Name: crispr guide rna cloning for mammalian systems
Uploaded: 2018-10-02T12:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems at JoVE.com

Sathiji Nageshwaran поддерживается Наследственная атаксия Фридрейха исследования альянса (07340305 - 01) и национальных атаксии фонд стипендий (7355538-01). Алехандро Чавес финансировался в Национальный институт рака Грант 5T32CA009216-34 и Берроуз Уэллком фонд карьеры награды для ученых-медиков. Джордж м. Церковь поддерживается, США национальных институтов здравоохранения (НИЗ) национального человеческого генома научно-исследовательский институт Грант RM1 HG008525 и Институт Wyss биологически вдохновил инженерных. Джеймс Коллинз Дж. признает поддержку агентством по уменьшению угрозы обороне Грант HDTRA1-14-1-0006 и G. Пол Аллен границы группы. Алехандро Чавес разработал метод клонирования двойной гид. Sathiji Nageshwaran, Алехандро Чавес и Nan Шер ЕО написал рукопись с вводом от всех авторов.

<ol>
	<li>Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-crRNA+ribonucleoprotein+complex+mediates+specific+DNA+cleavage+for+adaptive+immunity+in+bacteria.">Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).</li><li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Programmable+Dual-RNA-Guided+DNA+Endonuclease+in+Adaptive+Bacterial+Immunity.">A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+genomics+using+CRISPR-Cas9.">High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming.">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li><li>Gilbert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Modular+RNA-Guided+Regulation+of+Transcription+in+Eukaryotes.">CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Directed+Genome+Editing+of+Cultured+Cells.">CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).</li><li>Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-Mediated+Targeted+Genome+Editing+in+Human+Cells.">CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).</li><li>Vidigal, J., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries.">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083 (2015).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).</li><li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR/Cas9+vector+system.">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Scientific Reports. 4 (1), (2014).</li><li>Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sgRNA+Scorer+2.0:+A+Species-Independent+Model+To+Predict+CRISPR/Cas9+Activity.">sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).</li><li>Doench, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).</li><li>Engler, C., Marillonnet, S., Valla, S., Lale, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golden+Gate+Cloning.">Golden Gate Cloning.</a> DNA Cloning and Assembly Methods. , 119-131 (2013).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+Is+a+Single+RNA-Guided+Endonuclease+of+a+Class+2+CRISPR-Cas+System.">Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li></ol>

Джордж м. Церковь имеет справедливости в Editas и карибу Biosciences, которые стремятся коммерциализировать ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генома редактирования технологии (полное раскрытие списка, см. http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).

Конструкции вектора выражения gRNA были внесены ряд изменений времени и экономии. Единый этапа ограничения и перевязка протокол изложен метод парных gRNA выражение вектор строительства. Парные gRNA выражение достигается за счет амплификации PCR используя олигонуклеотиды, содержащих последовательности целевого объекта вперед gRNA (№20) и обратный дополнения другой цели (№20). Это затем вводит промоутера вторичного РНК Pol III (7SK) а также sgRNA хвост в условно выражением единого gRNA выражение плазмид.
Тщательного олигонуклеотида дизайн обеспечит успешного PCR для парных gRNA строительства, а также липкой конце перевязки. После ограничения одноступенчатых и реакции перешнуровки, помимо дальнейшего BsmBI обеспечит что вырезать все неизмененные выражение векторов в реакции. Это значительно снизит фон после преобразования. С помощью НЭБ-Stable компетентным E. coli и роста на 30 ° C увеличит доходность успешных преобразований.
Преимущества, которые этот метод имеет над общей практики включают в себя упрощение процесса отжига, ограничение одноступенчатых gRNA вектора выражения и перевязка олигонуклеотиды, и способность использовать обычные олигонуклеотида векторы выражения одного gRNA для выражения парных гидов. В то время как протокол описанные здесь сосредоточена на наборе млекопитающих векторов, Общая стратегия пластика и применима к любой организм, условии доступен соответствующий gRNA вектор. В целом протокол, в описанный экономит время и затраты.
Следует, однако, отметить, что изложенные процедура приобретения отдельных олигонуклеотиды не масштабируется хорошо для создания библиотек, содержащих тысячи оформления. Для этих целей рекомендуется использовать альтернативные источники синтеза олигонуклеотида как oligo чип синтеза.
Это выгодно включить элемент управления без Вставка при клонировании оформления. Эта реакция может быть легко настроена параллельно с реакции интерес и может использоваться для определения, является ли неполное переваривание начальный вектор способствовала колоний, наблюдаемое в конце процедуры. Кроме того если один из вышеуказанных протоколов клонирования не удалось из-за неполностью переваренной вектор позвоночника или плохой перевязки эффективности, мы предлагаем попробовать альтернативный метод, который мы наметили клонирования.
При использовании клонирования одновременно дайджест вектор и перевязать в небольшой олигонуклеотиды в пределах одной реакции Золотые ворота, важно проверить, что gRNA, что клонируются в вектор не BsmBI сайт внутри него, как это приведет к t Он gRNA сокращаются и отсутствие колоний после преобразования.
Клонирование стратегия, которую мы наметили gRNA позволяет быстрое и экономически эффективным поколения оформления на ~ 10 долларов США за руководство, с основной объем расходов, исходя из синтеза олигонуклеотида и последовательность проверки. Хотя указывается метод предназначен чтобы позволить пользователям создавать оформления для использования с SpCas9, протокол может быть легко адаптирована для использования с Cas9 orthologues или других РНК руководствуясь эндонуклеазами, например Cpf1 или C2C2, с небольшими изменениями для векторных позвоночника и свес олигонуклеотида последовательности16,17.
Изложенные выше протокол будет обеспечивать проверку последовательности gRNA выражение плазмид в 3 d (начиная с надлежащим образом оформленные олигонуклеотидов), который значительно быстрее, чем нынешние методы. Это включает в себя дизайн gRNA 1 h (шаги 1-2.3), разбавление и Алиготе олигонуклеотиды 10 мин (шаги 3-5.1), пищеварения и очищения вектора выражения gRNA pSB700 2 h (шаги 6-6.4), клонирование gRNA олигонуклеотиды в предикаты предложенную pSB700 gRNA выражение вектора на ночь при комнатной температуре (шаги 7-7.3), лигирование ограничение BsmBI сингл шаг 3 ч. и 40 мин (шаги 8-8.4), преобразование 16 h (шаги 9-9,6) и проверки последовательности gRNA выражение плазмиды 24 ч (при продолжительности в зависимости от доступности последовательности Сэнгер и скорость после представления бактериальные колонии; шаг 10). Парные gRNA дизайн и изменения последовательности занимает 1 час (шаги 11-13). Парные gRNA ПЦР занимает 3.5 h (шаги 14-14.4). Клонирование PCR фрагмента в вектор pSB700 занимает 3 ч. и 40 мин (шаг 15-16).
Скорее всего проблемы, которые могут столкнуться с настоящим Протоколом относятся к неэффективности в Ассамблее Золотые ворота и трансформации. Включать элемент управления без вставка во время Ассамблеи Золотые ворота для визуализации эффективности Ассамблеи. Во время преобразования puc19 положительный контроль обеспечит контроль эффективности преобразования. НЭБ-Stable E. coli должен использоваться для лентивирусные совместимый плазмидов и часто требуют до > 16 h 30 ° c для получения видимых колоний.

ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) является РНК руководствуясь эндонуклеазы, которая направлена на желаемому геномной когда complexed с надлежащим образом оформленные небольшое руководство РНК (gRNA)1,2. Оформления составляют 20-нуклеотидной последовательности (protospacer), который дополняет геномные последовательности. Рядом с геномной целевой последовательности является 3' protospacer связанные мотив (PAM), которая требуется для привязки Cas9. В случае Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), это имеет последовательность NGG. После привязки целевого ДНК, Cas9 отщепляет обе нити ДНК, тем самым стимулируя ремонт механизмов, которые могут быть использованы для изменения Локус интерес. Активации ошибкам non гомологичных прихода в конце пути (NHEJ) может привести к срыву целевого гена. Кроме того ремонт сделал через гомологичная рекомбинация может стимулировать целенаправленной интеграции желаемой последовательности ДНК если шаблон доноров предоставляется6. Нуклеаза Мертвого Cas9 варианты (dCas9) также может быть сгенерированный3 , мутирует остатков в Cas9, которые необходимы для endonucleolytic деятельности. dCas9 остается компетентным для связывания ДНК, но не режет его связанного целевого объекта. Фьюзинг различных эффекторных домены dCas9 и направляя его вблизи гена transcriptional стартовый сайт, dCas9 может использоваться для выборочного гена индукции или частичной гена, глушителей4,5.
В то время, как это невероятно мощный, возможность использования Cas9 целевой геномные последовательности интерес требует, что пользователь сначала генерирует gRNA уникальный для целевого сайта. Различные методы для создания gRNA векторы выражения ранее были описаны многие из различной эффективности и стоимость6,,78. Автономные ампликонов ПЦР может использоваться в качестве оформления для быстрого скрининга, идя от олигонуклеотида доставки трансфекции в течение нескольких часов; Однако, это требует Ultramer (более 100 bp) oligo синтеза, который является дорогим9. Это также можно купить gBlocks, которые являются более рентабельными, чем Ultramers. Как Cas9 быстро стал неотъемлемой частью современной молекулярной биологии инструментарий, простой, недорогой и очень эффективный метод для клонирования gRNA бы благом для поля. В нашей группе и сотрудничающих лабораторий за последние несколько лет для создания более 2000 уникальных оформления4использовался метод, описанный здесь.
Указывается метод фокусируется на методах для клонирования, лентивирусные совместимый векторов, содержащий один gRNA или самое большее два оформления. Для поколения плазмид, содержащие более двух оформления, или клонировать библиотеку оформления,9,10,,1112рекомендуются альтернативные подходы.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Enzymatic/New England Biolabs</td>
			<td>L6030-LC-L/M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 3.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C3019l, C2987l, or C3040H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 8-Strip PCR tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-222-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler with programmable temperature-stepping control</td>
			<td>BioRad,</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB700 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#64046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>c3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr guide rna cloning for mammalian systems

Изложил протокол описывает упрощенные методы для эффективного и экономичного поколения Cas9-связанные руководство РНК. Две альтернативные стратегии для клонирования руководство РНК (gRNA) изложены, основанные на использовании энзима ограничения типа IIS BsmBI в сочетании с набором совместимых векторов. За пределами доступ к Сэнгер последовательности услуг для проверки созданного векторов помимо тех, которые являются стандартными в современной молекулярной биологии лаборатории требуются никакого специального оборудования или реагентов. Изложил метод предназначен прежде всего для клонирования одного единого gRNA или одной паре gRNA выражая вектора одновременно. Эта процедура не масштабируется для создания библиотек, содержащих тысячи оформления. Для этих целей рекомендуется использовать альтернативные источники синтеза олигонуклеотида как синтез oligo чип. Наконец в то время как этот протокол фокусируется на набор векторов, млекопитающих, Общая стратегия пластика и применима к любой организм, при наличии соответствующей gRNA вектор.

Методы, изложенные в настоящем Протоколе, для создания векторов выражения либо единого или парные gRNA. Одноместный gRNA, выражая вектора могут быть созданы либо predigesting вектор позвоночника (рис. 1) следуют безлигатурные в серии коротких олигонуклеотиды или с помощью клонирования одновременно дайджест вектор позвоночника и перевязать его в Золотые ворота Серия коротких олигонуклеотиды в одном реакции. Также это метод производства векторов, которые содержат 2 оформления, каждый свой собственный независимый промоутер, движимый клонирование фрагмента пользовательский ПЦР (рис. 2).
Успешное клонирование для любого из намеченных протоколов приведет к внешний вид значительно больше колоний для преобразований с соответствующим Вставка ДНК чем на пластину без вставить элемент управления (рис. 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig1.jpg"> Рисунок 1: пищеварение вектора выражения gRNA pSB700. гель агарозы 1% используется. Переулок 1: режиссерский pSB700. Участок 2: pSB700 вырезать с BsmBI.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig2.jpg"> Рисунок 2: Парные gRNA ПЦР. гель агарозы 1% используется. Переулок 1: ПЦР фрагмент ~ 490 парных руководство bp.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig3.jpg"> Рисунок 3: успешное клонирование и трансформация gRNA плазмида. Левая панель показывает LB и ампициллин пластины с успешно преобразован колоний. Правая панель показывает без Вставка управления пластины, показаны не колоний. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57998/57998fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>pSB700 руководство выражение вектор</td>
			<td>1-5 мкг</td>
		</tr>
<tr>
<td>НЭБ буфер 3.1</td>
			<td>4 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI</td>
			<td>1 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Дистиллированная вода</td>
			<td>до 40 мкл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>40 МКЛ</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Пищеварение ограничения вектора выражения gRNA pSB700 с BsmBI.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Отожженная gRNA oligos (одинарные или пуле реакции)</td>
			<td>1 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI усваивается pSB700 руководстве выражение вектор</td>
			<td>1 мкл (~ 100-250 нг)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x T4 ДНК лигаза реакции буфера</td>
			<td>2 мкл (1 x конечная концентрация)</td>
		</tr>
<tr>
<td>T4 ДНК лигаза</td>
			<td>1 мкл (120 шт.)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Дистиллированная вода</td>
			<td>15 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>20 мкл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Перевязка реакция gRNA олигонуклеотиды в вектор выражения gRNA predigested pSB700.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Реагент</td>
			<td>Объем (1 x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>6 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Лигаза T4</td>
			<td>0.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP</td>
			<td>1 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI</td>
			<td>0.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>НЭБ буфер 3.1</td>
			<td>1 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вектор (например, pSB700) (40 фмоль)</td>
			<td>1 μlL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вставка - вперед и обратить вспять oligos или ПЦР-фрагмент для двойной руководство (40fmol)</td>
			<td>1 мкл (0.5 мкл вперед и обратного 0.5 мкл)</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3: Один шаг BsmBI ограничения и реакции перешнуровки gRNA mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Для 1 гид</td>
			<td>последовательность 3 колоний</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 направляющих</td>
			<td>последовательность 5-10 колоний</td>
		</tr>
<tr>
<td>Для 3 руководства</td>
			<td>последовательность колоний 10-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Для 4 направляющих</td>
			<td>последовательность колоний 15-20</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: Рекомендуемое количество колоний в последовательность для объединения gRNA клонирования реакций.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ПЦР компонент</td>
			<td>Реакция 50 мкл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 мкм вперед грунт</td>
			<td>2.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Обратный Primer 10 мкм</td>
			<td>2.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x Phusion ВЧ или GC буфера</td>
			<td>10 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>дНТФ 10 мм</td>
			<td>1 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаблон ДНК</td>
			<td>100 нг</td>
		</tr>
<tr>
<td>ДНК-полимераза Phusion</td>
			<td>0.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нуклеаза свободной воды</td>
			<td>До 50 мкл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 5: Парные gRNA ПЦР смесь.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems at JoVE.com

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems (Video) | JoVE

Здесь приводится простой, эффективной и экономически эффективным методом sgRNA клонирования.

ТРИФОСФАТЫ руководство РНК клонирования млекопитающих систем

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Этот метод позволяет легко создавать направляющий РНК-плазмиды для экспериментов с поддержкой CRISPR. Основным преимуществом этого метода является то, что клонирование может быть осуществлено в один шаг и в паре руководство РНК могут быть созданы с помощью одного руководства РНК выражения плазмидов. Чтобы начать этот протокол, разбавить лиофилизированные грунтовки в буфере 1X TE до конечной концентрации 100 микромолелей.Aliquot равное количество вперед и обратно грунтовки в ПЦР полосы крышка труб. Вихрь смешивать. Далее, спина вниз руководство РНК олигонуклеотидных смесей в 100 раз G в течение 15 секунд.Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение пяти минут, прежде чем создать перевязку. Добавьте от одного до пяти микрограммов выбранного вектора экспрессии PSB700 в BSNB1 с использованием 0,5 микролитров BSNB1 на один микрограмм вектора. Добавьте дистиллированную воду до тех пор, пока общий объем не составит 40 микролитров, и проведем пищеварение в течение одного часа при 55 градусах Цельсия.Вы запустите продукты пищеварения на 1,5%низкий плавления агарозы гель. Вырежьте переваренную векторную позвоночниковую полосу, которая соответствует фрагменту размером примерно 9 килобазы. Перенесите этот ломтик геля в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку.Используя коммерческий набор для очистки геля, извлекайте ДНК из агарозного геля в соответствии с инструкциями производителя. Затем разбавьте ДНК в 10-15 микролитров буфера TE, чтобы получить концентрированный элют. При готовности к проведению перевязки добавьте в флакон 15 микролитров дистиллированной воды.Добавьте 1 микролитер ранее анналированного руководства РНК-олигонуклеотидов, один микролитер переваренного вектора экспрессии PSB700 BSNB1 и 2 микролитров буфера реакции лигозы ДНК 10XT4. Затем смешайте это решение с вихрем. Добавьте один микролитер лигозы ДНК и вихря снова.Спин вниз раствор в 100 раз G в течение 15 секунд. Инкубировать реакции при комнатной температуре в течение ночи убедившись, что включить не вставить негативную реакцию контроля, который имеет BSNB1 переваривается вектор в одиночку без аннелированного руководства РНК олигот вставки. Для начала удалите E.coli из хранилища при температуре минус 80 градусов по Цельсию и оттаивать его на льду в течение 5-10 минут.Добавьте 0,5 микролитров подготовленной реакционной смеси к восьми микролитров компетентного E.coli. Держите смесь на льду в течение 30 минут. Тепло-шок смеси при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 45 секунд.Затем дайте смеси отдохнуть на льду в течение двух минут. Используя роторный шейкер, восстановить культуру в 250 микролитров SOC средств массовой информации, используя условия, перечисленные здесь для NEB DH5a или NEB конюшни. После этого пластина 80 микролитров культуры на соответствующей устойчивости к антибиотикам лизогенной бульонной пластины.Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию для NEB DH5a или при 30 градусах по Цельсию для НЭБ конюшни. Для начала используйте специальный протокол PHusion GC для создания необходимого фрагмента, изложенного в текстовом протоколе. Запустите этот продукт ПЦР на 1%agarose гель и убедитесь, что одна полоса рассматривается примерно в 490 базовых пар.Использование гель извлечения комплект вырезать и извлечь этот продукт ПЦР. Затем aliquot подготовленный 1X мастер смесь в ПЦР труб. Использование многоканарной пипетки для добавления одного микролитров продукта ПЦР при концентрации 40 фемтомолов на микролитр.В одном микролитре вектора PSB700 добавляют концентрацию 40 фемтомолов на микролитер. Включите не вставить контроль с помощью одного микролитер воды вместо руководства РНК олигонуклеотидов. Дайджест вектора и ligate вставки в одной реакции с помощью протокола Золотые Ворота, изложенные в текстовом протоколе.После первоначальной реакции золотых ворот добавьте к каждой реакции дополнительные 0,5 микролитров фермента BSNB1. Продолжить реакцию при 55 градусах по Цельсию в течение одного часа. Когда реакция золотых ворот будет завершена, переходите к ранее описанной процедуре трансформации E.coli.В этом исследовании с помощью двух методов успешно создаются векторы экспрессии РНК-руководства. В первом методе векторный костяк предварительно переваривается и перевязивается в серии коротких олигонуклеотидов. Второй метод использовал клонирование золотых ворот для одновременного переваривания и лигата в одной реакции.Парное руководство РНК, выражаю которое выражает векторы, каждый из которых управляется собственным независимым промоутером, успешно создается путем клонирования пользовательского фрагмента ПЦР. Успешное клонирование для любого из этих методов приведет к появлению значительно больше колоний для преобразований с соответствующей вставкой ДНК по сравнению с не вставить контрольную пластину. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы включить не вставить элементы управления в шаг клонирования.После этой процедуры, другие методы, такие как эпигеном инженерии могут быть выполнены для того, чтобы ответить на вопросы, как то, что последствия хроматина подписи имеют на экспрессию генов.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

Biotechnology

SCIENTISTS IN ACTION

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen (Video) | JoVE

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus (Video) | JoVE

Первичных зародышевых клеток Трансплантация для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-основе скачка в Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure (Video) | JoVE

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing (Video) | JoVE

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR (Video) | JoVE

Настраиваемый протокол для строки Ассамблеи gRNA клонирование (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas (Video) | JoVE

Геном редактирование в Mammalian клеток линии, используя ТРИФОСФАТЫ-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events (Video) | JoVE

Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...