Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Vi takker National Center for Protein Sciences, Beijing (Peking University) og Peking-Tsinghua Center for Life Science Computing plattform. Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi i Kina (2015CB942800), National Natural Science Foundation av Kina (31521004, 31471358 og 31522036) og støtte fra Peking-Tsinghua Center for biovitenskap til C.-R.X.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Pekinguniversitetet.
1. bukspyttkjertelen isolasjon
<ol><li>
For E17.5 (embryonale dag 17,5) embryo:
	<ol>
<li>Anslå embryonale dag 0,5 basert på tidspunktet når vaginal pluggen vises.</li>
		<li>Ofre gravid musene av CO2 . Spray abdominal pelsen med 70% alkohol.</li>
		<li>Gjør en V-formet snitt med saks fra underlivet utvide til ribbeina. Denne prosesse...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

I denne protokollen viste vi en effektiv og lett-å-bruke metode for å studere encellede uttrykket profiler av bukspyttkjertelen β celler. Denne metoden kan brukes til å isolere endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases og utføre encellede transcriptomic analyser.
Det viktigste trinnet er isolering av enkelt β celler i god stand. Fullt parfyme pancreases svare bedre senere fordøyelsen. Utilstrekkelig perfusjon, som vanligvis oppstår i dorsal bukspyttkjertelen, vi...

Bukspyttkjertelen er et viktig metabolsk organ i pattedyr. Bukspyttkjertelen består av endokrine og exocrine avdelinger. Bukspyttkjertelen endokrine cellene, inkludert insulin-produserende β celler og produserer glukagon α celler, klynge sammen i holmer Langerhans og regulere coordinately systemisk glukose homeostase. Dysfunksjon endokrine cellene fører til diabetes mellitus, som har blitt et stort folkehelseproblem over hele verden.
Bukspyttkjertelen endokrine celler er avledet fra Ngn3+ progenitors under embryogenesis1. Senere, i perinatalperioden sprer endokrine cellene til skjemaet umodne holmer. Disse umodne celler fortsette å utvikle og gradvis bli moden holmer, som blir rikt Stangeriaceae for å regulere blod glukose homeostase i voksne2.
Selv om en gruppe transcriptional faktorer er identifisert som regulerer β celledifferensiering, er presis modning veien β celler fortsatt uklart. Videre omfatter β celle modning prosessen også regulering av celle nummer ekspansjon3,4 og generering av mobilnettet heterogenitet5,6. Imidlertid har regulatoriske mekanismer av disse prosessene ikke vært godt undersøkt.
Encellede RNA-sekvensering er en kraftig tilnærming kan profil celle subpopulasjoner og spore celle avstamning utviklingsmessige trasé7. Utnytter denne teknologien, nøkkelen hendelser som oppstår under bukspyttkjertelen Holme utvikling kan tyde på encellede nivå8. Blant encellede RNA-sekvensering protokollene tillater Smart-seq2 generering av full lengde cDNA med økt følsomhet og nøyaktighet, og bruk av standard reagenser lavere kostnader9. Smart-seq2 tar ca to dager å konstruere et cDNA bibliotek for sekvensering10.
Her foreslår vi en metode for isolering av fluorescens-merket β celler fra pancreases av fetal voksen Ins1-RFP transgene mus11, bruke fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS), og ytelsen til transcriptomic analyserer på den encellede nivå, ved hjelp av Smart-seq2 teknologi (figur 1). Denne protokollen kan utvides for å analysere transcriptomes alle bukspyttkjertelen endokrine celletyper i normal, patologiske og aldring stater.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

Bukspyttkjertelen endokrine celler som er gruppert i holmer, regulerer blod glukose stabilitet og energi metabolisme. De ulike celletyper i øyer, inkludert insulin sekresjon β celler, er differensiert fra vanlige endokrine progenitors under embryonale scenen. Umodne endokrine celler utvide via celle spredning og modne under en lang utviklingsmessige barseltiden. Imidlertid er mekanismene bak disse prosessene ikke klart definert. Encellede RNA-sekvensering er en lovende metode for karakterisering av ulike celle populasjoner og sporing celle avstamning differensiering trasé. Her beskriver vi en metode for den encellede RNA-sekvensering av isolerte bukspyttkjertelen β celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases.

Pancreases ble dissekert fra embryonale, neonatal og postnatal mus (figur 2A og 2B). For mus eldre enn postnatal dag 18 avhenger fordøyelseskanal effekten av graden av perfusjon; Derfor injeksjon er viktigste Holme isolering (figur 2C-2E og tabell 6). Så mye collagenase ble injisert som var mulig å fylle bukspyttkjertelen i dette trinnet. Fullt oppblåst buks...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Vi beskriver en metode for isolering av endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases etterfulgt av encellede RNA sekvensering. Denne metoden kan analyser av bukspyttkjertelen endokrine avstamning utvikling, celle heterogenitet og transcriptomic dynamics.

Encellede Transcriptomic analyser av musen bukspyttkjertelen endokrine celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Denne metoden kan ha svar på viktige spørsmål i bukspyttkjertelen om bukspyttkjertelen avstamning differensiering, modning og regenerering. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater innsamling av enkelt bukspyttkjertel holmeceller for generering av høy kvalitet enkeltcelle RNA sekvenseringsdata. Anvendelsen av denne teknikken strekker seg mot behandling av diabetes og de andre bukspyttkjertelendokrine relaterte sykdommene gjennom transkripsjonsanalysen av bukspyttkjertelendokrine enkeltceller på de patologiske forholdene.Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk som innsetting av nålen i den smale gallekanalen i bukspyttkjertelen for perfusjonen kan være vanskelig. For embryonal dag 17,5 embryoer. Etter å ha åpnet bukhulen, bruk albue pinsett for å overføre visceral vev til en seks centimeter svart bunnrett som inneholder kald PBS.Bruk tang for å løsne bukspyttkjertelen fra visceralvevet. Og legg bukspyttkjertelvevet i et 20 milliliter hetteglass som inneholder fem milliliter kald kollagenaseløsning. For post natal dag null til 15 mus, nøye dissekere alle fliker i bukspyttkjertelen før du plasserer vevet i kollagenase.For post natal dag 18 til 60 mus, først fjerne xiphoid og trekke tarmen til høyre side av bukhulen. Skyv venstre og høyre mediale fliker i leveren til hver side for å eksponere galleblæren og den vanlige gallekanalen. Og klem tolvfingertarmen med et par små karklemmer i øvre og nedre posisjoner for å flankere stedet der gallekanalen kommer inn i tolvfingertarmen.Deretter legger du en 5 milliliter sprøyte utstyrt med en 30 gauge nål med kald kollagenaseløsning. Og bruk mikroskopet til å sette nålespissen inn i galleblæren. Forsiktig og jevnt manipulere nålen gjennom den vanlige gallekanalen.Og trykk på stempelet for å perfuse bukspyttkjertelen med en til fem milliliter av kollagenaseløsningen i henhold til musens størrelse. Når all oppløsningen er perfundert, bruk tang til umiddelbart å overføre bukspyttkjertelen til et 20 milliliter hetteglass som inneholder fem milliliter frisk kald kollagenaseløsning. Når alt bukspyttkjertelvevet er samlet, legg hetteglasset i et 37 graders Celsius vannbad i tre minutter, etterfulgt av tre til fem minutter med mild risting.Deretter filtrerer du det fordøyde produktet gjennom en 0,25 millimeter nylonsil i et nytt 50 milliliter sentrifugerør. Og bruk en 20 milliliter sprøyte som inneholder iskald PBS for å vaske silen grundig. For post natal dag 18 til 60 pankreat, sentrifugere den filtrerte prøven og gjenbruke vevet i 30 milliliter kald PBS.Deretter dekantere vevsopphenget til en seks centimeter svart bunnrett, og bruk en 200 mikroliter pipette og et dissekeringsmikroskop for å plukke holmene for overføring til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som inneholder et lite volum kald PBS. For embryonal dag 17,5 post natal dag 15 pankreat, sentrifugere filtrert bukspyttkjertelvev og resuspend pellet i trypsin-EDTA løsning for en fire minutters inkubasjon i en 37 grader Celsius vannbad. På slutten av inkubasjonen, prøv forsiktig å rangere pelleten i ett minutt med en 200 mikroliter pipette, etterfulgt av tilsetning av 0,5 ganger volumet av kaldt fosterbovinserum med en mild vortexing for å stoppe fordøyelsen.Deretter samle sammendraget ved sentrifugering og resuspend cellene i 200 mikroliter facs buffer i en 5 milliliter FACS rør for sortering etter flyt cytometri. For enkeltcelleplukking og lysis, aliquot nylaget cellelysbuffer i åtte stripe PCR-rør, og overføre en enkelt celle til hver. Vortex prøvene for å lyse cellene for frigjøring av RNA, etterfulgt av sentrifugering i 30 sekunder ved fire grader Celsius, og umiddelbar lagring på is.For omvendt transkripsjon, inkuber lysates i tre minutter på 72 grader Celsius etterfulgt av ett minutt på is. Sentrifuger prøvene i 30 sekunder ved fire grader Celsius og tilsett 5,7 mikroliter omvendt transkripsjonsblanding til hver prøve for å bringe det totale volumet til 10 mikroliter for hver prøve. Etter mild vortexing og sentrifugering, last prøvene inn i en termocycler og start omvendt transkripsjonsprogram.For polymerase kjedereaksjon forenkling, eller PCR, tilsett 15 mikroliter PCR-blanding til hver prøve som inneholder de første trådreaksjonene, etterfulgt av mild vortexing og sentrifugering. Deretter laster du prøvene inn i termocycleren og starter PCR-programmet. For PCR-rensing, tilsett 25 mikroliter med resuspended DNA rensing perler til hver prøve, og bland godt ved vortexing.Deretter spinner du raskt prøvene ved romtemperatur for å samle væsken mens du unngår oppgjør av perlene. Etter fem minutter ved romtemperatur plasserer du prøvene på et passende magnetisk stativ, fjerner og kaster forsiktig overnatanten når løsningen er klar. Vask perlene med to 30 sekunders vasker i 200 mikroliter med nylaget 80% etanol per vask.Og kast resten av etanol etter den andre vasken. Når perlene har lufttørket, tilsett 11 mikroliter kjernefritt vann for å elute DNA-målet fra perlene, etterfulgt av vortexing. Sentrifuger deretter prøvene raskt, returner prøvene til magnetstativet til løsningen er klar og overfør 10 mikroliter av hver prøve til et nytt PCR-rør.Vellykket forsterket cDNA bør ha en full lengde over 500 basepar, og være beriket fra 1,5 til to kilo basepar. Videre er det vanligvis en 500 til 600 base par berikelse av cDNA observert i insulin en RFP pluss celler, som kan representere insulin transkripsjoner. CDNA-fragmentene i nærheten av 100 basispar er imidlertid primer dimers, som vanligvis skyldes overdreven primere og som må fjernes ved å gjenta DNA-rensetrinnet.CDNA-fragmentene mellom 100 og 500 basispar representerer vanligvis degradert cDNA, som skyldes dårlig cellestatus eller regionproblemer, for eksempel RNase-kontaminering og bør utelukkes. Etter rensing av cDNA biblioteker for sekvensering, cDNA varierer fra 250 til 450 base par kan oppnås gjennom tillegg av DNA rensing perler til første og andre runder av rensing. Etter DNA perle rensing, bør sekvensering kvalitetsscore være større enn 30 under sekvensering kvalitet evaluering.For å oppnå celler av høy kvalitet for nedstrøms analyser, er celler med færre enn 0,5 millioner kartlagte leser eller med færre enn 4000 oppdagede gener utelukket, noe som letter karakteriseringen av ulike grupper av celler og identifisering av gener som er heterogent uttrykt i forskjellige grupper etter hovedkomponentanalyse og hierarkisk klynger. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å perfuse bukspyttkjertelen raskt før kollagenase fordøyelsen for å unngå holme over fordøyelsen og for å opprettholde RNase fritt miljø under enkeltcelleprosedyrer. Etter denne prosedyren kan andre metoder som holmeavbildning og kultur utføres for å lette visualisering av holmestrukturen og for å undersøke cellulære responser og legemiddelstimulering.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen bukspyttkjertelforskning for å utforske mekanismene for holmelinjeutvikling og regenerering, samt diabetesprogresjon hos pattedyr.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differensiering av pluripotent stamceller til å NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; bukspyttkjertelen stamfedre

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metoder for å teste endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering av oksidativ skade i primær mus okulære overflateceller / stamceller som svar på ultrafiolett-C (UV-C) skade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering analyse av Mouse embryonale celler

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Utarbeidelse av små RNA biblioteker for sekvensering fra tidlig mus embryoer

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...