Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

ونحن نشكر المركز الوطني للعلوم البروتين وبكين (جامعة بكين) ومركز بكين تسينغهوا "منصة الحوسبة علوم الحياة". هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2015CB942800) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (31521004 و 31471358 و 31522036)، وتمويل من مركز بكين تسينغهوا لعلوم الحياة إلى جيم-R.X.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة بكين.
1-البنكرياس العزلة
<ol><li>
للأجنة E17.5 (17.5 يوما الجنينية):
	<ol>
<li>ويقدر اليوم الجنينية 0.5 استناداً إلى النقطة الزمنية عندما يظهر المكونات المهبلية.</li>
		<li>التضحية الفئران ال?...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

وفي هذا البروتوكول، أثبتنا طريقة فعالة وسهلة الاستخدام لدراسة ملامح التعبير خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس. يمكن استخدام هذا الأسلوب لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة والقيام بالتحاليل ترانسكريبتوميك خلية واحدة.
أن الخطو?...

البنكرياس جهاز الأيض حيوي في الثدييات. يتكون البنكرياس من المقصورات، وافرازات الغدد الصماء. خلايا الغدد الصماء البنكرياس، بما في ذلك خلايا بيتا المنتجة للأنسولين وإنتاج الجلوكاجون خلايا α، المجموعة معا في جزر لانجرهانز وكورديناتيلي تنظيم التوازن الجلوكوز الجهازية. ويؤدي الخلل في خلايا الغدد الصماء مرض البول السكري، الذي أصبح مشكلة صحية عامة رئيسية في جميع أنحاء العالم.
يتم اشتقاق خلايا الغدد الصماء في البنكرياس من Ngn3+ فروعه خلال embryogenesis1. في وقت لاحق، خلال فترة ما حول الولادة، تتكاثر خلايا الغدد الصماء بشكل غير ناضجة الجزر الصغيرة. هذه الخلايا غير ناضجة مواصلة تطوير وتدريجيا تصبح جزيرات الناضجة، التي تصبح الغني vascularized لتنظيم التوازن الجلوكوز في الدم في البالغين2.
على الرغم من أن قد حددت مجموعة من العوامل النسخي التي تنظم تمايز الخلايا β، مسار نضج الدقيق لخلايا بيتا لا يزال غير واضح. وعلاوة على ذلك، عملية نضج خلية بيتا ينطوي أيضا على تنظيم توسيع الخلية رقم3،4 وتوليد التغايرية الخلوية5،6. ومع ذلك، لم تدرس جيدا الآليات التنظيمية لهذه العمليات.
خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي هو نهج قوية يمكن الشخصية الفئات السكانية الفرعية الخلية وتتبع الخلية النسب المسارات الإنمائية7. الاستفادة من هذه التكنولوجيا، مفتاح يمكن فك شفرتها الأحداث التي تحدث أثناء تطوير جزيرة البنكرياس في خلية واحدة مستوى8. بين البروتوكولات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، يسمح الذكية-seq2 جيل كامل طول كدنا مع تحسين حساسية ودقة، واستخدام الكواشف القياسية في انخفاض تكلفة9. ذكية-seq2 يستغرق يومين تقريبا لبناء مكتبة كدنا للتسلسل10.
هنا، نحن نقترح أسلوب لعزل الخلايا β المسمى الأسفار من البنكرياس للجنين للكبار Ins1-RFP الفئران المعدلة وراثيا11، استخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، ويحلل أداء ترانسكريبتوميك في مستوى خلية واحدة، باستخدام التكنولوجيا الذكية-seq2 (الشكل 1). ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل ترانسكريبتوميس لجميع أنواع خلايا الغدد الصماء في البنكرياس في الدول العادية والمرضية والشيخوخة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

خلايا الغدد الصماء البنكرياس، التي تتجمع في الجزر الصغيرة، تنظيم استقرار الجلوكوز في الدم والايض الطاقة. تختلف أنواع الخلايا متميزة في الجزر الصغيرة، بما في ذلك إفراز الأنسولين خلايا بيتا، من أجداد الغدد الصماء شيوعاً أثناء المرحلة الجنينية. توسيع عن طريق انتشار الخلايا غير ناضجة من خلايا الغدد الصماء وتنضج خلال فترة إنمائية طويلة بعد الولادة. ومع ذلك، أن الآليات الكامنة وراء هذه العمليات غير محددة بوضوح. خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي نهجاً واعداً لتوصيف السكان خلية متميزة وتتبع الخلية النسب تمايز المسارات. هنا، يمكننا وصف أسلوب للجيش الملكي النيبالي-تسلسل خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس معزولة في البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة.

تم تشريح البنكرياس من الفئران الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة (الشكل 2A و 2 باء). يعتمد تأثير الجهاز الهضمي للفئران الأقدم من يوم الولادة 18، على درجة التروية؛ ولذلك، الحقن هو أهم خطوة لعزله جزيرة ليلى (الشكل 2<str...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

يصف لنا طريقة لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة، تليها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يسمح هذا الأسلوب بتحليل التنمية النسب الغدد الصماء في البنكرياس، خلية ديناميات عدم التجانس وترانسكريبتوميك.

تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

يمكن أن يكون هذا الأسلوب الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقل جزيرة البنكرياس حول تمايز نسب الجزر البنكرياسية, النضج, والتجدد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لجمع خلايا الجزر البنكرياسية واحدة لتوليد عالية الجودة خلية واحدة RNA تسلسل البيانات. تطبيق هذه التقنية تمتد نحو علاج مرض السكري وغيرها من الأمراض المرتبطة الغدد الصماء البنكرياس من خلال تحليل النسخ للخلايا الغدد الصماء البنكرياس واحد على الظروف المرضية.مظاهرة بصرية من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن يكون إدخال الإبرة في القناة الصفراوية الضيقة من البنكرياس لضخ الضخ صعبة. لليوم الجنيني 17.5 أجنة. بعد فتح تجويف البطن، واستخدام ملاقط الكوع لنقل الأنسجة الحشوية إلى طبق أسفل أسود ستة سنتيمترات تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.استخدم ملقط لفصل البنكرياس عن الأنسجة الحشوية. ووضع أنسجة البنكرياس في قارورة 20 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلترات من محلول الكولاجيناز البارد. بالنسبة ليوم ما بعد الولادة صفر إلى 15 فأرًا ، قم بتشريح جميع فصوص البنكرياس بعناية قبل وضع الأنسجة في الكولاجيناز.بالنسبة ليوم ما بعد الولادة من 18 إلى 60 فأرًا ، قم أولاً بإزالة الـ xiphoid واستخرج الأمعاء إلى الجانب الأيمن من تجويف البطن. دفع الفصوص الوسطية اليسرى والأينية للكبد إلى كل جانب لفضح المرارة والقناة الصفراوية المشتركة. ومشبك الاثني مع زوج من المشابك السفينة الصغيرة في المواقف العليا والسفلى لجناح الموقع حيث القناة الصفراوية يدخل الاثنيثان.بعد ذلك، قم بتحميل حقنة 5 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 30 مع محلول الكولاجيناز البارد. واستخدم المجهر لإدخال طرف الإبرة في المرارة. بعناية وسلاسة التعامل مع الإبرة من خلال القناة الصفراوية المشتركة.والاكتئاب المكبس لضخ البنكرياس مع 1-5 ملليلتر من الحل الكولاجيناز وفقا لحجم الماوس. عندما تم perfused كل من الحل، واستخدام ملقط لنقل البنكرياس على الفور إلى قارورة 20 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول الكولاجيناز الباردة الطازجة. عندما يتم جمع جميع أنسجة البنكرياس، ضع القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق، تليها ثلاث إلى خمس دقائق من الاهتزاز اللطيف.ثم تصفية المنتج المهضم من خلال مصفاة نايلون 0.25 ملليمتر في أنبوب جديد من أجهزة الطرد المركزي 50 ملليلتر. واستخدم حقنة 20 ملليلتر تحتوي على الثلج البارد PBS لغسل مصفاة جيدا. لليوم ما بعد الولادة 18 إلى 60 pancreata، الطرد المركزي العينة المصفاة وإعادة تعليق الأنسجة في 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة.ثم decant تعليق الأنسجة في طبق أسفل أسود ستة سنتيمترات، واستخدام ماصة 200 ميكرولتر والمجهر تشريح لاختيار الجزر لنقلها إلى أنبوب microcenter 1.5 ملليلتر التي تحتوي على حجم صغير من برنامج تلفزيوني الباردة. ليوم الجنينية 17.5 بعد الولادة يوم 15 pancreata, الطرد المركزي أنسجة البنكرياس المصفاة وإعادة تعليق بيليه في محلول تريبسين-EDTA لاحتضان أربع دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، حاول بلطف تقييم بيليه لمدة دقيقة واحدة مع ماصة 200 ميكرولتر ، تليها إضافة 0.5 مرة حجم مصل البقرة الجنينية الباردة مع دوامة لطيف لوقف الهضم.ثم جمع خلاصة عن طريق الطرد المركزي و resuspend الخلايا في 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS في أنبوب FACS 5 ملليلتر للفرز عن طريق تدفق الخلايا. لقطف خلية واحدة وتحلل، aliquot أعدت حديثا العازلة خلية تحلل في ثمانية أنابيب PCR الشريط، ونقل خلية واحدة في كل. دوامة العينات لlyse الخلايا لإطلاق الجيش الملكي النيبالي، تليها الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية، والتخزين الفوري على الجليد.للنسخ العكسي، احتضان ال ليسات لمدة ثلاث دقائق في 72 درجة مئوية تليها دقيقة واحدة على الجليد. لفترة وجيزة الطرد المركزي العينات لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية وإضافة 5.7 ميكرولترات من مزيج النسخ العكسي إلى كل عينة ليصل الحجم الإجمالي إلى 10 ميكرولترات لكل عينة. بعد دوامة لطيف والطرد المركزي، تحميل العينات في ثيرسيكلر والبدء في برنامج النسخ العكسي.بالنسبة لـ البوليميراز المتسلسل، أو PCR، أضف 15 ميكرولترات من مزيج PCR إلى كل عينة تحتوي على ردود الفعل الأولى، تليها دوامة لطيف والطرد المركزي. ثم تحميل العينات في thermocycler وبدء تشغيل برنامج PCR. لتنقية PCR، إضافة 25 ميكرولترات من حبات تنقية الحمض النووي resuspended إلى كل عينة، ومزيج جيد من خلال دوامة.ثم تدور بسرعة العينات في درجة حرارة الغرفة لجمع السائل مع تجنب تسوية الخرز. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع العينات على حامل مغناطيسي مناسب، وإزالة بعناية والتخلص من المابير عندما يكون الحل واضحًا. غسل الخرز مع اثنين من 30 ثانية يغسل في 200 ميكرولتر من الطازجة أعدت 80٪ الإيثانول لكل غسل.والتخلص من الإيثانول المتبقي بعد الغسيل الثاني. عندما يكون الخرز قد جفت الهواء، إضافة 11 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى ل elute هدف الحمض النووي من الخرز، تليها دوامة. ثم بسرعة الطرد المركزي العينات، والعودة العينات إلى موقف مغناطيسي حتى الحل واضح ونقل 10 ميكرولترات من كل عينة إلى أنبوب PCR جديد.وينبغي أن يكون لـ cDNA المكبرة بنجاح طول كامل فوق 500 زوج أساسي، وأن يثري من 1.5 إلى 2 كيلو من أزواج القاعدة. وعلاوة على ذلك، هناك عادة 500 إلى 600 إثراء زوج قاعدة من cDNA لوحظ في الأنسولين واحد RFP بالإضافة إلى الخلايا، والتي قد تمثل نصوص الأنسولين. ومع ذلك، فإن شظايا cDNA بالقرب من 100 زوج أساسي هي خافضات التمهيدي، والتي عادة ما تكون ناجمة عن التمهيديات الزائدة والتي يجب إزالتها عن طريق تكرار خطوة تنقية الحمض النووي.عادةً ما تمثل أجزاء cDNA بين أزواج قاعدة 100 و500 cDNA المتدهورة، والتي تسببها حالة الخلية أو مشاكل المنطقة السيئة، مثل التلوث RNase وينبغي استبعاد. بعد تنقية مكتبات cDNA للتسلسل ، يمكن الحصول على cDNA تتراوح بين 250 إلى 450 زوجًا أساسيًا من خلال إضافة حبات تنقية الحمض النووي إلى الجولتين الأولى والثانية من التنقية. بعد تنقية حبة الحمض النووي، يجب أن تكون نقاط جودة التسلسل أكبر من 30 خلال تقييم جودة التسلسل.للحصول على خلايا عالية الجودة لتحليلات المصب ، يتم استبعاد الخلايا التي يقل عددها عن 0.5 مليون قراءة أو مع أقل من 4000 جين تم اكتشافها ، مما يسهل توصيف مجموعات مختلفة من الخلايا وتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل غير متجانس في مجموعات مختلفة بعد تحليل المكونات الرئيسية والتجميع الهرمي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تضخ البنكرياس بسرعة قبل هضم الكولاجين لتجنب الجزر على الهضم والحفاظ على البيئة الحرة RNase أثناء إجراءات الخلية الواحدة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التصوير الجزري والثقافة لتسهيل التصور من هيكل جزيرة ودراسة الاستجابات الخلوية وتحفيز المخدرات.بعد التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث البنكرياس لاستكشاف آليات تطوير سلالة الجزر وتجديدها، فضلا عن تطور مرض السكري في الثدييات.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; البنكرياس أسلاف

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...