Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Vi takker det nationale Center for Protein videnskaber, Beijing (Peking University) og Peking-Tsinghua Center for Life Science Computing Platform. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for videnskab og teknologi i Kina (2015CB942800), National Natural Science Foundation of China (31521004, 31471358 og 31522036) og støtte fra Peking-Tsinghua Center for Life Sciences til C.-R.X.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Peking Universitet.
1. bugspytkirtlen Isolation
<ol><li>
For E17.5 (embryonale dag 17,5) embryoner:
	<ol>
<li>Anslå embryonale dag 0,5 baseret på tidspunkt, da skeden stikket vises.</li>
		<li>Ofre de gravide mus af CO2 administration. Spray den abdominale pels med 70% alkohol.</li>
		<li>Lave en V-formet snit med en saks fra den genitale område strækker sig ...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

I denne protokol demonstrerede vi en effektiv og nem at bruge metode til at studere encellede udtrykket profiler af pancreas β celler. Denne metode kan bruges til at isolere endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal bugspytkirtel og udføre encellede transkriptom analyser.
Den mest kritiske trin er isolering af enkelt β celler i god stand. Fuldt perfunderet bugspytkirtel reagerer bedre på efterfølgende fordøjelsen. Utilstrækkelig perfusion, som normalt opstår i den dorsale ...

Bugspytkirtlen er en vitale metaboliske organ i pattedyr. Bugspytkirtlen er sammensat af endokrine og eksokrine rum. Pancreas endokrine celler, herunder insulin-producerende β celler og glukagon-producerende α celler, klynge sammen i Holme i Langerhanske og regulere coordinately systemisk glukose homøostase. Dysfunktion af endokrine celler resultater i diabetes mellitus, som er blevet et stort folkesundhedsproblem på verdensplan.
Pancreas endokrine celler er afledt af Ngn3+ progenitorceller under embryogenese1. Senere, i den perinatale periode, de endokrine celler formere sig til form umodne Holme. Disse umodne celler vedbliver med at udvikle og efterhånden modne Holme, som bliver rigt vaskulariserede for at regulere blod glukose homøostase i voksne2.
Selv om en gruppe af transcriptional faktorer er blevet identificeret som regulerer β Celledifferentiering, er præcise modning pathway af β-celler stadig uklart. Β celle modning processen indebærer endvidere også reguleringen af celle nummer ekspansion3,4 og generation af cellulære heterogenitet5,6. Dog har reguleringsmekanismer af disse processer ikke været godt undersøgt.
Encellede RNA-sekventering er en kraftfuld tilgang, der kan profilere celle delpopulationer og spore celle lineage udviklingsmæssige veje7. Drage fordel af denne teknologi, nøglen hændelser, der opstår under pancreas islet udvikling kan være tydet på én celle niveau8. Blandt de encellede RNA-sekventering protokoller, Smart-seq2 giver mulighed for generation af fuld længde cDNA med forbedret følsomhed og nøjagtighed, og brugen af referencereagenser på lavere omkostninger9. Smart-seq2 tager ca. to dage til at konstruere en cDNA bibliotek for sekventering10.
Her foreslår vi en metode til isolering af fluorescens-mærket β celler fra bugspytkirtel af føtal til voksen Ins1-RFP Transgene mus11, ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), og udførelsen af transkriptom analyserer på den encellede niveau, ved hjælp af Smart-seq2 teknologi (figur 1). Denne protokol kan udvides til at analysere transcriptomes af alle i bugspytkirtlen endokrine celletyper i aging, normale og patologiske stater.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

Pancreas endokrine celler, der er grupperet i Holme, regulere blod glucose stabilitet og energimetabolisme. De forskellige celletyper i Holme, herunder insulin-secernerende β celler, er adskilt fra fælles endokrine stamfaderen under fosterstadiet. Umodne endokrine celler udvide via celleproliferation og modne i en lang postnatal udviklingsmæssige periode. Mekanismerne bag disse processer er imidlertid ikke klart defineret. Encellede RNA-sekventering er en lovende tilgang til karakterisering af forskellige cellepopulationer og spore celle lineage differentiering veje. Her, beskriver vi en metode til enkelt celle RNA-sekventering af isolerede pancreas β celler fra embryonale, neonatal og postnatal bugspytkirtel.

Bugspytkirtel var dissekeret fra embryonale, neonatal og postnatal mus (figur 2A og 2B). For mus ældre end postnatal dag 18 afhænger fordøjelsesfremmende effekt af graden af perfusion; injektionen er derfor det vigtigste skridt for Holmen isolation (figur 2 c-2E og tabel 6). Så meget collagenase blev sprøjtet som det var muligt at fylde bugspytkirtlen under...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Vi beskriver en metode til isolering af endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal bugspytkirtel efterfulgt af encellede RNA sekventering. Denne metode giver mulighed for analyser af pancreas endokrine lineage udvikling, celle heterogenitet og transkriptom dynamik.

Encellede transkriptom analyser af mus i bugspytkirtlen endokrine celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Denne metode kan have besvare vigtige spørgsmål i bugspytkirtlen øen feltet om pancreas ø afstamning differentiering, modning, og regenerering. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for indsamling af enkelt pancreas ø-celler til generering af høj kvalitet enkelt celle RNA sekventering data. Anvendelsen af denne teknik strækker sig mod behandling af diabetes og de andre pancreas endokrine relaterede sygdomme gennem transskriptionomic analyse af pancreas endokrine enkelt celler på de patologiske betingelser.Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da indsættelsen af nålen i den smalle galdegang i bugspytkirtlen for perfusion kan være vanskelig. Til embryonale dag 17,5 embryoner. Efter åbning af bughulen, bruge albue pincet til at overføre det viscerale væv til en seks centimeter sort bund fad indeholder koldt PBS.Brug vices til at frigøre bugspytkirtlen fra det viscerale væv. Og placere pancreas væv i en 20 milliliter hætteglas, der indeholder fem milliliter kold kollagenase opløsning. For post natal dag nul til 15 mus, omhyggeligt dissekere alle lapper i bugspytkirtlen, før du placerer vævet i kollagenase.For post natal dag 18 til 60 mus, først fjerne xiphoid og udtrække tarmen til højre side af bughulen. Skub venstre og højre mediale lapper i leveren til hver side for at afsløre galdeblæren og den fælles galdegang. Og klem duodenum med et par små karklemmer på de øverste og nederste positioner for at flankere det sted, hvor galdegangen kommer ind i duodenum.Dernæst indlæses en 5 milliliter sprøjte udstyret med en 30 gauge nål med kold kollagenase opløsning. Og brug mikroskopet til at sætte nålespidsen ind i galdeblæren. Omhyggeligt og glat manipulere nålen gennem den fælles galdegang.Og tryk stemplet til at gennemgå bugspytkirtlen med en til fem milliliter af kollagen løsning i henhold til størrelsen af musen. Når hele opløsningen er perfunderet, skal der anvendes vicesfer til straks at overføre bugspytkirtlen til et 20 milliliterhætteglas indeholdende fem milliliter frisk kold kollagenopløsning. Når alle de pancreas væv er blevet indsamlet, placere hætteglasset i en 37 grader Celsius vandbad i tre minutter, efterfulgt af tre til fem minutters blid rystelser.Derefter filtreres det fordøjede produkt gennem en 0,25 millimeter nylons si i et nyt 50 milliliter centrifugerør. Og brug en 20 milliliter sprøjte indeholdende iskold PBS til grundigt at vaske sitaren. For post natal dag 18 til 60 pancreata, centrifuge den filtrerede prøve og resuspendre vævet i 30 milliliter koldt PBS.Derefter dekantere væv suspension i en seks centimeter sort bund parabol, og bruge en 200 mikroliter pipette og en dissekere mikroskop til at plukke holmene til overførsel i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør, der indeholder en lille mængde af kolde PBS. For embryonale dag 17,5 post natal dag 15 bugspytkirtel, centrifuge den filtrerede pancreas væv og resuspend pellet i trypsin-EDTA løsning til en fire minutters inkubation i en 37 grader Celsius vandbad. Ved inkubationens afslutning skal du forsigtigt forsøge at vurdere pellet i et minut med en 200 mikroliterpipette efterfulgt af tilsætning af 0,5 gange mængden af koldt føtal kvægserum med en blid vortexing for at stoppe fordøjelsen.Derefter opsamler fordøjet ved centrifugering og opslæmmes cellerne i 200 mikroliter af FACS-buffer i et 5 milliliter FACS-rør til sortering efter flowcytometri. For enkeltcelleplukning og lysis, aliquot frisklavet celle lysis buffer i otte strimler PCR rør, og overføre en enkelt celle i hver. Vortex prøverne til lyse cellerne til frigivelse af RNA, efterfulgt af centrifugering i 30 sekunder ved fire grader Celsius, og øjeblikkelig opbevaring på is.For omvendt transskription, inkubere lysates i tre minutter ved 72 grader Celsius efterfulgt af et minut på is. Prøvne centrifugeres kortvarigt i 30 sekunder ved fire grader Celsius, og der tilsættes 5,7 mikroliter omvendt transskriptionsblanding til hver prøve for at bringe det samlede volumen op på 10 mikroliter for hver prøve. Efter blid vortexing og centrifugering, indlæse prøverne i en termocyr og starte den omvendte transskription program.For polymerase kædereaktion forforstærkning, eller PCR, tilsættes 15 mikroliter PCR mix til hver prøve, der indeholder de første streng reaktioner, efterfulgt af blid vortexing og centrifugering. Læg derefter prøverne i termocyren, og start PCR-programmet. Til PCR-rensning tilsættes 25 mikroliter af resuspenderede DNA-rensningsperler til hver prøve, og bland godt ved at hvirvle.Derefter hurtigt dreje prøverne ved stuetemperatur for at indsamle væsken og samtidig undgå afvikling af perlerne. Efter fem minutter ved stuetemperatur sættes prøverne på en passende magnetisk stander, hvor supernatanten forsigtigt fjernes og kasseres, når opløsningen er klar. Vask perlerne med to 30 sekunder vasker i 200 mikroliter frisklavet 80% ethanol pr vask.Og kassér den resterende ethanol efter den anden vask. Når perlerne har lufttørret, tilsættes 11 mikroliter nukleasefrit vand for at fremkalde DNA-målet fra perlerne, efterfulgt af vortexing. Derefter centrifugeres prøverne hurtigt, prøverne returneres til den magnetiske stand, indtil opløsningen er klar, og overfør 10 mikroliter af hver prøve til et nyt PCR-rør.Forstærket cDNA skal have en fuld længde over 500 basispar og beriges fra 1,5 til to kilo bundpar. Desuden er der normalt en 500 til 600 base par berigelse af cDNA observeret i insulin en RFP plus celler, som kan repræsentere insulin udskrifter. Men cDNA fragmenter nær 100 base par er primer dimers, som normalt er forårsaget af overdreven primere, og som skal fjernes ved at gentage DNA rensning trin.CDNA fragmenter mellem 100 og 500 base par normalt repræsenterer nedbrudt cDNA, som er forårsaget af dårlig celle status eller region problemer, såsom RNase forurening og bør udelukkes. Efter rensning af cDNA biblioteker til sekventering, cDNA spænder fra 250 til 450 base par kan opnås ved tilsætning af DNA rensning perler til første og anden runder af rensning. Efter rensning af DNA-perle skal sekvenskvalitetsresultatet være større end 30 under vurderingen af sekvenskvaliteten.For at opnå celler af høj kvalitet til downstream-analyser udelukkes celler med færre end 0,5 millioner kortlagte læsninger eller med færre end 4.000 påviste gener, hvilket letter karakteriseringen af forskellige grupper af celler og identifikation af gener, der er heterogent udtrykt i forskellige grupper efter hovedkomponentanalyse og hierarkisk klyngedannelse. Mens du forsøger denne procedure, Det er vigtigt at huske at gennemgå bugspytkirtlen hurtigt før kollagenase fordøjelsen for at undgå ø over fordøjelsen og for at opretholde RNase frit miljø under enkelt celle procedurer. Efter denne procedure, andre metoder som ø billeddannelse og kultur kan udføres for at lette visualisering af øen struktur og til at undersøge cellulære reaktioner og narkotika stimulation.Efter udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for pancreas forskning for at udforske mekanismerne i øen afstamning udvikling og regenerering, samt diabetes progression hos pattedyr.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering af pluripotente stamceller til NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreatisk progenitorer

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metoder til test endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurale differentiering ved hjælp af enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Multiplexed enkelt celle mRNA sekvensering analyse af mus embryonale celler

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...