Name: saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Vi tackar Laszlo Tora för hans stöd och V. Fisher, K. Schumacher och F. El Saafin för sina diskussioner. T.B. stöddes av ett Marie Curie-ITN-stipendium (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) och Fondation ARC. Detta arbete stöds av medel från Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Denna studie stöddes också av ANR-10-LABX-0030-INRT, en franska statens fond som förvaltas av den Agence Nationale de la Recherche under den ram program Investissements pris ANR-10-IDEX-0002-02.

1. cell odling och Rapamycin utarmning av en SAGA subenhet
<ol><li>För varje S. cerevisiae stam och replikera Inokulera inklusive vildtyp eller kontroll stammar, en enda koloni från en färsk plattan på 5 mL YPD medium (2% pepton, 1% jästextrakt och 2% glukos).</li>
	<li>Odla S. cerevisiae cellerna övernattning på 30 ° C med konstant agitation (150 rpm).</li>
	<li>Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) och späd kulturen till en OD600 av cirka 0,1 i 100 mL YPD medi...

<ol>
	<li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Run-On+Sequencing+(GRO-Seq).">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+elongating+transcript+sequencing+(NET-seq).">Native elongating transcript sequencing (NET-seq).</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Kenzelmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals.">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).</li><li>Radle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+genome-wide+RNA+synthesis+and+decay+rates+with+Dynamic+Transcriptome+Analysis+(DTA).">Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA).</a> Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+eukaryotic+mRNA+degradation+reveals+Xrn1-dependent+buffering+of+transcript+levels.">Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels.</a> Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+dynamic+transcriptome+analysis+(cDTA)+reveals+mutual+feedback+between+mRNA+synthesis+and+degradation.">Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation.</a> Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Eser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+metabolism+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+genome.">Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome.</a> Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).</li><li>Baptista, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAGA+Is+a+General+Cofactor+for+RNA+Polymerase+II+Transcription.">SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).</li><li>Bonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SAGA+coactivator+complex+acts+on+the+whole+transcribed+genome+and+is+required+for+RNA+polymerase+II+transcription.">The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription.</a> Genes &amp; Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).</li><li>Warfield, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+Nearly+All+Yeast+RNA+Polymerase+II-Transcribed+Genes+Is+Dependent+on+Transcription+Factor+TFIID.">Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID.</a> Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).</li><li>Huisinga, K. L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+housekeeping+role+for+TFIID+and+a+highly+regulated+stress-related+role+for+SAGA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).</li><li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+roles+for+the+TFIID+and+SAGA+complexes+in+global+transcription.">Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription.</a> Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).</li><li>Lenstra, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+and+topology+of+chromatin+interaction+pathways+in+yeast.">The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast.</a> Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).</li><li>Plaschka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Mediator+core+initiation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex.</a> Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).</li><li>Helenius, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TFIIH+kinase+subunit+Mat1+for+RNA+Pol+II+C-terminal+domain+Ser5+phosphorylation,+transcription+and+mRNA+turnover.">Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover.</a> Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).</li><li>Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Covalent+Inactivation+of+TFIIH-Kinase+Reveals+an+Elongation+Checkpoint+and+Results+in+Widespread+mRNA+Stabilization.">Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization.</a> Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).</li><li>Haimovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+is+circular:+factors+for+mRNA+degradation+also+foster+mRNA+synthesis.">Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis.</a> Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+RNA+kinetics+using+RATE-seq.">Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq.</a> RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).</li><li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spt5+Plays+Vital+Roles+in+the+Control+of+Sense+and+Antisense+Transcription+Elongation.">Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation.</a> Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Paf1C-TFIIS+transcription+elongation+complex.">Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex.</a> Nature Communications. 8, 15741 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).</li><li>Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+NET-seq+analysis+defines+nascent+RNA+profiles+and+associated+RNA+processing+genome-wide.">Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide.</a> Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).</li><li>Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+comprehensive+representation+of+uniqueness+for+next-generation+sequencing+by+minimum+unique+length+analyses.">Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses.</a> PloS One. 8 (1), 53822 (2013).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hundreds+of+novel+UPF1+target+transcripts+by+direct+determination+of+whole+transcriptome+stability.">Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability.</a> RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo.+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Palozola, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+transcription+and+waves+of+gene+reactivation+during+mitotic+exit.">Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit.</a> Science. 358 (6359), 119-122 (2017).</li><li>Ardehali, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+Repressive+Complex+2+Methylates+Elongin+A+to+Regulate+Transcription.">Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).</li><li>Schulz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+surveillance+by+selective+termination+of+noncoding+RNA+synthesis.">Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis.</a> Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Duffy, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Rutkowski, A. J., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing,+and+Decay+by+Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+Using+4-Thiouridine.">High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).</li><li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li><li>Fuchs, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+genome-wide+transcription+elongation+speeds+and+rates+of+RNA+polymerase+II+transition+into+active+elongation+with+4sUDRB-seq.">Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq.</a> Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).</li><li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome.">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li></ol>

Samtidigt genome-wide verktyg för att analysera förändringar i transkription fortfarande förbättras, kanske den enda analysen av transkriptom genom kvantifiering av steady state nivåer av RNA inte korrekt återspeglar förändringar i RNA-polymeras II aktivitet. Faktiskt, mRNA nivåer regleras inte bara av RNA-syntes, utan även av deras mognad och nedbrytning. För att mäta mRNA-syntesen bortkopplat mRNA nedbrytning, har distinkta protokoll utvecklats under de senaste åren för analys av begynnande transkription...

Celler svarar på endogena och exogena ledtrådar, genom dynamisk ändring av deras gen uttryck program. Under senare år har tillåter en enorm utveckling av genome-wide metoder den exakt och övergripande beskrivningen av transkriptom förändringar i olika förhållanden. I de flesta transcriptomic studier, microarray hybridisering eller hög genomströmning sekvensering för att kvantifiera RNA-nivåer från en total steady state RNA bråkdel. Transkriptionell förändringar under en specifik störning kan visa ett brett spektrum av möjliga utfall, med antingen specifik gen uttryck ändringar eller ett stort spektrum av gener som antingen upp - eller nedreglerade. Genernas uttryck är resultatet av en finjusterad jämvikt — eller steady state — mellan RNA-syntes av RNA polymeraser och andra processer som påverkar RNA-nivåer. RNA-polymeras II transkription, inklusive dess tre olika faser (initiering, töjning och uppsägning), är mycket och intrikat associerad med mRNA bearbetning, cytoplasmiska export, översättning och nedbrytning.
Flera nyare studier visat att mRNA-syntesen och förfall är kopplat mekanismer och visade att transkriptionell effekter vid mutation eller under stimuli kan förbises när kvantifiera totala steady state RNA. Först, detektion av transkriptionell förändringar genom analyser av steady state nivåer av mRNA alltid beror på mRNA halveringstid. När störning introduceras, påverkas steady-state nivåerna av mRNA med långa halveringstider mycket mindre än de av mRNA med kort halveringstid. Därför är upptäcktsrisken förändringar i RNA-syntes starkt partisk till förmån för kortlivade avskrifter, medan analysen av hållbarare mRNA arter kan misslyckas att påvisa dynamiska förändringar i priset för transkription. För det andra, flera rapporter har visat att både i jäst och däggdjur, kan globala förändringar i transkription förbises när man analyserar steady-state nivåerna av mRNA. Detta beror sannolikt på de mekanismer som länk mRNA syntes och nedbrytning resulterar i mRNA buffring. Detta föranledde utvecklingen av nya protokoll att kvantifiera mRNA-syntesen bortkopplat nedbrytning, genom analys av nyligen transkriberas mRNA. Under senare år har har flera alternativ lagts fram, inklusive globala kör sekvensering (GRO-seq)1och infödda töjning avskrift sekvensering (NET-seq)2,3. Här presenterar vi ett protokoll från början utvecklades i däggdjursceller4,5,6 och sedan anpassas till jäst7,8,9,10, 11, som är baserad på RNA märkning med en thiolated nukleosid eller bas analog, 4-thiouridine (4sU) eller 4-thiouracil (4tU), respektive.
Denna metod renar specifikt nyligen transkriberade RNA från celler i vilka RNA är pulse-märkt med 4sU i princip ingen störning i cell homeostas. Därför, när celler utsätts för 4sU, molekylen är snabbt uptaken, fosforyleras till 4sU-trifosfat och införlivas i RNAs transkriberas. När puls-märkt, det är möjligt att extrahera totala cellulära RNA (motsvarande steady state nivåer av RNA), och, därefter, den 4sU-märkt RNA fraktionen är thiol-specifikt ändras, vilket leder till bildandet av en disulfide bond mellan biotin och Nyligen transkriberade RNA4,5. 4sU kan dock endast uptaken av de celler som uttrycker en nukleosid transportör, som mänsklig equilibrative nukleosid transportören (hENT1), förhindra dess omedelbar användning i spirande eller fission jäst. Medan en kunde uttrycka hENT1 i S. pombe eller S. cerevisiae, kan ett enklare förhållningssätt uppnås med den modifierade bas 4tU, eftersom jästcellerna kan 4tU, utan behov av uttryck för en nukleosid transportör10, 11 , 12 , 13. I själva verket metabolismen av 4tU kräver aktiviteten av enzymet uracil phosphoribosyltransferase (UPRT). I flera organismer, inklusive jäst men inte däggdjur, är UPRT avgörande för en pyrimidin bärgning väg, återvinning uracil till uridin monofosfat.
En viktig partiskhet i transcriptomic studier kan införas genom normalisering mellan olika prover analyseras parallellt. Faktiskt, många avvikande faktorer kan påverka den jämförande analysen av transkriptom mutant och vildtyps-stammar: effektiviteten av cellys, skillnader i utvinning och återvinning av RNA, och avvikelser i scanner kalibrering för microarray-analyser , bland annat. Som diskuterats ovan, kan sådana variationer vara särskilt vilseledande när globala effekter på RNA-polymeras II transkription förväntas. En elegant menar att noggrant jämföra mRNA syntes priser mellan olika prover utformades med avlägset besläktade fission jästen Schizosaccharomyces pombe som intern standard. För att ett fast antal märkt S. pombe celler läggs till S. cerevisiae proverna, antingen vildtyp eller muterade celler, före cell lysis och RNA extraktion10. Därefter är både steady-state och nyligen syntetiserade RNAs från S. pombe och S. cerevisiae kvantifierade antingen genom RT-qPCR eller via användning av microarray chips eller hög genomströmning sekvensering10. Kombinera dessa data med kinetic modellering, kan absoluta priser av mRNA-syntesen och förfall i spirande jäst mätas.
Inom ramen för detta manuskript, kommer vi att visa hur analysen av nyligen transkriberade RNA tillåtet för att avslöja en global roll för de coactivator komplex SAGA och TFIID i RNA-polymeras II transkription i spirande jäst14,15, 16. Ännu viktigare, tidigare studier kvantifieras steady state mRNA nivåer i S. cerevisiae och föreslog att SAGA spelar en dominerande funktion på en begränsad uppsättning jäst gener som är starkt påverkade av mutationer i SAGA men relativt resistenta mot TFIID mutationer17,18,19. Överraskande, visades SAGA enzymatiska aktiviteter att agera på hela transkriberas genomet, vilket tyder på en bredare roll för detta samarbete aktivator i RNA-polymeras II transkription. Minskad RNA-polymeras II rekrytering på mest uttryckt gener observerades vid inaktivering av SAGA eller TFIID, vilket tyder på att dessa coactivators fungerar tillsammans på de flesta gener. Kvantifiering av nyligen transkriberas mRNA avslöjade därför att SAGA och TFIID är nödvändiga för transkriptionen av nästan alla gener RNA-polymeras II14,15,16. Genomförandet av kompensationsmekanismer framstår som ett sätt för cellerna att klara av en global minskning av mRNA-syntesen som buffras av en samtidig global minskning av mRNA nedbrytning. SAGA läggs till i listan av faktorer som har en global inverkan på RNA-polymeras II transkription, såsom RNA Pol II subenheter10, medlare coactivator komplexa20och allmänna transkription faktorn TFIIH21,22 , och indirekt, element av mRNA nedbrytning maskiner9,10,23. Sådana kompenserande händelser observerades allmänt i SAGA mutanter, redovisning för de blygsamma och begränsade förändringarna i steady state mRNA nivåer trots en global och kraftig minskning av mRNA syntes14. Liknande analyser utfördes också i en BRE1 radering stam, vilket resulterar i en fullständig förlust av Histon H2B ubikvitinering. Intressant, kunde en mycket mildare men konsekvent global effekt på RNA-polymeras II transkription detekteras i avsaknad av Bre1, som anger att metabola märkning av nyligen transkriberade RNA i jäst kan detektera och kvantifiera ett brett utbud av förändringar i mRNA syntes priser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">4-Thiouracil</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 440736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:119px;">Euromedex</td>
			<td style="width:139px;">Cat# SYN-1185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:216px;">RiboPure RNA Purification kit, yeast</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# AM1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">EZ-Link HPDP Biotin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 21341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Thiolutin</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:139px;">ab143556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">&#181;MACS Streptavidin kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:139px;">Cat# 130-074-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Transcriptor Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">03 531 295 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SYBR Green I Master</td>
			<td style="width:119px;">Roche</td>
			<td style="width:139px;">4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Yeast Genome 2.0</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">900555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:139px;">00-0210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae metabolic labeling with 4-thiouracil and the quantification of newly synthesized mrna as a proxy for rna polymerase ii activity

Globala defekter i RNA-polymeras II transkription kan vara förbises av transcriptomic studier analysera steady state RNA. Den globala minskningen av mRNA-syntesen har faktiskt visat sig kompenseras av en samtidig minskning av mRNA nedbrytning att återställa normala steady state nivåer. Genome-wide kvantifiering av mRNA-syntesen, oberoende av mRNA förfall, är därför den bästa direkt återspegling av RNA-polymeras II transkriptionell aktivitet. Här diskuterar vi en metod med icke störande metabola märkning av begynnande RNAs i Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifikt, cellerna odlas för 6 min med en uracil analoga, 4-thiouracil, och märkt nyligen transkriberas RNASEN är renat och kvantifieras för att fastställa de syntes av alla enskilda mRNA. Dessutom använder märkt Schizosaccharomyces pombe celler som intern standard gör det möjligt att jämföra mRNA syntes i olika S. cerevisiae stammar. Använder det här protokollet och passande data med en dynamisk kinetiska modell, kan de motsvarande mRNA decay priserna fastställas.

När du utför metabola märkning av nyligen transkriberade RNA, flera aspekter behöver kontrolleras: tid och effektivitet av märkning, spike-i andel, protokollet utvinning och biotinylation effekt (inklusive signal-brus-förhållande), bland andra. Dessa villkor har varit omfattande och metodiskt visas av andra7,10,11. Här fokuserar vi främst på tolkning och omedelbara analyser som kan utf?...

Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity at Jo

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Protokollet beskrivs här baseras på genome-wide kvantifiering av nyligen syntetiserade mRNA renas från jästceller märkta med 4-thiouracil. Denna metod gör det möjligt för att mäta mRNA-syntesen bortkopplat mRNA förfall och ger således en exakt mätning av RNA-polymeras II transkription.

Saccharomyces cerevisiae Metaboliska märkning med 4-thiouracil och kvantifiering av nyligen syntetiseras mRNA som en Proxy för RNA-polymeras II aktivitet

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Den största fördelen med denna teknik är att den återspeglar RNA-polymeras II-aktivitet genom att mäta nysyntetiserat mRNA som inte påverkas av RNA-nedbrytning. Detta protokoll beskrevs ursprungligen med hjälp av microarray hybridisering, men kan lätt antas till hög-hela sekvensering av nyligen transkriberas mRNA. Demonstrera detta förfarande kommer att Tiago Baptista, en före detta grad student från vårt laboratorium.Efter inokulering av S.cerevisiae cellerna, odla dem över natten vid 30 grader Celsius med konstant agitation vid 150 RPM. Nästa dag, mäta den optiska densiteten vid 600 nanometer. Späd kulturen till en OD600 på ungefär 0,1 i 100 milliliter av YPD-medium.Växa upp cellerna tills OD600 är runt 0,8. Efter detta, mäta OD600 av S.pombe natten kultur. Späd ut denna kultur till en OD600 på ungefär 0,1 i 500 milliliter av YAS-medium och låt den växa upp tills OD600 är ungefär 0,8.Först bereda en ny lösning av två molar fyra-thiouracil. Håll den färdigberedda lösningen i rumstemperatur och skyddad från ljus. Tillsätt fyra-thiouracil lösningen till S.cerevisiae och S.pombe kulturer så att den slutliga koncentrationen är fem millimolar.Inkubera S.cerevisiae och S.pombe kulturer vid 30 grader Celsius och 32 grader Celsius respektive med konstant agitation i sex minuter. Efter detta, ta bort en liten alikvot av varje kultur och räkna cellerna med antingen en automatisk cellräknare eller en Neubauer kammare. Centrifugera vid 2, 500 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter för att samla in cellerna.Kassera supernatanten och tvätta cellerna med iskall en gång PBS. Centrifugera igen vid 2, 500 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter. Därefter återanvänder cellerna i fem milliliter iskall en gånger PBS.Blanda S.cerevisiae och S.pombe celler vid ett förhållande av tre till en. Centrifugera de blandade proverna vid 2, 500 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter. Ta sedan bort PBS och flash frysa cellerna i flytande kväve.Förvara provet vid negativa 80 grader Celsius tills det är klart att använda. När du är redo att fortsätta, tina cellerna på is i cirka 20 till 30 minuter. Använd en anpassad jäst RNA extraktion kit för att extrahera RNA som beskrivs i textprotokollet.Efter detta överför du filterpatronen till det slutliga uppsamlingsröret. Elute RNA med 50 mikroliter av DEPC-behandlat RNase-fritt vatten som förvärmdes till 100 grader Celsius. Centrifugera vid 16, 000 gånger g i en minut.Använd sedan 50 mikroliter av förvärmt DEPC-behandlat RNase-fritt vatten för att elutera RNA igen till samma rör. Centrifugera vid 16, 000 gånger g i en minut och se till att hela provvolymen har passerat genom filtret. Om det inte har, centrifug igen under en längre tid.När du är klar, kvantifiera och kontrollera renheten hos provet med hjälp av lämplig utrustning. Använd DEPC-behandlat nukleasfritt vatten för att justera koncentrationen av det tidigare förvärvade RNA till två milligram per milliliter. Aliquot 200 mikrogram totalt RNA och värma den på 60 grader Celsius i 10 minuter.Omedelbart kyla den på is i två minuter. Tillsätt 600 mikroliter av DEPC-behandlat RNase-fritt vatten. Tillsätt 100 mikroliter av biotinylation buffert och sedan lägga till 200 mikroliter av biotin HPDP.Om biotin-HPDP-lösningen fälls ut ur lösningen, öka volymen av DMSO eller DMF upp till 40%av reaktionsvolymen enligt beskrivning i textprotokollet. Skydda provet mot ljus och inkubera det i rumstemperatur med varsam agitation i tre timmar. Efter detta, tillsätt en ungefär lika stor volym av kloroform till rören och blanda kraftigt.Centrifugera vid 13, 000 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter. Därefter överför du försiktigt den övre fasen till nya två milliliterrör. Tillsätt en mängd av fem molarnatriumklorid som motsvarar ungefär 1/10 av provvolymen.Blanda sedan provet. Värm först det biotinylerade RNA vid 65 grader Celsius i 10 minuter. Kyl sedan proverna på is i fem minuter.Tillsätt 100 mikroliter streptavidinbelagda magnetiska pärlor till det biotinylerade RNA. Inkubera i rumstemperatur med lätt skakning i 90 minuter. Placera de kolonner som medföljer satsen i magnetstativ.Därefter lägger du till 900 mikroliter av rumstemperaturtvättbuffert till kolumnerna. Applicera 200 microliter-pärlan och RNA-blandningen på kolonnerna. Samla in genomströmningen i 1,5 milliliterrör och applicera det sedan igen på samma magnetiska kolonn.Håll detta genomflöde om det behövs eftersom det representerar den omärkta RNA-fraktionen. För att påbörja RT-qPCR validering av de olika fraktionerna, först syntetisera cDNA som beskrivs i texten. Förstärker sedan cDNA genom att i realtid qPCR med hjälp av ett standardprotokoll.De uppmätta nivåerna av avskrifter i fraktioner renas från vilda celler odlade med och utan fyra-thiouracil bekräftade detta förfarande renar specifikt märkt RNA. Analys av stammen av spt20 deltan visar att mängden av totalt steady-state RNA i stort sett är oförändrat eller endast reduceras milt för de testade generna. Liknande resultat ses för stammar som utgår för bre1.Analys av nyligen transkriberat RNA i spt20 delta stammen visar dock en tre till fem-faldig minskning av mRNA syntes för alla testade gener. Samtidigt leder förlusten av bre1 till en mer diskret men ändå synlig minskning. Vid inducible utarmning av spt7, en strukturell underenhet av saga komplexa, nyligen transkriberas mRNA nivåer minskas i en omfattning som liknar raderingsstammen.När de totala RNA-nivåerna mäts genomomfattande analys, endast ett fåtal gener anses ha sina uttrycksnivåer ändras vid radering av spt20 antingen genom upp reglering eller ner reglering. Analys av den nyligen transkriberas RNA visar dock att nivåerna av över 4, 000 gener minskas avsevärt minst tvåfaldigt vid radering av spt20 vilket tyder på en global positiv effekt av saga på RNA polymeras II transkription i knoppning jäst. Även om denna metod kan ge insikt i transkription i Saccharomyces cerevisiae, det tillämpades endast med små variationer till Genom att använda detta protokoll, vi kunde upptäcka en global minskning av mRNA syntes som kompenserades av en global minskning av mRNA nedbrytning.

Research

JoVE Journal

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7-RNA-polymeras-medierat multigenexpressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genomgående kartläggning av protein-DNA-interaktioner med ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Mäta mRNA nivåer över tid under den jäst S. cerevisiae hypoxisk svar

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliska märkning och profilering av överföring RNAs använder Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Halvkvantitativ detektion av RNA-beroende RNA-polymeras aktivitet av mänskliga telomeras omvänt transkriptas Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histon ändringar från Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodik för korrekt upptäckt av mitokondrie-DNA metylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Utvärdering av en Universal kapslad omvänd transkription polymerase kedje reaktion för detektion av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Konstgjorda RNA-polymeras II förlängning komplex för dissekera Co-transkriptionella RNA bearbetning händelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...