerase II poderia ser detectado na ausência de Bre1, indicando que a rotulagem metabólica do RNA recém transcrito no fermento pode detectar e quantificar uma vasta gama de mudanças no mRNA taxas de síntese.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">4-Thiouracil</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 440736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:119px;">Euromedex</td>
			<td style="width:139px;">Cat# SYN-1185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:216px;">RiboPure RNA Purification kit, yeast</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# AM1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">EZ-Link HPDP Biotin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 21341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Thiolutin</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:139px;">ab143556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">&#181;MACS Streptavidin kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 130-074-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Transcriptor Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">03 531 295 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SYBR Green I Master</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Yeast Genome 2.0</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">900555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity

Globais defeitos na transcrição do RNA polimerase II podem ser ignorados pelos estudos de transcriptomic, analisando o estado estacionário do RNA. Com efeito, a diminuição global da síntese de mRNA foi mostrada para ser compensado por uma diminuição simultânea na degradação do mRNA para restaurar os níveis normais de estado estacionário. Portanto, a quantificação de todo o genoma de síntese de mRNA, independentemente do decaimento do mRNA, é o melhor reflexo direto da atividade transcricional de RNA polimerase II. Aqui, vamos discutir um método usando não-distorçer metabólica rotulagem de RNAs nascentes em Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Especificamente, as células são cultivadas por 6 min com uma uracila analógico, 4-thiouracil, e os rotulado RNAs recém transcritos são purificados e quantificados para determinar as taxas de síntese de mRNA individuais todos os. Além disso, usando rotulado Schizosaccharomyces pombe células como padrão interno permite comparar a síntese de mRNA em S. cerevisiae de diferentes linhagens. Usando este protocolo e encaixe os dados com um modelo cinético dinâmico, as taxas de decaimento do mRNA correspondente podem ser determinadas.

Ao realizar a rotulagem metabólica do RNA recém transcrito, vários aspectos precisam ser controlados: o tempo e a eficiência da rotulagem, a proporção de pico-no, o protocolo de extração e a eficácia de biotinylation (incluindo relação sinal-ruído), entre outros. Estas condições foram extensivamente e metodicamente mostradas por outros7,10,11. Aqui focamos principalmente sobre a int...

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Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

A principal vantagem desta técnica é que ela reflete a atividade de polimerase II do RNA medindo mRNA recém-sintetizado que não são influenciados pela degradação do RNA. Este protocolo foi originalmente descrito usando hibridização de microarray, mas pode ser facilmente adotado para sequenciamento de alta duração de mRNA recém-transcrito. Demonstrando esse procedimento estará Tiago Baptista, ex-aluno de pós-graduação do nosso laboratório.Depois de inocular as células S.cerevisiae, cresça-as durante a noite a 30 graus Celsius com agitação constante a 150 RPM. No dia seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Diluir a cultura para um OD600 de aproximadamente 0,1 em 100 mililitros de meio YPD.Cresça as células até que o OD600 esteja em torno de 0,8. Depois disso, meça o OD600 da cultura S.pombe da noite para o dia. Diluir esta cultura para um OD600 de aproximadamente 0,1 em 500 mililitros de meio YAS e deixá-lo crescer até que o OD600 seja aproximadamente 0,8.Primeiro, prepare uma nova solução de dois molares de quatro tiocral. Mantenha a solução preparada à temperatura ambiente e protegida da luz. Adicione a solução de quatro tioracil às culturas S.cerevisiae e S.pombe de tal forma que a concentração final seja de cinco mililitros.Incubar as culturas S.cerevisiae e S.pombe a 30 graus Celsius e 32 graus Celsius, respectivamente, com agitação constante por seis minutos. Depois disso, remova uma pequena alíquota de cada cultura e conte as células usando um contador automático de células ou uma câmara de Neubauer. Centrífuga a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para coletar as células.Descarte o supernasce e lave as células com gelo frio uma vez PBS. Centrifugar novamente a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, resuspense as células em cinco mililitros de gelo frio uma vez PBS.Misture as células S.cerevisiae e S.pombe a uma proporção de três para um. Centrifugar as amostras mistas a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o PBS e congele as células em nitrogênio líquido.Armazene a amostra a 80 graus Celsius negativo até estar pronto para usar. Quando estiver pronto para prosseguir, descongele as células no gelo por aproximadamente 20 a 30 minutos. Use um kit de extração de RNA de levedura adaptado para extrair o RNA conforme descrito no protocolo de texto.Depois disso, transfira o cartucho do filtro para o tubo de coleta final. Elute o RNA com 50 microliters de água livre de RNase tratada com DEPC que foi pré-aquecido a 100 graus Celsius. Centrifugar a 16.000 vezes por um minuto.Em seguida, use 50 microliters de água pré-aquecido tratado de RNase tratado com DEPC para elutar o RNA novamente para o mesmo tubo. Centrifugar a 16.000 vezes g por um minuto certificando-se de que todo o volume da amostra passou pelo filtro. Se não o fez, centrífuga novamente por um período maior de tempo.Quando terminar, quantifique e verifique a pureza da amostra utilizando o equipamento apropriado. Use água sem nuclease tratada com DEPC para ajustar a concentração do RNA adquirido anteriormente para dois miligramas por mililitro. Alíquota de 200 microgramas de RNA total e aqueça-o a 60 graus Celsius por 10 minutos.Imediatamente esfrie no gelo por dois minutos. Adicione 600 microliters de água sem RNase tratada com DEPC. Adicione 100 microliters de tampão de biotiningação e, em seguida, adicione 200 microliters de biotina HPDP.Se a solução biotina HPDP precipitar-se fora da solução, aumente o volume de DMSO ou DMF em até 40% do volume de reação, conforme descrito no protocolo de texto. Proteja a amostra da luz e incuba-a à temperatura ambiente com agitação suave por três horas. Depois disso, adicione um volume aproximadamente igual de clorofórmio aos tubos e misture vigorosamente.Centrifugar a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, transfira cuidadosamente a fase superior para novos dois tubos mililitros. Adicione uma quantidade de cinco cloreto de sódio molar igual a aproximadamente 1/10 do volume amostral.Em seguida, misture a amostra. Primeiro, aqueça o RNA biotinilado a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, esfrie as amostras no gelo por cinco minutos.Adicione 100 microliters de contas magnéticas revestidas de Streptavidin ao RNA biotinilado. Incubar em temperatura ambiente com leve tremor por 90 minutos. Coloque as colunas fornecidas com o kit no suporte magnético.Em seguida, adicione 900 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente às colunas. Aplique a mistura de 200 microliter e RNA nas colunas. Colete o fluxo em tubos de 1,5 mililitro e, em seguida, aplique-o novamente na mesma coluna magnética.Mantenha este fluxo, se necessário, pois representa a fração de RNA sem rótulo. Para iniciar a validação rt-qPCR das diferentes frações, primeiro sintetize o CDNA conforme descrito no texto. Em seguida, amplie o cDNA por qPCR em tempo real usando um protocolo padrão.Os níveis medidos de transcrições em frações purificadas de células do tipo selvagem cultivadas com e sem quatro tioracil confirmaram que este procedimento purifica especificamente o RNA rotulado. A análise da cepa delta spt20 revela que a quantidade de RNA de estado estável total é em grande parte inalterada ou é apenas levemente reduzida para os genes testados. Resultados semelhantes são vistos para cepas excluídas para bre1.No entanto, a análise do RNA recém-transcrito na cepa delta spt20 revela uma redução de três a cinco vezes na síntese de mRNA para todos os genes testados. Enquanto isso, a perda de bre1 leva a uma diminuição mais discreta, mas ainda visível. Após o esgotamento indutível do spt7, uma subunidade estrutural do complexo da saga, os níveis de mRNA recém-transcritos são reduzidos a uma medida semelhante à cepa de exclusão.Quando os níveis totais de RNA são medidos pela análise em todo o genoma, apenas alguns genes são vistos com seus níveis de expressão alterados após a exclusão do spt20, seja regulando ou regulando. No entanto, a análise do RNA recém-transcrito revela que os níveis de mais de 4.000 genes são significativamente reduzidos pelo menos duas vezes após a exclusão do spt20, o que sugere um efeito positivo global da saga na transcrição da polimerase II do RNA em leveduras brotantes. Embora este método possa fornecer insights na transcrição em Saccharomyces cerevisiae, ele só foi aplicado com pequenas variações ao usar este protocolo, poderíamos detectar uma diminuição global na síntese de mRNA que foi compensada por uma diminuição global na degradação do mRNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Genética

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...