Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Vi tackar det nationella centret för Protein Sciences, Beijing (Peking University) och Peking-Tsinghua Center för Life Science Computing-plattformen. Detta arbete stöds av ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2015CB942800), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31521004, 31471358 och 31522036) och finansiering från Peking-Tsinghua Center för Life Sciences till C.-R.X.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Peking University.
1. bukspottkörteln isolering
<ol><li>
För E17.5 (embryonala dag 17,5) embryon:
	<ol>
<li>Uppskatta embryonala dygn 0,5 baserat på tidpunkten när vaginal kontakten visas.</li>
		<li>Offra de dräktiga möss av CO2 administration. Spraya den buk pälsen med 70% alkohol.</li>
		<li>Göra en V-formad snitt med sax från det geni...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

I detta protokoll visade vi en effektiv och lätt-till-använda metod för att studera de encelliga uttryck profilerna av pankreas β-celler. Denna metod kan användas att isolera endokrina celler från embryon, neonatal och postnatal bukspottkörtlar och utföra encelliga transcriptomic analyser.
Det mest kritiska steget är isoleringen av enda β-celler i bra skick. Fullt perfunderade bukspottkörtlar svarar bättre på efterföljande matsmältningen. Otillräcklig perfusion, som vanligtvis ...

Bukspottkörteln är ett viktigt metaboliska organ hos däggdjur. Bukspottkörteln består av endokrin och exokrin fack. Pankreas endokrina celler, inklusive insulinproducerande β och glukagon-producerande α celler, klustret tillsammans i de Langerhanska öar och reglerar coordinately systemisk glukoshomeostasen. Dysfunktion av endokrina celler resultaten vid diabetes mellitus, som har blivit en viktig folkhälsofråga i hela världen.
Bukspottkörtelns endokrina celler härleds från Ngn3+ stamfäder under embryogenes1. Senare, under den perinatala perioden föröka de endokrina cellerna till formuläret omogna holmar. Dessa omogna celler fortsätter att utveckla och gradvis bli mogen holmar, som blivit rikt vaskulariserad för att reglera blod glukos homeostas i vuxna2.
Även om en grupp av transkriptionell faktorer har identifierats som reglerar β celldifferentiering, är exakt mognad stigen av β-celler fortfarande oklart. Dessutom innebär de β-cellen mognadsprocessen också regleringen av cell nummer expansion3,4 och generering av cellulära heterogenitet5,6. Dock har regleringsmekanismer av dessa processer inte varit väl studerat.
Encelliga RNA-sekvensering är en kraftfull metod som kan profilera cell subpopulationer och spåra cell härstamning utvecklingsmässiga vägar7. Dra nytta av denna teknik, centrala händelser som inträffar under bukspottskörteln holme utveckling kan dechiffreras på enskild cell nivå8. Bland de encelliga RNA-sekvensering protokoll kan Smart-seq2 generering av fullängds cDNA med förbättrad känslighet och noggrannhet, och användningen av standardreagens på lägre kostnad9. Smart-seq2 tar ungefär två dagar att konstruera ett cDNA bibliotek för sekvensering10.
Här föreslår vi en metod för isolering av fluorescens-märkt β celler från bukspottkörtlar av foster till vuxen Ins1 Armeringsputs transgena möss11, med hjälp av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), och utförandet av transcriptomic analyser på den enskild cell nivå, med hjälp av Smart-seq2 teknik (figur 1). Detta protokoll kan utvidgas till att analysera transcriptomes av alla pankreas endokrina celltyper i normala och patologiska och åldrande staterna.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

Pankreas endokrina celler, som är grupperade i små öar, reglerar blod glukos stabilitet och energiomsättning. De olika celltyper i holmar, inklusive insulin-utsöndrar β-celler, särskiljs från gemensamma endokrina föräldraparets under embryostadiet. Omogna endokrina celler expandera via cellförökning och mogna under en lång postnatal utvecklingstoxicitet. Mekanismerna bakom dessa processer är dock inte klart definierade. Encelliga RNA-sekvensering är en lovande metod för karakterisering av olika cellpopulationer och spåra cell härstamning differentiering vägar. Här, beskriver vi en metod för encelliga RNA-sekvensering av isolerade pankreas β-celler från embryonala, neonatal och postnatal bukspottkörtlar.

Bukspottkörtlar var dissekeras från embryonala, neonatal och postnatal möss (figur 2A och 2B). För möss äldre än postnatal dag 18 beror mag effekten på graden av perfusion; injektionen är därför det viktigaste steget för ö-isolering (figur 2 c-2E samt tabell 6). Så mycket kollagenas injicerades som var möjligt att fylla bukspottkörteln under dett...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Vi beskriver en metod för isolering av endokrina celler från embryon, neonatal och postnatal bukspottkörtlar följt av encelliga RNA-sekvensering. Denna metod tillåter analyser av pankreas endokrina härstamning utveckling, cell heterogenitet och transcriptomic dynamik.

Single-cell Transcriptomic analyser av mus bukspottkörtelns endokrina celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Denna metod kan ha svar viktiga frågor i bukspottskörteln holme fält om bukspottskörteln holme härstamning differentiering, mognad, och regenerering. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör insamling av enda bukspottskörteln holme celler för generering av hög kvalitet single cell RNA sekvensering data. Tillämpningen av denna teknik sträcker sig mot terapi av diabetes och de andra bukspottskörteln endokrina relaterade sjukdomar genom transkriptomic analys av bukspottskörteln endokrina enstaka celler på de patologiska villkor.Visuell demonstration av denna metod är kritisk eftersom infogningen av nålen i den smala gallgången i bukspottkörteln för perfusionen kan vara knepigt. För embryonal dag 17,5 embryon. Efter öppnandet av bukhålan, använd armbåge pincett för att överföra den viscerala vävnaden till en sex centimeter svart botten skålen som innehåller kalla PBS.Använd tes för att lossa bukspottkörteln från den viscerala vävnaden. Och placera bukspottskörteln vävnad i en 20 milliliter injektionsflaska som innehåller fem milliliter kall kollagenaslösning. För post natal dag noll till 15 möss, försiktigt dissekera alla lober i bukspottkörteln innan du placerar vävnaden i kollagenas.För post natal dag 18 till 60 möss, ta först bort xiphoid och extrahera tarmen till höger sida av bukhålan. Tryck vänster och höger mediala lober i levern till varje sida för att exponera gallblåsan och den gemensamma gallgången. Och kläm ihop tolvfingertarmen med ett par små kärlet klämmor vid övre och nedre lägen för att flankera platsen där gallgången kommer in i tolvfingertarmen.Därefter laddar en 5 milliliter spruta utrustad med en 30 gauge nål med kall kollagenaslösning. Och använd mikroskopet för att sätta in nålspetsen i gallblåsan. Manipulera nålen försiktigt och smidigt genom den gemensamma gallgången.Och tryck ned kolven för att genomsyra bukspottkörteln med en till fem milliliter av kollagenaslösningen enligt musens storlek. När alla lösningen har perfused, använd tövövärtor för att omedelbart överföra bukspottkörteln till en 20 milliliter injektionsflaska som innehåller fem milliliter färsk kall kollagenaslösning. När alla bukspottskörteln vävnad har samlats in, placera injektionsflaskan i en 37 grader Celsius vattenbad i tre minuter, följt av tre till fem minuter av mild skakning.Filtrera sedan den smälta produkten genom en 0,25 millimeter nylon sil i en ny 50 milliliter centrifugrör. Och använd en 20 milliliter spruta som innehåller iskall PBS för att noggrant tvätta silen. För post natal dag 18 till 60 bukspottkörtel, centrifug det filtrerade provet och resuspend vävnaden i 30 milliliter av kalla PBS.Sedan dekantera vävnaden suspensionen i en sex centimeter svart botten skålen, och använda en 200 mikroliter pipetten och en dissekerande mikroskop för att plocka holmarna för överföring till en 1,5 milliliter microcentrfuge rör som innehåller en liten volym av kall PBS. För embryonala dag 17,5 post natal dag 15 bukspottkörtel, centrifug den filtrerade bukspottskörteln vävnad och resuspend pelleten i trypsin-EDTA lösning för en fyra minuters inkubation i en 37 grader Celsius vattenbad. I slutet av inkubationen, försiktigt försöka betygsätta pelleten i en minut med en 200 mikroliterpipett, följt av tillsats av 0,5 gånger volymen av kallt fetalt bovint serum med en mild virvelning för att stoppa matsmältningen.Samla sedan upp smältan genom centrifugeringen och resuspend cellerna i 200 mikroliter AV FACS buffert i en 5 milliliter FACS-rör för sortering efter flödescytometri. För encellig plockning och lys, alikvoteras nyligen beredd cell lys buffert i åtta band PCR rör, och överföra en enda cell i varje. Vortexa proverna för att dra ut cellerna för frisättning av RNA, följt av centrifugering i 30 sekunder vid fyra grader Celsius, och omedelbar lagring på is.För omvänd transkription, inkubera lysaterna i tre minuter vid 72 grader Celsius följt av en minut på is. Kortfattat centrifugera proverna i 30 sekunder vid fyra grader Celsius och tillsätt 5,7 mikroliter av omvänd transkriptionsmix till varje prov för att få den totala volymen till 10 mikroliter för varje prov. Efter skonsam virvelning och centrifugering, ladda proverna i en termocyklare och starta det omvända transkriptionsprogrammet.För polymeraskedjereaktion förförstärkare, eller PCR, tillsätt 15 mikroliter PCR mix till varje prov som innehåller de första strängreaktionerna, följt av skonsam virvel- och centrifugering. Ladda sedan proverna i termocyklaren och starta PCR-programmet. För PCR rening, tillsätt 25 mikroliter av resuspended DNA rening pärlor till varje prov, och blanda väl genom att vortexa.Snurra sedan snabbt proverna i rumstemperatur för att samla vätskan samtidigt som du undviker att pärlorna sätts i spel. Placera proverna på ett lämpligt magnetiskt stativ efter fem minuter i rumstemperatur, försiktigt ta bort och kassera supernatanten när lösningen är klar. Tvätta pärlorna med två 30 sekunders tvättar i 200 mikroliter av nyberedda 80%etanol per tvätt.Och kassera den återstående etanol efter den andra tvätten. När pärlorna har lufttorkat, tillsätt 11 mikroliter av nukleasfritt vatten för att elera DNA-målet från pärlorna, följt av virvelning. Sedan snabbt centrifugera proverna, returnera proverna till magnetstativ tills lösningen är klar och överför 10 mikroliter av varje prov till ett nytt PCR-rör.Framgångsrikt förstärkt cDNA bör ha en full längd över 500 baspar, och berikas från 1,5 till två kilo baspar. Dessutom finns det vanligtvis en 500 till 600 bas par anrikning av cDNA observerats i insulin en RFP plus celler, som kan representera insulin avskrifter. Dock är cDNA-fragmenten nära 100 baspar primer-dimers, som vanligen orsakas av överdrivna primers och som måste avlägsnas genom att upprepa DNA-reningssteget.CDNA-fragmenten mellan 100 och 500 baspar representerar vanligtvis försämrad cDNA, som orsakas av dålig cellstatus eller regionproblem, såsom RNase-kontaminering och bör uteslutas. Efter reningen av cDNA biblioteken för sekvensering, cDNA sträcker sig från 250 till 450 baspar kan erhållas genom tillsats av DNA rening pärlor till den första och andra omgången av rening. Efter DNA-pärla rening, bör sekvensering kvalitetsresultatet vara större än 30 under sekvensering kvalitetsutvärdering.För att erhålla celler av hög kvalitet för nedströmsanalyser, celler med färre än 0,5 miljoner kartlagda läsningar eller med färre än 4, utesluts 000 påvisade gener, vilket underlättar karakteriseringen av olika grupper av celler och identifiering av gener som är heterogent uttryckta i olika grupper efter huvudkomponentanalys och hierarkisk klustring. Samtidigt försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att granska bukspottkörteln snabbt innan kollagenas matsmältningen för att undvika holme över matsmältningen och att upprätthålla RNase fri miljö under den enda cellen förfaranden. Efter denna procedur, andra metoder som holme imaging och kultur kan utföras för att underlätta visualisering av holme struktur och att undersöka cellulära svar och läkemedelsstimulering.Efter utveckling, denna teknik banade väg för forskare inom området för bukspottskörteln forskning för att utforska mekanismerna för holme härstamning utveckling och förnyelse, samt diabetes progression hos däggdjur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering av pluripotenta stamceller till NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreasstamfäder

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metoder för att testa endokrina störningar i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bedömning av oxidativ skada i de primära musokulära ytcellerna/stamcellerna som svar på ultraviolett-C (UV-C) Skada

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurala differentiering med hjälp av Single-cell kultur av mänskliga embryonala stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Multiplexerade Single cell mRNA sekvensering analys av mus embryonala celler

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Beredning av små RNA-bibliotek för sekvensering från tidiga musembryon

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...