Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Agradecemos o centro nacional para Ciências da proteína, Beijing (Peking University) e do centro de Pequim-Tsinghua para a plataforma de computação de Ciências da vida. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia da China (2015CB942800), Nacional Natural Science Foundation da China (31521004, 31471358 e 31522036) e financiamento de Pequim-Tsinghua centro para Ciências da vida para R.X.-C.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Pequim e institucional Cuidado Animal.
1. pâncreas isolamento
<ol><li>
Embriões de E17.5 (dia embrionário 17,5):
	<ol>
<li>Estime dia embrionário 0.5 baseado no ponto de tempo, quando aparece o plug vaginal.</li>
		<li>Sacrifica os ratos grávidas pela administração de CO2 . Pulverize a pele abdominal com álcool a 70%.</li>
		<li>Faça uma incisão em forma de V ...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

Neste protocolo, temos demonstrado um método eficaz e fácil de usar para estudar os perfis de expressão de célula única das células β do pâncreas. Esse método pode ser usado para isolar células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal e realizar análises de transcriptomic de célula única.
O passo mais crítico é o isolamento das células β único em boas condições. Totalmente perfundidos pancreases respondem melhor à digestão subsequente. Insuficiente ...

O pâncreas é um órgão vital metabólico em mamíferos. O pâncreas é composto por compartimentos endócrinos e exócrinas. Células endócrinas no pâncreas, incluindo células β produtoras de insulina e glucagon-produzindo células α, cluster juntos em ilhotas de Langerhans e coordenada regulam a homeostase de glicose sistémica. Disfunção das células endócrinas resulta em diabetes mellitus, que se tornou uma questão de saúde pública em todo o mundo.
Células endócrinas do pâncreas são derivadas de Ngn3+ progenitores durante a embriogênese1. Mais tarde, durante o período perinatal, as células endócrinas proliferaram para Ilhéus imaturo de formulário. Estas células imaturas continuam a desenvolver e tornar-se progressivamente ilhotas maduras, que se tornam ricamente vascularizadas regular homeostase de glicose do sangue em adultos2.
Embora foi identificado um grupo de fatores de transcrição que regulam a diferenciação de células β, o caminho exato de maturação das células β é ainda incerto. Além disso, o processo de maturação de células β envolve também o Regulamento da cela número expansão3,4 e a geração de heterogeneidade celular5,6. No entanto, os mecanismos de regulação desses processos não foram bem estudados.
A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem poderosa que pode perfil subpopulações de células e rastrear celular linhagem caminhos do desenvolvimento7. Aproveitando esta tecnologia, a chave de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento de ilhotas pancreáticas podem ser decifrados a célula única nível8. Entre os protocolos de célula única-a sequenciação do ARN, Smart-seq2 permite a geração de cDNA completo com sensibilidade melhorada e precisão e a utilização de reagentes padrão no menor custo9. Inteligente-seq2 leva cerca de dois dias para construir uma biblioteca de cDNA para sequenciamento10.
Aqui, propomos um método para o isolamento de células β fluorescência-etiquetada dos pancreases de fetal adulto Ins1-RFP11ratos transgénicos, usando fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e o desempenho de transcriptomic analisa na nível de célula única, usando a tecnologia Smart-seq2 (Figura 1). Este protocolo pode ser estendido para analisar a transcriptomes de todos os tipos de célula endócrina do pâncreas em Estados normais, patológicos e envelhecimento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

Células endócrinas no pâncreas, que são agrupadas em Ilhéus, regulam a estabilidade de glicose do sangue e metabolismo energético. Os tipos de células distintas em Ilhéus, incluindo células secretoras de insulina β, são diferenciados de progenitores endócrinas comuns durante a fase embrionária. Células endócrinas imaturas expandir através da proliferação celular e amadurecem durante um período de tempo pós-natal do desenvolvimento. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses processos não estão claramente definidos. A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem promissora para a caracterização das populações de células distintas e vias de diferenciação de linhagem de célula rastreamento. Aqui, descrevemos um método para a célula única-a sequenciação do ARN de células β do pâncreas isolado de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal.

Pancreases foram dissecados de ratos embrionários, Neonatais e pós-natal (Figura 2A e 2B). Para os ratos mais velhos que pós-Natal dia 18, o efeito digestivo depende do grau de perfusão; Portanto, a injeção é o passo mais importante para isolamento ilhéu (Figura 2-2E e tabela 6). Tanto colagenase foi injetado como era possível preencher o pâncreas dura...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Este método pode ter resposta a perguntas-chave no campo de ilhotas pancreáticas sobre diferenciação de linhagem de ilhotas pancreáticas, maturação e regeneração. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a coleta de células únicas de ilhotas pancreáticas para a geração de dados de sequenciamento de RNA unicelular de alta qualidade. A aplicação dessa técnica estende-se à terapia do diabetes e de outras doenças endócrinas pancreáticas por meio da análise transcriômica de células únicas endocrinas pancreáticas sobre as condições patológicas.A demonstração visual deste método é fundamental, pois a inserção da agulha no estreito ducto biliar do pâncreas para a perfusão pode ser complicada. Para embrionário dia 17,5 embriões. Depois de abrir a cavidade abdominal, use pinças de cotovelo para transferir o tecido visceral para uma antena de fundo preto de seis centímetros contendo PBS frio.Use fórceps para separar o pâncreas do tecido visceral. E coloque o tecido pancreático em um frasco de 20 mililitros contendo cinco mililitros de solução de colagem fria. Para o pós-natal dia zero a 15 ratos, disseque cuidadosamente todos os lóbulos do pâncreas antes de colocar o tecido na colagemnase.Para o pós-natal dia 18 a 60 camundongos, primeiro remova o xifoide e extraia o intestino para o lado direito da cavidade abdominal. Empurre os lóbulos medial esquerdo e direito do fígado para cada lado para expor a vesícula biliar e o ducto biliar comum. E aperte o duodeno com um par de pequenos grampos de vaso nas posições superior e inferior para flanquear o local onde o ducto biliar entra no duodeno.Em seguida, carregue uma seringa de 5 mililitros equipada com uma agulha calibre 30 com solução de colagem a frio. E use o microscópio para inserir a ponta da agulha na vesícula biliar. Manipule com cuidado e suavemente a agulha através do ducto biliar comum.E deprimir o êmbolo para perfundir o pâncreas com um a cinco mililitros da solução de colagem de acordo com o tamanho do mouse. Quando toda a solução tiver sido perfundida, use fórceps para transferir imediatamente o pâncreas para um frasco de 20 mililitros contendo cinco mililitros de solução de colagem fria fresca. Quando todo o tecido pancreático tiver sido coletado, coloque o frasco em um banho de água de 37 graus Celsius por três minutos, seguido de três a cinco minutos de agitação suave.Em seguida, filtre o produto digerido através de um coador de nylon de 0,25 milímetros em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. E use uma seringa de 20 mililitros contendo PBS gelado para lavar completamente o coador. Para o pós-natal dia 18 a 60 pancreata, centrifugar a amostra filtrada e resuspensar o tecido em 30 mililitros de PBS frio.Em seguida, decantar a suspensão do tecido em um prato de fundo preto de seis centímetros, e usar uma pipeta de 200 microliter e um microscópio dissecando para colher as ilhotas para transferência em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro contendo um pequeno volume de PBS frio. Para o dia embrionário 17,5 pós natal dia 15 pancreata, centrifugar o tecido pancreático filtrado e resuspensar a pelota em solução trypsin-EDTA para uma incubação de quatro minutos em um banho de água Celsius de 37 graus. No final da incubação, tente suavemente classificar a pelota por um minuto com uma pipeta de 200 microliter, seguida pela adição de 0,5 vezes o volume de soro bovino fetal frio com um vórtice suave para parar a digestão.Em seguida, colete o digestor por centrifugação e resuspenja as células em 200 microliters de tampão FACS em um tubo FACS de 5 mililitros para classificação por citometria de fluxo. Para a colheita e lise de células únicas, aliquot recém-preparado tampão de lise celular em oito tubos PCR de tiras, e transferir uma única célula para cada. Vórtice as amostras para lise as células para liberação do RNA, seguidas de centrifugação por 30 segundos a quatro graus Celsius, e armazenamento imediato no gelo.Para transcrição reversa, incubar os lises por três minutos a 72 graus Celsius seguido de um minuto no gelo. Centrifufique brevemente as amostras por 30 segundos a quatro graus Celsius e adicione 5,7 microliters de mistura de transcrição reversa a cada amostra para levar o volume total a 10 microlitres para cada amostra. Após vórtice suave e centrifugação, carregue as amostras em um termociclador e inicie o programa de transcrição reversa.Para pré-amplificação de reação em cadeia de polimerase, ou PCR, adicione 15 microliters de mistura PCR a cada amostra contendo as reações do primeiro fio, seguido por vórtice suave e centrifugação. Em seguida, carregue as amostras no termociclador e inicie o programa PCR. Para purificação de PCR, adicione 25 microliters de contas de purificação de DNA resuspended em cada amostra, e misture bem com vórtice.Em seguida, gire rapidamente as amostras à temperatura ambiente para coletar o líquido, evitando a liquidação das contas. Após cinco minutos em temperatura ambiente, coloque as amostras em um suporte magnético apropriado, removendo cuidadosamente e descartando o sobrenante quando a solução estiver clara. Lave as contas com duas lavagens de 30 segundos em 200 microliters de 80% de etanol recém-preparado por lavagem.E descarte o etanol restante após a segunda lavagem. Quando as contas secarem o ar, adicione 11 microliters de água sem nuclease para elutar o alvo de DNA das contas, seguido de vórtice. Em seguida, centrifufique rapidamente as amostras, devolva as amostras ao suporte magnético até que a solução esteja clara e transfira 10 microliters de cada amostra para um novo tubo PCR.CDNA amplificada com sucesso deve ter um comprimento completo acima de 500 pares de base, e ser enriquecido de 1,5 a dois pares de base de dois quilos. Além disso, geralmente há um enriquecimento de par de 500 a 600 bases de cDNA observado em insulina um RFP mais células, o que pode representar as transcrições de insulina. No entanto, os fragmentos de cDNA perto de 100 pares de base são dimers primer, que geralmente são causados por primers excessivos e que devem ser removidos repetindo a etapa de purificação de DNA.Os fragmentos de CDNA entre 100 e 500 pares de base geralmente representam cDNA degradado, que é causado por problemas de estado celular ruim ou região, como a contaminação rnase e deve ser excluído. Após a purificação das bibliotecas cDNA para sequenciamento, cDNA variando de 250 a 450 pares de base pode ser obtido através da adição de contas de purificação de DNA à primeira e segunda rodadas de purificação. Após a purificação das contas de DNA, o escore de qualidade de sequenciamento deve ser superior a 30 durante a avaliação da qualidade do sequenciamento.Para obter células de alta qualidade para análises a jusante, são excluídas células com menos de 0,5 milhões de leituras mapeadas ou com menos de 4.000 genes detectados, facilitando a caracterização de diferentes grupos de células e a identificação de genes heterogêneos expressos em diferentes grupos após análise de componentes principais e agrupamento hierárquico. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de perfumar o pâncreas rapidamente antes da digestão da colagem para evitar a digestão da ilhota sobre a digestão e manter o ambiente livre de RNase durante os procedimentos de célula única. Após este procedimento, outros métodos como imagem de ilhotas e cultura podem ser realizados para facilitar a visualização da estrutura da ilhota e examinar as respostas celulares e estimulação de medicamentos.Após o desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da pesquisa pancreática explorarem os mecanismos de desenvolvimento e regeneração da linhagem de ilhéus, bem como a progressão do diabetes em mamíferos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Biologia do Desenvolvimento

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Avaliação de danos oxidativos nas células de superfície ocular/células-tronco do rato primário em resposta ao dano ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...