Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
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Agradecemos el Centro Nacional de Ciencias de la proteína, Beijing (Universidad de Pekín) y el centro Tsinghua de Pekín para la plataforma de computación de Ciencias de la vida. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología de China (2015CB942800), la nacional Ciencias naturales Fundación de China (31521004, 31471358 y 31522036) y financiación del centro Tsinghua de Pekín para Ciencias de la vida a C. R.X.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Pekín.
1. páncreas aislamiento
<ol><li>
Para embriones E17.5 (día embrionario 17.5):
	<ol>
<li>Estimar embrionario día 0.5 basado en el momento cuando aparece el tapón vaginal.</li>
		<li>Sacrificar a los ratones embarazados por la administración de CO2 . Rocíe la piel abdominal con alcohol al 70%.</li>
		<li>Haga una incis...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

En este protocolo, hemos demostrado un método efectivo y fácil de usar para el estudio de los perfiles de expresión de la sola célula de las células β pancreáticas. Este método podría utilizarse para aislar las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales y realizar análisis transcriptómico de unicelulares.
El paso más crítico es el aislamiento de las células β solo en buen estado. Páncreas totalmente inundadas responden mejor a la digestión subsigu...

El páncreas es un órgano vital metabólico en mamíferos. El páncreas está compuesto por compartimientos endocrinos y exocrinos. Las células endocrinas pancreáticas, incluyendo las células β productoras de insulina y células productoras de glucagón α, se agrupan juntos en los islotes de Langerhans y coordinadamente regulan la homeostasis de la glucosa sistémica. Resultados de la disfunción de las células endocrinas en la diabetes mellitus, que se ha convertido en un problema de salud pública importante en todo el mundo.
Las células endocrinas pancreáticas derivan de Ngn3+ progenitores durante embriogénesis1. Más tarde, durante el período perinatal, las células endocrinas proliferan a islotes inmaduro forma. Estas células inmaduras continúan desarrollar y gradualmente se convierten en islotes de madurados, que se convierten en ricamente vascularizados para regular la homeostasis de la glucosa de sangre en adultos2.
Aunque se ha identificado un grupo de factores transcripcionales que regulan la diferenciación de la célula β, el camino preciso de la maduración de las células β es todavía confuso. Además, el proceso de maduración de la célula β implica también la regulación de la célula número expansión3,4 y la generación de heterogeneidad celular5,6. Sin embargo, los mecanismos de regulación de estos procesos no han sido bien estudiados.
Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque potente perfil subpoblaciones celulares y traza de vías del desarrollo de linaje celular7. Tomando ventaja de esta tecnología, la clave de los eventos que ocurren durante el desarrollo de islotes pancreáticos pueden ser descifrados en el nivel unicelular8. Entre los protocolos de la secuencia de RNA unicelular, Smart-Sec2 permite la generación de cDNA de larga duración con mejor sensibilidad y precisión y el uso de reactivos estándar en menor costo9. Smart-Sec2 tarda aproximadamente dos días para construir una biblioteca de cDNA de la secuencia10.
Aquí proponemos un método para el aislamiento de las células β marcados con fluorescencia desde el páncreas del feto adulto Ins1 RFP ratones transgénicos11usando celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación, y el rendimiento de transcriptómicos analiza en el sola célula nivel, usando la tecnología Smart-Sec2 (figura 1). Este protocolo puede extenderse para analizar los transcriptomas de todos los tipos de células endocrinas pancreáticas en Estados normales, patológicos y el envejecimiento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

Las células endocrinas pancreáticas, que se agrupan en islotes, regulan la estabilidad de la glucosa sanguínea y el metabolismo energético. Los tipos de células distintos en islotes, incluyendo células β secretoras de insulina, se distinguen de los comunes progenitores endocrinos durante la fase embrionaria. Inmaduras células endocrinas amplían a través de la proliferación celular y maduran durante un periodo de desarrollo postnatal largo. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos procesos no están claramente definidos. Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque prometedor para la caracterización de poblaciones celulares distintas y las vías de diferenciación de seguimiento celular linaje. Aquí, describimos un método para la secuenciación del RNA unicelular de células β pancreáticas aisladas de páncreas embrionarios, neonatales y postnatales.

Se disecaron páncreas de ratones embrionarios, neonatales y postnatales (figura 2A y 2B). Para los ratones mayores de postnatal día 18, el efecto digestivo depende del grado de perfusión; por lo tanto, la inyección es el paso más importante para el aislamiento de islotes pancreáticos (figura 2-2E y tabla 6). Se inyectó tanto colagenasa como fue posible ll...

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Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Se describe un método para el aislamiento de las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales seguidos por la secuencia de RNA unicelular. Este método permite el análisis del desarrollo del linaje endocrino pancreático, de células dinámicas heterogeneidad y transcriptómicos.

Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Este método puede tener respuestas preguntas clave en el campo de los islotes pancreáticos sobre la diferenciación del linaje de los islotes pancreáticos, la maduración y la regeneración. La principal ventaja de esta técnica es que permite la recolección de células de islote pancreático único para la generación de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de alta calidad. La aplicación de esta técnica se extiende hacia la terapia de la diabetes y las otras enfermedades relacionadas con el endocrino pancreático a través del análisis transcriptómico de células monorinas pancreáticas en las condiciones patológicas.La demostración visual de este método es crítica, ya que la inserción de la aguja en el estrecho conducto biliar del páncreas para la perfusión puede ser complicada. Para embriones embrionarios día 17.5. Después de abrir la cavidad abdominal, usa pinzas de codo para transferir el tejido visceral a una placa inferior negra de seis centímetros que contenga PBS frío.Use fórceps para separar el páncreas del tejido visceral. Y coloque el tejido pancreático en un vial de 20 mililitros que contenga cinco mililitros de solución de colágeno frío. Para el día post natal de cero a 15 ratones, disecciona cuidadosamente todos los lóbulos del páncreas antes de colocar el tejido en la colagenasa.Para el día post natal 18 a 60 ratones, primero retire el xifoide y extraiga el intestino al lado derecho de la cavidad abdominal. Empuje los lóbulos mediales izquierdo y derecho del hígado a cada lado para exponer la vesícula biliar y el conducto biliar común. Y sujeta el duodeno con un par de pequeñas abrazaderas de recipiente en las posiciones superior e inferior para flanquear el sitio donde el conducto biliar entra en el duodeno.A continuación, cargue una jeringa de 5 mililitros equipada con una aguja de calibre 30 con solución de colagenasa fría. Y usa el microscopio para insertar la punta de la aguja en la vesícula biliar. Manipule cuidadosamente y suavemente la aguja a través del conducto biliar común.Y presione el émbolo para perfumar el páncreas con uno a cinco mililitros de la solución de colagenasa según el tamaño del ratón. Cuando se haya perfusado toda la solución, utilice fórceps para transferir inmediatamente el páncreas a un vial de 20 mililitros que contenga cinco mililitros de solución de colágeno frío fresco. Cuando se haya recogido todo el tejido pancreático, coloque el vial en un baño de agua Celsius de 37 grados durante tres minutos, seguido de tres a cinco minutos de agitación suave.A continuación, filtre el producto digerido a través de un colador de nylon de 0,25 milímetros en un nuevo tubo centrífugo de 50 mililitros. Y utilice una jeringa de 20 mililitros que contenga PBS helado para lavar a fondo el colador. Para el día post natal 18 a 60 pancreata, centrifugar la muestra filtrada y resuspend el tejido en 30 mililitros de PBS frío.A continuación, decantar la suspensión del tejido en un plato inferior negro de seis centímetros, y utilizar una pipeta de 200 microlitros y un microscopio deseccionamiento para recoger los islotes para su transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene un pequeño volumen de PBS frío. Para el día embrionario 17.5 después del día natal 15 pancreata, centrifugar el tejido pancreático filtrado y resuspend el pellet en solución de trippsina-EDTA para una incubación de cuatro minutos en un baño de agua de 37 grados Celsius. Al final de la incubación, tratar suavemente de calificar el pellet durante un minuto con una pipeta de 200 microlitro, seguido de la adición de 0,5 veces el volumen de suero bovino fetal frío con un vórtice suave para detener la digestión.A continuación, recoja el resumen por centrifugación y resusppend las células en 200 microlitros de tampón FACS en un tubo FACS de 5 mililitros para la clasificación por citometría de flujo. Para la recolección y la lysis de una sola célula, alícuota el búfer de lysis celular recién preparado en tubos de PCR de ocho tiras, y transfiera una sola célula a cada uno. Vórtice las muestras para angarer las células para la liberación del ARN, seguido de centrifugación durante 30 segundos a cuatro grados Centígrados, y almacenamiento inmediato en hielo.Para la transcripción inversa, incuba los lysates durante tres minutos a 72 grados Celsius seguido de un minuto sobre hielo. Centrifugar brevemente las muestras durante 30 segundos a cuatro grados Celsius y añadir 5,7 microlitros de mezcla de transcripción inversa a cada muestra para llevar el volumen total a 10 microlitros para cada muestra. Después de un suave vórtice y centrifugación, cargue las muestras en un termociclador e inicie el programa de transcripción inversa.Para la preamplificación de la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, agregue 15 microlitros de mezcla de PCR a cada muestra que contenga las primeras reacciones de hebra, seguido de vórtice suave y centrifugación. A continuación, cargue las muestras en el termociclador e inicie el programa PCR. Para la purificación de PCR, agregue 25 microlitros de perlas de purificación de ADN resuspendidas a cada muestra, y mezcle bien por vórtice.A continuación, gire rápidamente las muestras a temperatura ambiente para recoger el líquido evitando la liquidación de las cuentas. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, coloque las muestras en un soporte magnético adecuado, retirando y descartando cuidadosamente el sobrenadante cuando la solución esté transparente. Lave las cuentas con dos lavados de 30 segundos en 200 microlitros de 80% de etanol recién preparado por lavado.Y deseche el etanol restante después del segundo lavado. Cuando las perlas se hayan secado al aire, agregue 11 microlitros de agua sin nucleasas para eluir el objetivo del ADN de las cuentas, seguido de vórtices. A continuación, centrifugar rápidamente las muestras, devolver las muestras al soporte magnético hasta que la solución esté clara y transferir 10 microlitros de cada muestra a un nuevo tubo de PCR.El ADNn arriba amplificado con éxito debe tener una longitud completa por encima de 500 pares base, y enriquecerse de 1,5 a dos pares de bases de kilos. Además, generalmente se observa un enriquecimiento de 500 a 600 pares base de ADNc en insulina un RFP más, que puede representar las transcripciones de insulina. Sin embargo, los fragmentos de ADNn a cerca de 100 pares base son dimers de imprimación, que generalmente son causados por imprimaciones excesivas y que deben ser eliminados repitiendo el paso de purificación del ADN.Los fragmentos de ADNc entre 100 y 500 pares base suelen representar adNn a causa de un ADN. degradado, que es causado por problemas de estado celular o región deficientes, como la contaminación por RSE y debe excluirse. Después de la purificación de las bibliotecas de ADNc para la secuenciación, el ADNc que oscila entre 250 y 450 pares base se puede obtener mediante la adición de perlas de purificación de ADN a la primera y segunda rondas de purificación. Después de la purificación del cordón de ADN, la puntuación de calidad de secuenciación debe ser superior a 30 durante la evaluación de la calidad de la secuenciación.Para obtener células de alta calidad para análisis posteriores, se excluyen las células con menos de 0,5 millones de lecturas mapeadas o con menos de 4.000 genes detectados, facilitando la caracterización de diferentes grupos de células y la identificación de genes que se expresan heterogéneamente en diferentes grupos después del análisis de componentes principales y la agrupación jerárquica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar perfumar el páncreas rápidamente antes de la digestión de la colagenasa para evitar la digestión excesiva del islotes y mantener el ambiente libre de RNase durante los procedimientos de una sola célula. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la toma de imágenes de islotes y el cultivo para facilitar la visualización de la estructura del islote y examinar las respuestas celulares y la estimulación de fármacos.Después del desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación pancreática exploraran los mecanismos de desarrollo y regeneración del linaje de islotes, así como la progresión de la diabetes en los mamíferos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

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Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

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Evaluación del daño oxidativo en las células madre primarias del ratón/células madre en respuesta al daño ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

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MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...