Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
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Nous remercions le Centre National pour les Sciences de la protéine, Pékin (Peking University) et le centre de Pékin-Tsinghua le Life Science Computing Platform. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et technologie de la Chine (2015CB942800), la Fondation National sciences naturelles de Chine (31521004, 31471358 et 31522036) et le financement du centre de Pékin-Tsinghua pour les Sciences de la vie à C.-R.X.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Pékin.
1. pancréas isolement
<ol><li>
Pour les embryons E17.5 (embryonnaire jour 17,5) :
	<ol>
<li>Estimer embryonnaire jour 0,5 d’après le point dans le temps lorsque la fiche vaginale apparaît.</li>
		<li>Sacrifier les souris enceintes en CO2 administration. Vaporiser la fourrure abdominale avec 70 % d’alcool.</li...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode efficace et facile à utiliser pour étudier les profils d’expression unicellulaire des cellules β pancréatiques. Cette méthode pourrait être utilisée pour isoler les cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals et d’effectuer des analyses transcriptomiques unicellulaires.
L’étape la plus critique est l’isolement des cellules β unique en bon état. Pancréas complètement perfusés répondent mieux...

Le pancréas est un organe vital métabolique chez les mammifères. Le pancréas est composé de compartiments endocrines et exocrines. Les cellules endocrines du pancréas, y compris les cellules productrices d’insuline β et cellules productrices de glucagon α, cluster ensemble dans les îlots de Langerhans et coordonnée de réguler l’homéostasie du glucose systémique. La dysfonction des cellules endocrines entraîne dans mellitus de diabète, qui est devenue un enjeu majeur de santé publique dans le monde entier.
Les cellules endocrines du pancréas sont dérivés de Ngn3+ progéniteurs au cours de l’embryogenèse1. Plus tard, durant la période périnatale, les cellules endocrines prolifèrent aux îlots immatures de forme. Ces cellules immatures continuent de développer et de devenir progressivement des îlots matures, qui deviennent richement vascularisés pour réguler l’homéostasie du glucose de sang dans les adultes,2.
Bien qu’un groupe de facteurs de transcriptionnelles a été identifié qui régulent la différenciation des cellules β, la voie précise de la maturation des cellules β est encore incertaine. En outre, le processus de maturation des cellules β comporte également la régulation de la cellule numéro expansion3,4 et la génération de l’hétérogénéité cellulaire5,6. Cependant, les mécanismes de régulation de ces processus n’ont pas été bien étudiées.
Unicellulaire RNA-sequencing est une approche puissante qui peut profil sous-populations de cellules et tracer cell lineage voies développementales7. Profitant de cette technologie, la clé des événements qui se produisent au cours du développement des îlots pancréatiques peuvent être déchiffrés au niveau unicellulaire8. Parmi les protocoles de RNA-sequencing unicellulaires, Smart-seq2 permet la génération d’ADNc pleine longueur avec une sensibilité améliorée et précision et l’utilisation des réactifs types à bas coût9. Puce-seq2 prend environ deux jours pour construire une banque d’ADNc pour séquençage10.
Ici, nous proposons une méthode pour isoler des cellules marquées fluorescence β du pancréas de foetus pour adultes de souris transgéniques Ins1-DP11, à l’aide de la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et analyse de la performance de transcriptomique à la niveau unicellulaire, utilisant la technologie Smart-seq2 (Figure 1). Ce protocole peut être étendu pour analyser les transcriptions de tous les types de cellules endocrines pancréatiques dans les États normales, pathologiques et vieillissement.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

Les cellules endocrines du pancréas, qui sont regroupées en îlots, réglementent la stabilité de glucose de sang et le métabolisme énergétique. Les types cellulaires distincts dans les îlots, y compris les cellules sécrétrices d’insuline β, sont distinguent des progéniteurs endocriniens communes durant le stade embryonnaire. Cellules endocrines immatures étendre via la prolifération cellulaire et mûrissent durant une période de développement longtemps après la naissance. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces processus ne sont pas clairement définis. Unicellulaire RNA-sequencing est une approche prometteuse pour la caractérisation de populations cellulaires distincts et voies de différenciation lignée suivi cellulaire. Nous décrivons ici une méthode pour la cellule unique RNA-séquençage des cellules β du pancréas isolé du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals.

Pancréas ont été disséqués souris embryonnaires, néonatals et postnatals (Figure 2 a et 2 b). Pour plus de jours après la naissance 18 souris, l’effet digestif dépend du degré de perfusion ; par conséquent, l’injection est l’étape la plus importante pour l’isolement des îlots pancréatiques (Figure 2-2E et le tableau 6). Autant collagénase ...

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Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Cette méthode peut avoir répondre aux questions clés dans le champ pancréatique d’îlot au sujet de la différenciation pancréatique de lignée d’îlot, de la maturation, et de la régénération. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la collecte de cellules d’îlot pancréatique unique pour la génération de données de séquençage à ARN unique de haute qualité. L’application de cette technique s’étend vers la thérapie du diabète et les autres maladies endocriniennes pancréatiques connexes par l’analyse transcriptomique des cellules individuelles endocriniennes pancréatiques sur les conditions pathologiques.La démonstration visuelle de cette méthode est critique car l’insertion de l’aiguille dans le canal biliaire étroit du pancréas pour la perfusion peut être délicate. Pour le jour embryonnaire 17,5 embryons. Après avoir ouvert la cavité abdominale, utilisez des pinces à épiler pour transférer le tissu viscéral dans un plat noir de fond de six centimètres contenant du PBS froid.Utilisez des forceps pour détacher le pancréas du tissu viscéral. Et placez le tissu pancréatique dans un flacon de 20 millilitres contenant cinq millilitres de solution froide de collagène. Pour la journée postnatale zéro à 15 souris, disséquer soigneusement tous les lobes du pancréas avant de placer le tissu dans la collagène.Pour le jour postnatal 18 à 60 souris, retirez d’abord le xiphoïde et extrayez l’intestin sur le côté droit de la cavité abdominale. Poussez les lobes médials gauche et droit du foie de chaque côté pour exposer la vésicule biliaire et le canal biliaire commun. Et serrez le dudénocumum avec une paire de pinces de petit navire aux positions supérieures et inférieures pour flanquer le site où le canal biliaire entre dans le dudéno.Ensuite, chargez une seringue de 5 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 30 avec solution de collagène froid. Et utilisez le microscope pour insérer la pointe de l’aiguille dans la vésicule biliaire. Manipuler soigneusement et en douceur l’aiguille à travers le canal biliaire commun.Et déprimez le piston pour parcourir le pancréas avec un à cinq millilitres de la solution de collagène selon la taille de la souris. Lorsque toute la solution a été perfusée, utilisez des forceps pour transférer immédiatement le pancréas dans un flacon de 20 millilitres contenant cinq millilitres de solution de collagène froid frais. Lorsque tout le tissu pancréatique a été recueilli, placez le flacon dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant trois minutes, suivi de trois à cinq minutes de secousses douces.Filtrez ensuite le produit digéré à travers une passoire en nylon de 0,25 millimètre dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Et utilisez une seringue de 20 millilitres contenant du PBS glacé pour bien laver la passoire. Pour le jour postnatal 18 à 60 pancréata, centrifugez l’échantillon filtré et résuspendez le tissu en 30 millilitres de PBS froid.Puis décanter la suspension tissulaire dans un plat de fond noir de six centimètres, et utiliser une pipette de 200 microlitres et un microscope dissection pour ramasser les îlots pour le transfert dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un petit volume de PBS froid. Pour le jour embryonnaire 17.5 post natal jour 15 pancréata, centrifugeuse le tissu pancréatique filtré et resuspendre la pastille dans la solution trypsine-EDTA pour une incubation de quatre minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, essayez doucement d’évaluer la pastille pendant une minute avec une pipette de 200 microlitres, suivie de l’ajout de 0,5 fois le volume de sérum bovin fœtal froid avec un léger vortex pour arrêter la digestion.Puis recueillir le digest par centrifugation et résuspendre les cellules dans 200 microlitres de tampon FACS dans un tube FACS de 5 millilitres pour le tri par cytométrie d’écoulement. Pour la cueillette et la lyse à cellule unique, aliquot tampon de lyse cellulaire fraîchement préparé en huit tubes DE PCR bande, et transférer une seule cellule dans chacun. Vortex les échantillons pour lyse les cellules pour la libération de l’ARN, suivie d’une centrifugation pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius, et le stockage immédiat sur la glace.Pour la transcription inversée, incuber les lysates pendant trois minutes à 72 degrés Celsius suivies d’une minute sur la glace. Centrifugez brièvement les échantillons pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius et ajoutez 5,7 microlitres de mélange de transcription inverse à chaque échantillon pour porter le volume total à 10 microlitres pour chaque échantillon. Après un léger vortex et centrifugation, chargez les échantillons dans un thermocycleur et démarrez le programme de transcription inverse.Pour la préamplification de la réaction en chaîne de polymélas, ou PCR, ajoutez 15 microlitres de mélange PCR à chaque échantillon contenant les premières réactions de brin, suivies d’un léger vortex et centrifugation. Chargez ensuite les échantillons dans le thermocycleur et démarrez le programme PCR. Pour la purification pcr, ajouter 25 microlitres de perles de purification de l’ADN résuspendues à chaque échantillon, et bien mélanger par vortex.Puis faites tourner rapidement les échantillons à température ambiante pour recueillir le liquide tout en évitant le règlement des perles. Après cinq minutes à température ambiante, placez les échantillons sur un support magnétique approprié, en enlevant soigneusement et en jetant le supernatant lorsque la solution est claire. Lavez les perles avec deux lavages de 30 secondes dans 200 microlitres de 80 % d’éthanol fraîchement préparé par lavage.Et jeter le reste de l’éthanol après le deuxième lavage. Lorsque les perles ont séché l’air, ajouter 11 microlitres d’eau sans nucléase pour élucider la cible d’ADN des perles, suivie d’un vortex. Ensuite, centrifugez rapidement les échantillons, retournez les échantillons au support magnétique jusqu’à ce que la solution soit claire et transférez 10 microlitres de chaque échantillon dans un nouveau tube PCR.L’ADND amplifié avec succès devrait avoir une longueur totale supérieure à 500 paires de base et être enrichie de paires de base de 1,5 à 2 kilos. En outre, il y a habituellement un enrichissement de paire de base de 500 à 600 cDNA observé dans l’insuline un RFP plus des cellules, qui peuvent représenter les transcriptions d’insuline. Cependant, les fragments de cDNA près de 100 paires de base sont des dimers d’amorce, qui sont habituellement provoqués par des amorces excessives et qui doivent être enlevés en répétant l’étape de purification d’ADN.Les fragments de l’ADNC entre 100 et 500 paires de base représentent habituellement une ADND dégradée, qui est causée par un mauvais état cellulaire ou des problèmes de région, tels que la contamination par la RNase et devraient être exclus. Après la purification des bibliothèques cDNA pour le séquençage, cDNA allant de 250 à 450 paires de base peuvent être obtenus grâce à l’ajout de perles de purification de l’ADN à la première et deuxième ronde de purification. Après purification de perle d’ADN, le score de qualité de séquençage devrait être supérieur à 30 pendant l’évaluation de qualité de séquençage.Pour obtenir des cellules de haute qualité pour les analyses en aval, les cellules de moins de 0,5 million de lecture cartographiées ou contenant moins de 4 000 gènes détectés sont exclues, ce qui facilite la caractérisation de différents groupes de cellules et l’identification de gènes qui sont exprimés hétérogènement en différents groupes après l’analyse des composants principaux et le regroupement hiérarchique. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de perfuser le pancréas rapidement avant la digestion de collagène pour éviter l’îlot au-dessus de la digestion et pour maintenir l’environnement libre de RNase pendant les procédures de cellule simple. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’imagerie et la culture des îlots peuvent être effectuées pour faciliter la visualisation de la structure de l’îlot et pour examiner les réponses cellulaires et la stimulation des médicaments.Après le développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la recherche pancréatique pour explorer les mécanismes du développement et de la régénération de la lignée des îlots, ainsi que la progression du diabète chez les mammifères.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Recherche

Biologie du développement

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

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Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

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Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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