Name: saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Agradecemos a Laszlo Tora por su apoyo y V. Fisher, Schumacher K. y F. El Saafin para sus discusiones. T.B. fue apoyado por una beca Marie Curie ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) y la Fundación arco. Este trabajo fue financiado por los fondos de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Este estudio fue apoyado también por ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo del Estado francés a cargo de la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. célula de cultivo y el agotamiento de la rapamicina de una subunidad de la SAGA
<ol><li>Para cada cepa de S. cerevisiae y repetición, incluyendo tipo o cepas de control, inocular una colonia solo de un plato fresco en 5 mL de medio YPD (2% peptona, extracto de levadura 1% y 2% de glucosa).</li>
	<li>Cultivar células de S. cerevisiae durante la noche a 30 ° C con agitación constante (150 rpm).</li>
	<li>Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) y diluir la cultura a un OD600</s...

<ol>
	<li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Run-On+Sequencing+(GRO-Seq).">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. 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Mientras todavía están mejorando herramientas de genoma para analizar cambios en la transcripción, el único análisis de transcriptoma a través de la cuantificación de los niveles de estado estacionario del ARN podría no reflejan cambios en la actividad de RNA polimerasa II. De hecho, niveles de ARNm están regulados no sólo por la síntesis de ARN, sino también por su maduración y degradación. Para medir la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación del mRNA, distintos protocolos se han desarrollado en ...

Las células responden a estímulos endógenos y exógenos, a través de la alteración de la dinámica de su programa de expresión génica. En los últimos años un enorme desarrollo de metodologías de genoma permite la descripción precisa y completa de transcriptoma cambios en diferentes condiciones. En la mayoría de los estudios de transcriptómicos, microarray hibridación o alto rendimiento de secuenciación se utilizan para cuantificar niveles de ARN de una fracción de RNA total de estado estacionario. Cambios transcripcionales bajo una perturbación específica pueden mostrar una amplia gama de resultados posibles, con un amplio espectro de genes ser para arriba - u o o cambios de expresión del gen específico. Expresión génica es el resultado de un equilibrio optimizado, o estado estacionario, entre la síntesis de RNA por polimerasas del RNA y otros procesos que afectan a niveles de ARN. Transcripción de ARN polimerasa II, incluyendo sus tres fases (iniciación, elongación y terminación), es altamente y estrechamente asociado con procesamiento de mRNA, exportación citoplasmática, traducción y degradación.
Varios estudios recientes demostraron que descomposición y síntesis de mRNAs son mecanismos acoplados y demostraron que efectos transcripcionales a mutación o bajo estímulos pueden ser pasado por alto cuando la cuantificación de ARN total de estado estacionario. En primer lugar, la detección de cambios transcripcionales a través de los análisis de los niveles de estado estacionario de mRNA siempre depende de mRNAs Half-Life. Una vez que la perturbación se introduce, los niveles de estado estacionario de mRNAs con vida media larga se verá afectados mucho menos que los mRNAs con una vida media corta. Por lo tanto, la detección de los cambios en la síntesis de ARN es sesgada fuertemente a favor de las transcripciones de breve duración, mientras que el análisis de especies de mRNA perdurable puede no revelar cambios dinámicos en la tasa de transcripción. En segundo lugar, varios informes han demostrado que, tanto en levaduras y mamíferos, cambios globales en la transcripción pueden ser pasado por alto al analizar los niveles de estado estacionario de mRNA. Esto es probablemente debido a los mecanismos que vinculan la síntesis de mRNA y degradación resultante en mRNA buffering. Esto incitó el desarrollo de nuevos protocolos para cuantificar la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación, a través del análisis del ARNm recién transcrita. En los últimos años, se presentan varias alternativas, incluyendo la secuencia funcionamiento global (GRO-seq)1y transcripción elongación nativo secuenciación (NET-seq)2,3. Aquí, presentamos un protocolo, desarrollado inicialmente en células de mamíferos4,5,6 y luego adaptado a levadura7,8,9,10, 11, que se basa en RNA etiquetado con un nucleósido thiolated o base analógica, 4-thiouridine (4sU) o 4-tiouracilo (4tU), respectivamente.
Este método específicamente purifica ARN recién transcrito de las células en el que ARN son pulso marcado con 4sU prácticamente sin interferencia en la homeostasis celular. Por lo tanto, una vez que las células se exponen a 4sU, la molécula es rápidamente captados, fosforila a 4sU-trifosfato e incorporada en el ARN se transcribe. Una vez que pulso marcado, es posible extraer ARN celular total (correspondientes a niveles de estado estacionario del ARN) y, posteriormente, la fracción de RNA marcado con 4sU es tiol-específicamente modificado, dando lugar a la formación de un enlace disulfuro entre biotina y recién transcrito RNA4,5. Sin embargo, 4sU sólo pueden ser captados por las células expresando un transportador de nucleósidos, como el transportador de nucleósidos equilibrative humano (hENT1), impidiendo su uso inmediato en la levadura de gemación o fisión. Mientras que uno podría expresar hENT1 en S. pombe o en S. cerevisiae, se logra un acercamiento más fácil utilizando el 4tU base modificado, puesto que las células de levadura pueden tomar 4tU, sin la necesidad de expresión de un transportador de nucleósidos10, 11 , 12 , 13. de hecho, el metabolismo de 4tU requiere la actividad de la enzima uracilo fosforribosiltransferasa (UPRT). En varios organismos, incluyendo la levadura pero no mamíferos, UPRT es esencial para una vía de salvamento de pirimidina, reciclaje uracilo a monofosfato de uridina.
Un importante sesgo en estudios transcriptómicos puede ser introducido por la normalización entre diferentes muestras analizadas en paralelo. De hecho, muchos factores de la desviación pueden afectar el análisis comparativo del transcriptoma de cepas de tipo salvaje y mutante: la eficiencia de la lisis celular, las diferencias en la extracción y recuperación del RNA y las variaciones en la calibración del escáner para análisis de microarray , entre otros. Como hemos comentado anteriormente, estas variaciones pueden ser particularmente engañosas cuando se espera que los efectos globales en la transcripción del RNA polimerasa II. Un medio elegante para comparar con precisión las tasas de síntesis de mRNA entre diferentes muestras fue diseñado mediante el uso de la levadura del distante relacionado fisión Schizosaccharomyces pombe como estándar interno. Para ello, un número fijo de etiquetado S. pombe células se añade a las muestras de S. cerevisiae , células de tipo salvaje o mutantes, antes de la lisis celular y extracción de RNA10. Posteriormente, estado estacionario y recién sintetizados RNAs de S. pombe y S. cerevisiae se cuantifican por RT-qPCR o mediante el uso de chips de microarray o secuenciación de alto rendimiento10. Combinando estos datos con el modelado cinético, se pueden medir tasas absolutas de la síntesis de mRNA y decaimiento en levadura de florecimiento.
En el marco de este manuscrito, nos mostrará cómo el análisis del ARN recién transcrito permitió revelar un papel global para los complejos del coactivator SAGA y TFIID transcripción del RNA polimerasa II en florecimiento levadura14,15, 16. Lo importante, últimos estudios cuantificaron niveles de mRNA de estado estacionario en S. cerevisiae y sugirieron que SAGA desempeña una función predominante en un conjunto limitado de genes de levadura que son fuertemente afectadas por mutaciones en SAGA pero relativamente resistente a TFIID las mutaciones17,18,19. Sorprendentemente, las actividades enzimáticas de la SAGA fueron demostradas para actuar sobre el genoma transcrito entero, sugiriendo un papel más amplio para este coactivador en la transcripción del RNA polimerasa II. Se observó menor reclutamiento de RNA polimerasa II en genes más expresados sobre la inactivación de la SAGA o TFIID, sugiriendo que estos activación trabaja juntos en la mayoría de los genes. Por lo tanto, la cuantificación de ARNm recién transcrita reveló que SAGA y TFIID son necesarios para la transcripción de casi todos los genes de la RNA polimerasa II14,15,16. La implementación de mecanismos de compensación surge como una forma de las células hacer frente a una disminución global en la síntesis de mRNA que es protegida por una simultánea disminución global en la degradación del mRNA. SAGA suma a la lista de factores con un efecto global en la transcripción del RNA polimerasa II, como subunidades de ARN Pol II10, el mediador del coactivator complejo20, el general transcripción factor TFIIH21,22 e indirectamente, elementos de mRNA degradación maquinaria9,10,23. Tales eventos compensatorios universalmente fueron observadas en mutantes de la SAGA, son responsables de los cambios en los niveles de mRNA de estado estable a pesar de una disminución global y severo de la síntesis de mRNA14modestos y limitados. Análisis similares se realizaron en una cepa de eliminación BRE1 , resultando en una pérdida completa de ubiquitinación de histona H2B. Curiosamente, un mucho más suave pero consistente efecto global en la transcripción del RNA polimerasa II se podría detectar en ausencia de Bre1, indicando que el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito en la levadura puede detectar y cuantificar una gran variedad de cambios en el ARNm tasas de síntesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">4-Thiouracil</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 440736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:119px;">Euromedex</td>
			<td style="width:139px;">Cat# SYN-1185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:216px;">RiboPure RNA Purification kit, yeast</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# AM1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">EZ-Link HPDP Biotin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 21341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Thiolutin</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:139px;">ab143556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">&#181;MACS Streptavidin kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 130-074-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Transcriptor Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">03 531 295 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SYBR Green I Master</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Yeast Genome 2.0</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">900555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity

Globales defectos en la transcripción del RNA polimerasa II podrían dominados por transcriptómicos estudios análisis de RNA de estado estacionario. De hecho, la disminución global en la síntesis de ARNm ha demostrado ser compensado por una disminución simultánea en la degradación del mRNA para restaurar los niveles de estado estacionario normales. Por lo tanto, la cuantificación del genoma de la síntesis de mRNA, independientemente del decaimiento del mRNA, es el mejor reflejo directo de la actividad transcripcional de RNA polimerasa II. Aquí, discutimos un método usando el etiquetado metabólico no perturbar de ARN naciente en Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En concreto, las células se cultivan para el minuto 6 con un uracilo analógico, 4-tiouracilo y el etiquetado ARN recién transcrito es purificado y cuantificado para determinar las tasas de síntesis de los ARNm individuales. Por otra parte, utilizando etiquetado Schizosaccharomyces pombe células como estándar interno permite comparar la síntesis de mRNA en S. cerevisiae de diferentes cepas. Usando este protocolo y montaje de los datos con un modelo cinético dinámico, se pueden determinar las tasas de decaimiento de ARNm correspondiente.

Cuando se realiza el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito, varios aspectos que controlar: el tiempo y la eficiencia de la rotulación, la proporción de espiga en, el protocolo de extracción y la eficacia de Biotinilación (incluyendo signal to noise ratio), entre otros. Estas condiciones han sido extensivamente y metódicamente demostradas por otros7,10,11. Aquí nos centramos prin...

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Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

La principal ventaja de esta técnica es que refleja la actividad del ARN polimerasa II midiendo el ARNm recién sintetizado que no están influenciados por la degradación del ARN. Este protocolo se describió originalmente mediante hibridación de microarray, pero se puede adoptar fácilmente para una secuenciación a través del ARNm recién transcrito. Demostrar este procedimiento estará Tiago Baptista, un ex estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.Después de inocular las células de S.cerevisiae, cultivarlas durante la noche a 30 grados Celsius con agitación constante a 150 RPM. Al día siguiente, mida la densidad óptica a 600 nanómetros. Diluir el cultivo a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 100 mililitros de medio YPD.Crecer las células hasta que el OD600 es alrededor de 0.8. Después de esto, medir el OD600 del cultivo de la noche S.pombe. Diluir este cultivo a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 500 mililitros de medio YAS y dejar que crezca hasta que el OD600 sea aproximadamente 0,8.En primer lugar, preparar una solución fresca de dos molares de cuatro tiouracil. Mantenga la solución preparada a temperatura ambiente y protegida de la luz. Añadir la solución de cuatro tiuralolos a los cultivos S.cerevisiae y S.pombe de forma que la concentración final sea de cinco mililitros.Incubar los cultivos S.cerevisiae y S.pombe a 30 grados centígrados y 32 grados centígrados respectivamente con agitación constante durante seis minutos. Después de esto, retire una pequeña alícuota de cada cultivo y cuente las células usando un contador celular automático o una cámara Neubauer. Centrifugar a 2.500 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para recoger las células.Deseche el sobrenadante y lave las células con hielo frío una vez PBS. Centrifugar de nuevo a 2.500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, resuspender las células en cinco mililitros de hielo frío una vez PBS.Mezclar las células S.cerevisiae y S.pombe en una proporción de tres a uno. Centrifugar las muestras mezcladas a 2.500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, retire el PBS y congele las células en nitrógeno líquido.Almacene la muestra a 80 grados Celsius negativos hasta que esté lista para su uso. Cuando esté listo para continuar, descongele las células sobre hielo durante aproximadamente 20 a 30 minutos. Utilice un kit de extracción de ARN de levadura adaptado para extraer el ARN como se describe en el protocolo de texto.Después de esto, transfiera el cartucho del filtro al tubo de recogida final. Eluda el ARN con 50 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC que se precalentaba a 100 grados centígrados. Centrífuga a 16.000 g durante un minuto.A continuación, utilice 50 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC precalentada para eluir el ARN de nuevo al mismo tubo. Centrifugar a 16.000 veces g durante un minuto asegurándose de que todo el volumen de la muestra haya pasado a través del filtro. Si no lo ha hecho, centrifugar de nuevo durante un período de tiempo más largo.Cuando haya terminado, cuantifique y compruebe la pureza de la muestra utilizando el equipo adecuado. Utilice agua libre de nucleasa tratada con DEPC para ajustar la concentración del ARN adquirido anteriormente a dos miligramos por mililitro. Aliquot 200 microgramos de ARN total y calentarlo a 60 grados Celsius durante 10 minutos.Enfríe inmediatamente sobre hielo durante dos minutos. Agregue 600 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC. Añadir 100 microlitros de tampón de biotinilación y luego añadir 200 microlitros de biotina HPDP.Si la solución HPDP de biotina se precipita fuera de la solución, aumente el volumen de DMSO o DMF hasta un 40% del volumen de reacción como se describe en el protocolo de texto. Proteja la muestra de la luz e incubarla a temperatura ambiente con agitación suave durante tres horas. Después de esto, añadir un volumen aproximadamente igual de cloroformo a los tubos y mezclar vigorosamente.Centrifugar a 13.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, transfiera cuidadosamente la fase superior a nuevos tubos de dos mililitros. Añadir una cantidad de cinco cloruros de sodio molar igual a aproximadamente 1/10 del volumen de la muestra.A continuación, mezcle la muestra. Primero, calienta el ARN biotinilado a 65 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, enfríe las muestras en hielo durante cinco minutos.Agregue 100 microlitros de cuentas magnéticas recubiertas de Streptavidin al ARN biotinilado. Incubar a temperatura ambiente con ligero temblor durante 90 minutos. Coloque las columnas provistas del kit en el soporte magnético.A continuación, agregue 900 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente a las columnas. Aplique la mezcla de cordón de 200 microlitrotro y ARN en las columnas. Recoja el flujo a través en tubos de 1,5 mililitros y luego aplíquelo de nuevo a la misma columna magnética.Mantenga este flujo a través si es necesario, ya que representa la fracción de ARN sin etiquetar. Para comenzar la validación RT-qPCR de las diferentes fracciones, primero sintetice cDNA como se describe en el texto. A continuación, amplifique el ADNc mediante qPCR en tiempo real utilizando un protocolo estándar.Los niveles medidos de transcripciones en fracciones purificadas a partir de células de tipo salvaje cultivadas con y sin cuatro tiouracidas confirmaron este procedimiento purifica específicamente el ARN etiquetado. El análisis de la cepa delta spt20 revela que la cantidad de ARN total en estado estacionario no cambia en gran medida o sólo se reduce ligeramente para los genes analizados. Se observan resultados similares para las cepas eliminadas para bre1.Sin embargo, el análisis del ARN recién transcrito en la cepa delta spt20 revela una disminución de tres a cinco veces en la síntesis de ARNm para todos los genes probados. Mientras tanto, la pérdida de bre1 conduce a una disminución más discreta pero aún visible. Tras el agotamiento inducible de spt7, una subunidad estructural del complejo de la saga, los niveles de ARNm recién transcritos se reducen en una medida similar a la cepa de eliminación.Cuando los niveles totales de ARN se miden mediante análisis de todo el genoma, sólo unos pocos genes se ven alterados sus niveles de expresión tras la eliminación de spt20 ya sea regulando hacia arriba o regulando hacia abajo. Sin embargo, el análisis del ARN recién transcrito revela que los niveles de más de 4.000 genes se reducen significativamente al menos dos veces al delegar el spt20, lo que sugiere un efecto positivo global de la saga en la transcripción de ARN polimerasa II en levaduras en ciernes. Aunque este método puede proporcionar información sobre la transcripción en Saccharomyces cerevisiae, sólo se aplicó con ligeras variaciones al usar este protocolo, pudimos detectar una disminución global en la síntesis de ARNm que fue compensada por una disminución global en la degradación del ARNm.

Research

JoVE Journal

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Investigación

Genética

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Etiquetado metabólico y perfiles de RNAs de transferencia utilizando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...