Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
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Wir danken die National Center für Protein Sciences, Beijing (Peking-Universität) und dem Peking-Tsinghua-Center für die Life Science-Computing-Plattform. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technology of China (2015CB942800), der National Natural Science Foundation of China (31521004, 31471358 und 31522036) und Finanzierung von Peking-Tsinghua Zentrum für Life Sciences, C.-R.X.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Peking-Universität genehmigt.
1. die Bauchspeicheldrüse Isolation
<ol><li>
Für E17.5 (embryonale Tag 17,5) Embryonen:
	<ol>
<li>Embryonalen Tag 0,5 Basierend auf dem Zeitpunkt erscheint der vaginal Plug zu schätzen.</li>
		<li>Die schwangere Mäuse durch CO2 Verwaltung zu opfern. Sprühen Sie das Bauch-Fell mit 70 % Alkohol.</li>
		<li>Machen Sie einen...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

In diesem Protokoll haben wir eine effektive und einfach zu bedienende Methode zur Untersuchung der einzelligen expressionsprofile von pankreatischer β-Zellen gezeigt. Mit dieser Methode konnte, endokrine Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und einzellige transkriptomischen Analysen durchzuführen.
Die wichtigste Schritt ist die Isolierung der einzelnen β-Zellen in gutem Zustand. Voll PERFUNDIERTEN Bauchspeicheldrüsen reagieren besser auf n...

Die Bauchspeicheldrüse ist eine wichtige Stoffwechselorgan bei Säugetieren. Die Bauchspeicheldrüse besteht aus endokrinen und exokrinen Fächer. Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse, Insulin produzierenden β-Zellen und Glukagon produzierenden α Zellen, einschließlich cluster gemeinsam in den Langerhans-Inseln und koordinativ systemische Glukose Homöostase zu regulieren. Dysfunktion der endokrinen Zellen führt zu Diabetes Mellitus, die eine wichtige gesundheitspolitische Frage weltweit geworden ist.
Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse stammen aus Ngn3+ Vorfahren während der Embryogenese1. Später, während der Perinatalperiode die endokrinen Zellen vermehren sich zu Form unreifen kleinen Inseln. Diese unreifen Zellen weiter zu entwickeln und allmählich reifer Inselchen, die reich durchblutet werden, um Blut-Glukose-Homöostase in Erwachsene2zu regulieren.
Obwohl eine Gruppe von transcriptional Faktoren, die β-Zell-Differenzierung zu regulieren identifiziert worden, ist die präzise Reifung Weg der β-Zellen noch unklar. Darüber hinaus beinhaltet der β-Zelle-Reifung auch die Regulierung der Zelle Nummer Erweiterung3,4 und die Generierung von zellulären Heterogenität5,6. Die Regulierungsmechanismen dieser Prozesse sind jedoch nicht gut untersucht worden.
Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, der Zelle Subpopulationen Profil und Zelle Abstammung Entwicklungsbiologie Bahnen7verfolgen kann. Nutzen diese Technologie, die Schlüssel, die Ereignisse, die während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen auftreten bei den einzelligen Ebene8entziffert werden können. Unter den einzelligen RNA-Sequenzierung Protokolle ermöglicht Smart-seq2 die Erzeugung von in voller Länge cDNA mit verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit und die Verwendung von standard Reagenzien bei niedrigeren Kosten9. Smart-seq2 dauert ungefähr zwei Tage, eine cDNA-Bibliothek für Sequenzierung10zu konstruieren.
Hier schlagen wir eine Methode zur Isolierung von Fluoreszenz-markierten β-Zellen aus den Bauchspeicheldrüsen von fetalen Erwachsenen Ins1-RFP Transgene Mäuse11, mit Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die Leistung des transkriptomischen analysiert, bei der einzellige Ebene, mit Smart-seq2 Technologie (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann erweitert werden, um das Transkriptom alle pankreatischen endokrinen Zelltypen in normalen und pathologischen Altern Staaten zu analysieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

Pankreatische endokrine Zellen, die in Inseln gruppiert sind, Regeln Blut-Glukose-Stabilität und Energiestoffwechsel. Die unterschiedlichen Zelltypen in Inseln, einschließlich Insulin-sezernierenden β-Zellen werden von gemeinsamen endokrine Vorfahren während der embryonalen Phase unterschieden. Unreife endokrine Zellen über Zellproliferation zu erweitern und einen lange postnatale Entwicklung Zeitraum Reifen. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Prozesse nicht klar definiert. Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein vielversprechender Ansatz für die Charakterisierung von unterschiedlichen Zellpopulationen und Ablaufverfolgung Zelle Abstammung Differenzierung Wege. Hier beschreiben wir eine Methode für die einzelne Zelle RNA-Sequenzierung der isolierte Pankreatische β-Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen.

Bauchspeicheldrüsen von embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Mäusen seziert wurden (Abbildung 2A und 2 b). Für Mäuse älter als postnatale 18.Tag hängt die verdauungsfördernde Wirkung vom Grad der Durchblutung; die Injektion ist daher der wichtigste Schritt zur Insel Isolierung (Abbildung 2-2E und Tabelle 6). Wie viel Kollagenase injiziert wurde, da d...

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Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Diese Methode kann wichtige Fragen im Pankreas-Isletfeld zur Differenzierung, Reifung und Regeneration der Pankreas-Islet-Linie beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Sammlung einzelner Pankreas-Isletzellen zur Generierung hochwertiger einzelliger RNA-Sequenzierungsdaten ermöglicht. Die Anwendung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Diabetes und anderen endokrine Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse durch die transkriptomische Analyse von mittelspeicheldrüsen endokrinen Einzelzellen auf die pathologischen Bedingungen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Einsetzen der Nadel in den schmalen Gallengang der Bauchspeicheldrüse für die Perfusion schwierig sein kann. Für den embryonalen Tag 17,5 Embryonen. Nach dem Öffnen der Bauchhöhle verwenden Sie eine Ellbogenpinzette, um das Viszeralgewebe in eine sechs Zentimeter schwarze Bodenschale mit kaltem PBS zu übertragen.Verwenden Sie Zangen, um die Bauchspeicheldrüse vom Viszeralgewebe zu lösen. Und legen Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe in eine 20 Milliliter Durchstechflasche mit fünf Milliliter kalte Kollagennase-Lösung. Für postnatale Tag null bis 15 Mäuse, sezieren Sie sorgfältig alle Lappen der Bauchspeicheldrüse, bevor Sie das Gewebe in die Kollagenase legen.Für postnatalen Tag 18 bis 60 Mäuse, entfernen Sie zuerst die Xiphoid und extrahieren Sie den Darm auf der rechten Seite der Bauchhöhle. Drücken Sie die linken und rechten medialen Lappen der Leber auf jede Seite, um die Gallenblase und den gemeinsamen Gallengang freizulegen. Und klemmen Sie das Zwölffingerdarm mit einem Paar kleiner Gefäßklemmen an der oberen und unteren Position, um die Stelle zu flankieren, an der der Gallengang in das Zwölffingerdarm eindringt.Als nächstes laden Sie eine 5-Milliliter-Spritze mit einer 30-Spur-Nadel mit Kaltkollagenase-Lösung. Und verwenden Sie das Mikroskop, um die Nadelspitze in die Gallenblase einzufügen. Sorgfältig und reibungslos manipulieren Sie die Nadel durch den gemeinsamen Gallengang.Und drücken Sie den Kolben, um die Bauchspeicheldrüse mit ein bis fünf Milliliter der Kollagenase-Lösung entsprechend der Größe der Maus zu durchdringen. Wenn die gesamte Lösung durchsetzt ist, verwenden Sie Zangen, um die Bauchspeicheldrüse sofort in eine 20-Milliliter-Durchstechflasche mit fünf Milliliter frischer Kaltkollagenaselösung zu übertragen. Wenn das gesamte Bauchspeicheldrüsengewebe gesammelt wurde, legen Sie die Durchstechflasche für drei Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad, gefolgt von drei bis fünf Minuten sanftem Schütteln.Dann filtern Sie das verdaute Produkt durch ein 0,25-Millimeter-Nylonsieb in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Und verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit eiskaltem PBS, um das Sieb gründlich zu waschen. Zentrifugieren Sie für den postnatalen Tag 18 bis 60 Pankreata die gefilterte Probe und setzen Sie das Gewebe in 30 Millilitern kalten PBS wieder auf.Dekantieren Sie dann die Gewebesuspension in eine sechs Zentimeter schwarze Bodenschale und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette und ein Sezierendes Mikroskop, um die Inselchen für den Transfer in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit einem kleinen Volumen kalter PBS zu pflücken. Für den embryonalen Tag 17,5 nach dem Geburt Tag 15 Pankreata zentrifugieren Sie das gefilterte Bauchspeicheldrüsengewebe und setzen Sie das Pellet in Trypsin-EDTA-Lösung für eine vierminütige Inkubation in einem 37 Grad Celsius Wasserbad aus. Versuchen Sie am Ende der Inkubation, das Pellet eine Minute lang mit einer 200-Mikroliter-Pipette zu bewerten, gefolgt von der Zugabe des 0,5-fachen Volumens des kalten fetalen Rinderserums mit einem sanften Wirbel, um die Verdauung zu stoppen.Dann sammeln Sie den Digest durch Zentrifugation und setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter FACS Puffer in einem 5 Milliliter FACS Rohr für die Sortierung durch Durchflusszytometrie. Für Einzelzellkommissionierung und Lyse, aliquot frisch zubereitete Zelllyse Puffer in acht Streifen PCR-Röhren, und übertragen eine einzelne Zelle in jede. Wirbeln Sie die Proben, um die Zellen für die Freisetzung der RNA zu lysieren, gefolgt von Zentrifugation für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius und sofortige Lagerung auf Eis.Für die umgekehrte Transkription, inkubieren Sie die Lysate für drei Minuten bei 72 Grad Celsius gefolgt von einer Minute auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben kurzzeitig für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius und fügen Sie 5,7 Mikroliter Reverse-Transkriptions-Mix zu jeder Probe hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Mikroliter für jede Probe zu bringen. Nach sanfter Wirbelung und Zentrifugation die Proben in einen Thermocycler laden und das Reverse-Transkriptionsprogramm starten.Für die Polymerase-Kettenreaktions-Vorverstärkung oder PCR 15 Mikroliter PCR-Mix zu jeder Probe hinzufügen, die die ersten Strangreaktionen enthält, gefolgt von sanfter Wirbelung und Zentrifugation. Dann laden Sie die Proben in den Thermocycler und starten Sie das PCR-Programm. Für die PCR-Reinigung 25 Mikroliter resuspendierte DNA-Reinigungsperlen zu jeder Probe hinzufügen und durch Wirbelgut vermischen.Dann drehen Sie die Proben schnell bei Raumtemperatur, um die Flüssigkeit zu sammeln, während die Besiedlung der Perlen zu vermeiden. Legen Sie die Proben nach fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einen geeigneten Magnetischen Ständer, indem Sie den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen, wenn die Lösung klar ist. Waschen Sie die Perlen mit zwei 30-Sekunden-Wäsche in 200 Mikroliter frisch zubereitetem 80% Ethanol pro Wäsche.Und das restliche Ethanol nach der zweiten Wäsche entsorgen. Wenn die Perlen Luft getrocknet haben, fügen Sie 11 Mikroliter Nuklease-freies Wasser hinzu, um das DNA-Ziel von den Perlen zu befreien, gefolgt von Wirbeln. Dann zentrifugieren Sie die Proben schnell, geben Sie die Proben an den magnetischen Standfuß zurück, bis die Lösung klar ist, und übertragen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in ein neues PCR-Rohr.Erfolgreich verstärkte cDNA sollte eine volle Länge über 500 Basenpaare haben und von 1,5 auf zwei Kilo Basenpaare angereichert werden. Darüber hinaus gibt es in der Regel eine 500 bis 600 Basenpaar-Anreicherung von cDNA in Insulin ein RFP plus Zellen beobachtet, die die Insulin-Transkripte darstellen können. Die cDNA-Fragmente in der Nähe von 100 Basenpaaren sind jedoch Primer-Dimere, die in der Regel durch übermäßige Primer verursacht werden und die durch Wiederholung des DNA-Reinigungsschritts entfernt werden müssen.Die cDNA-Fragmente zwischen 100 und 500 Basenpaaren stellen in der Regel eine degradierte cDNA dar, die durch schlechte Zellstatus- oder Regionsprobleme wie RNase-Kontamination verursacht wird und ausgeschlossen werden sollte. Nach der Reinigung der cDNA-Bibliotheken zur Sequenzierung kann cDNA im Bereich von 250 bis 450 Basenpaaren durch Zugabe von DNA-Reinigungsperlen zur ersten und zweiten Reinigungsrunde erhalten werden. Nach der DNA-Perlenreinigung sollte die Sequenzierungsqualitätsbewertung während der Sequenzierungsqualitätsbewertung größer als 30 sein.Um qualitativ hochwertige Zellen für nachgelagerte Analysen zu erhalten, werden Zellen mit weniger als 0,5 Millionen kartierten Lesevorgängen oder mit weniger als 4.000 nachgewiesenen Genen ausgeschlossen, was die Charakterisierung verschiedener Zellgruppen und die Identifizierung von Genen erleichtert, die nach der Hauptkomponentenanalyse und hierarchischen Clusterbildung heterogen in verschiedenen Gruppen exprimiert werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Bauchspeicheldrüse schnell vor der Kollagenase-Verdauung zu durchdringen, um eine Letin über die Verdauung zu vermeiden und die rNase freie Umgebung während der Einzelzellverfahren zu erhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Islet Imaging und Kultur durchgeführt werden, um die Visualisierung der Isletstruktur zu erleichtern und zelluläre Reaktionen und Arzneimittelstimulation zu untersuchen.Nach der Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Bauchspeicheldrüsenforschung, um die Mechanismen der Entwicklung und Regeneration von Isletlinien sowie der Diabetesprogression bei Säugetieren zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

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Bewertung von oxidativen Schäden in den primären Maus-Augen-Oberflächenzellen/Stammzellen als Reaktion auf Uv-C-Schäden (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...