Name: single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Biz Ulusal Merkezi Protein Bilimler, Pekin (Pekin Üniversitesi) ve Pekin-Tsinghua Merkezi için hayat bilgisi Computing Platform için teşekkür ederim. Bu eser Bakanlığı Bilim ve teknoloji Çin (2015CB942800), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31521004, 31471358 ve 31522036) ve Pekin-Tsinghua Merkezi'nden Yaşam Bilimleri için c-R.X. için finansman tarafından desteklenen

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Pekin Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. pankreas yalıtım
<ol><li>
E17.5 (embriyonik gün 17,5) embriyo için:
	<ol>
<li>Embriyonik gün 0,5 vajinal tak görüntülendiğinde zaman noktası bakarak tahmin ediyoruz.</li>
		<li>Hamile fareler CO2 yönetim tarafından kurban. Sprey % 70 alkol ile karın kürk.</li>
		<li>Genital bölge için kaburga uzanan üzerinden m...

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+the+beta+cell.">On the origin of the beta cell.</a> Genes &amp; Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level.">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice.">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li><li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling.">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li><li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+isolation+and+analysis.">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data:+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples.">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FactoMineR:+An+R+package+for+multivariate+analysis.">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li><li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016)</li><li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes.">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions.">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+Purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures.">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li></ol>

Bu protokol için tek hücreli ifade profilleri pankreas β hücrelerinin eğitim için etkili ve kullanımı kolay bir yöntemi gösterdi. Bu yöntem embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases endokrin hücrelerden izole etmek ve tek hücreli transcriptomic analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir.
En önemli adım tek β hücrelerinin yalıtım iyi durumda değil. Tam derin pancreases daha iyi sonraki sindirim için cevap. Genellikle dorsal pankreasta oluşur, yetersiz perfüzy...

Pankreas memelilerde yaşamsal metabolik bir organdır. Pankreas endokrin ve ekzokrin bölmeleri oluşur. Pankreatik endokrin hücreleri insülin üreten hücrelerin β ve glukagon üreten α hücreleri de dahil olmak üzere, birlikte adacıkları of Langerhans küme ve coordinately sistemik glikoz homeostazı düzenler. Disfonksiyon endokrin hücreleri sonuçlar diyabet mellitus, dünya çapında bir önemli halk sağlığı sorunu haline gelmiştir.
Endokrin pankreas hücreleri Ngn3 elde edilen+ ataları embriyogenez1sırasında. Daha sonra perinatal dönemde endokrin hücreleri için formu olgunlaşmamış adacıkları çoğalırlar. Bu olgunlaşmamış hücreleri devam geliştirmek ve yavaş yavaş zengin kan glikoz homeostazı yetişkin2düzenleyen skarların haline olgun adacıkları haline gelir.
Transkripsiyon faktörleri bir grup, β hücre farklılaşması düzenleyen tespit rağmen β hücrelerinin hassas olgunlaşma yolu hala belli değil. Ayrıca, β hücre olgunlaşma süreci de hücre sayı genişleme3,4 düzenlenmesi ve hücresel heterojenite5,6nesil içerir. Ancak, düzenleyici mekanizmaları bu süreçlerin de incelenmiştir değil.
Tek hücreli RNA-sıralama hücre altgrupları profil ve hücre lineage gelişim yolları7iz güçlü bir yaklaşımdır. Bu teknoloji, pankreas adacık geliştirme sırasında meydana gelen olayları tek hücre düzeyi8' de deşifre anahtar yararlanarak. Tek hücreli RNA-sıralama protokolleri arasında geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk ve daha düşük maliyet9standart reaktifler kullanımı tam uzunlukta cDNA nesil akıllı-seq2 sağlar. Akıllı-seq2 sıralama10için bir cDNA Kütüphanesi oluşturmak için yaklaşık iki gün alır.
Burada, floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak bir yöntem pancreases, fetal floresans etiketli β hücrelerinden yetişkin Ins1-RFP transgenik fareler11, yalıtım için önerdiğimiz ve transcriptomic performans analizleri tek hücre düzeyi, akıllı-seq2 teknolojisiyle (Şekil 1). Bu iletişim kuralı tüm pankreatik endokrin hücre tiplerinin normal, patolojik ve yaşlanma Birleşik Devletleri transcriptomes analiz etmek için genişletilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213873001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Lumar V12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Microplate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Sealing Mat</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-96-PCR-RD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Well PCR Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>P-02X8-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First-strand buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>Q121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD502</td>
			<td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD203</td>
			<td>Include 16 N6XX and 24 N8XX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td>
			<td>Advanced Analytical Technologies</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 
			4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 
			0.44 mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 &#215; HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR primers</td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Forward primer</td>
			<td>5&#39;-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Forward primer</td>
			<td>5&#39;-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ins2 Reverse primer</td>
			<td>5&#39;-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell transcriptomic analyses of mouse pancreatic endocrine cells

Adacıklar içinde kümelenir, pankreatik endokrin hücreleri kan glikoz istikrar ve enerji metabolizmasını düzenler. Adacıkları, insülin salgılayan β hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde ortak endokrin ataları embriyonik evre sırasında farklı. Olgunlaşmamış endokrin hücreleri hücre proliferasyonu ile genişletin ve gelişimsel bir uzun postnatal dönemde olgun. Ancak, bu işlemlerin altında yatan mekanizmaları açıkça tanımlı değil. Tek hücreli RNA-sıralama farklı hücre popülasyonlarının ve izleme hücre lineage farklılaşma yollar karakterizasyonu için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, tek hücreli RNA-sıralama izole pankreas β hücre embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases için bir yöntemi açıklanmaktadır.

Pancreases embriyonik, yenidoğan ve postnatal fareler disseke (Şekil 2A ve 2B). Doğum sonrası gün 18 büyük fareler için sindirim etkisi perfüzyon derecesine bağlıdır; Bu nedenle, enjeksiyon adacık yalıtım için en önemli adımdır (Şekil 2C-2E ve Tablo 6). Kadar collagenase pankreas bu adımı sırasında doldurmak mümkün olduğu kadar enjekte...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells at JoVE.com

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Bu yöntem pankreas adacık soy farklılaşması hakkında pankreas adacık alanında anahtar sorulara cevap olabilir, olgunlaşma, ve rejenerasyon. Bu tekniğin ana avantajı yüksek kaliteli tek hücreli RNA sıralama veri üretimi için tek pankreas adacık hücrelerinin toplanması sağlar. Bu tekniğin uygulanması patolojik koşullar üzerinde pankreas endokrin tek hücrelerin transkripsiyonomik analizi ile diyabet ve diğer pankreas endokrin ile ilgili hastalıkların tedavisi doğru uzanır.Perfüzyon için pankreasDar safra kanalına iğne nin takılması zor olabilir gibi bu yöntemin görsel gösteri zordur. Embriyonik gün 17.5 embriyolar için. Karın boşluğu açıldıktan sonra, soğuk PBS içeren altı santimetre siyah alt çanak visseral doku aktarmak için dirsek cımbız kullanın.Visseral doku dan pankreas ayırmak için forceps kullanın. Ve pankreas dokusunu 20 mililitrelik bir şişeye yerleştirin beş mililitre soğuk kollajenaz solüsyonu. Doğum sonrası gün sıfır dan 15 fareiçin, dikkatle kollajenaz içine doku yerleştirmeden önce pankreas tüm lobları incelemek.Doğum sonrası gün için 18-60 fareler, ilk ksifoid kaldırmak ve karın boşluğunun sağ tarafında bağırsak ayıklayın. Safra kesesi ve ortak safra kanalı ortaya çıkarmak için her iki tarafa karaciğerin sol ve sağ medial loblar itin. Ve çift°yoleni, safra kanalının duodenuma girdiği yeri kuşatmak için üst ve alt konumlardaki bir çift küçük damar kelepçesiyle kenetle.Daha sonra, soğuk kollajenaz çözeltisi ile 30 gauge iğne ile donatılmış bir 5 mililitreş yükleyin. Ve safra kesesi içine iğne ucu eklemek için mikroskop kullanın. Dikkatle ve sorunsuz ortak safra kanalı ile iğne işlemek.Ve farenin boyutuna göre kollajenaz çözeltisi bir ila beş mililitre ile pankreas perfuse için piston depress. Çözeltinin tamamı perfüzyon edildiğinde, pankreası hemen beş mililitre taze soğuk kollajenaz çözeltisi içeren 20 mililitrelik bir şişeye aktarmak için forseps kullanın. Tüm pankreas dokusu toplandığında, üç dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu nda şişe yerleştirin, nazik sallayarak üç ila beş dakika takip.Daha sonra sindirilmiş ürünü 0,25 milimetrelik naylon süzgeçten 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. Ve iyice süzgeç yıkamak için buz gibi PBS içeren 20 mililitrelik şırınga kullanın. Doğum sonrası gün için 18-60 pankreata, filtreli örnek santrifüj ve soğuk PBS 30 mililitre doku resuspend.Sonra altı santimetre siyah alt çanak içine doku süspansiyon decant, ve soğuk PBS küçük bir hacim içeren 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine transfer için adacıkları almak için 200 mikrolitrelik pipet ve bir diseksiyon mikroskop kullanın. Embriyonik gün için 17.5 doğum sonrası gün 15 pankreata, filtrelenmiş pankreas dokusu santrifüj ve 37 derece santigrat su banyosunda dört dakikalık kuluçka için tripsin-EDTA çözeltisi pelet resuspend. Kuluçka sonunda, yavaşça 200 mikrolitrelik pipet ile bir dakika için pelet oranı deneyin, sindirim durdurmak için nazik bir girdap ile soğuk fetal sığır serum 0,5 kat hacmi nin eklenmesi izledi.Sonra santrifüj tarafından sindirimi toplamak ve akış sitometri tarafından sıralamak için 5 mililitreLIK FACS tüp FACS tampon 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Tek hücre toplama ve lysis için, aliquot taze hazırlanmış hücre lisis tampon sekiz şerit PCR tüpleri içine, ve her içine tek bir hücre aktarın. RNA'nın salınımı için hücreleri dinlendirmek için örnekleri girdap, ardından 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj ve buzda hemen depolanma.Ters transkripsiyon için, 72 santigrat derece üç dakika boyunca lysates kuluçka ve buz üzerinde bir dakika. Numuneleri kısaca 4 derece santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve her numuneiçin toplam hacmi 10 mikrolitreye çıkarmak için her numuneye 5,7 mikrolitre ters transkripsiyon karışımı ekleyin. Nazik girdap ve santrifüjden sonra, örnekleri bir termocycler'a yükleyin ve ters transkripsiyon programını başlatın.Polimeraz zincir reaksiyonu preamplifikasyonu veya PCR için, ilk iplikçik reaksiyonlarını içeren her numuneye 15 mikrolitre PCR karışımı ekleyin ve ardından nazik girdap ve santrifüj ekleyin. Daha sonra numuneleri termocycler'a yükleyin ve PCR programını başlatın. PCR arınması için, her numuneye 25 mikrolitre resuspended DNA saflaştırma boncukekleyin ve girdap ile iyice karıştırın.Daha sonra boncukların yerleşmesini önlerken sıvıyı toplamak için numuneleri oda sıcaklığında hızlıbir şekilde döndürün. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, numuneleri uygun bir manyetik standa yerleştirin, çözelti temizolduğunda süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. Boncukları 200 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanolte iki 30 saniyelik yıkama ile yıkayın.Ve ikinci yıkamadan sonra kalan etanol atın. Boncuklar hava kuruduktan sonra, 11 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve ardından dna hedefini boncuklardan uzaklaştırın ve ardından girdap lar ekleyin. Daha sonra numuneleri hızlı bir şekilde santrifüj edin, çözüm temizolana kadar numuneleri manyetik standa geri verin ve her numunenin 10 mikrolitresini yeni bir PCR tüpüne aktarın.Başarıyla güçlendirilmiş cDNA 500 baz çiftleri üzerinde tam uzunlukta olmalı ve 1,5 ila iki kilo baz çiftleri zenginleştirilmiş olmalıdır. Ayrıca, genellikle insülin bir RFP artı hücrelerde gözlenen cDNA 500-600 baz çifti zenginleştirme vardır, hangi insülin transkript temsil edebilir. Ancak, 100 baz çiftine yakın cDNA parçaları genellikle aşırı astarlardan kaynaklanan ve DNA arınma adımı tekraredilerek çıkarılması gereken astar dimerlerdir.100 ile 500 baz çifti arasındaki cDNA parçaları genellikle bozulmuş cDNA'yı temsil eder, bu da rnase kontaminasyonu gibi kötü hücre durumu veya bölge sorunlarının neden olduğu ve dışlanması gereken cDNA'yı temsil eder. CDNA kütüphanelerinin diziliş için saflaştırılmasından sonra, 250 ile 450 baz çifti arasında değişen cDNA, dna arınma boncuklarının birinci ve ikinci tur saflaştırmaya eklenmesiyle elde edilebilir. DNA boncuk arınması sonra, sıralama kalite puanı sıralama kalite değerlendirmesi sırasında 30'dan büyük olmalıdır.Downstream analizleri için yüksek kaliteli hücreler elde etmek için, 0,5 milyondan az eşlenen okumaya veya 4.000'den az tespit edilmiş gene sahip hücreler dışlanır, bu da farklı hücre gruplarının karakterizasyonunu ve temel bileşen analizi ve hiyerarşik kümelenmeden sonra farklı gruplarda heterojen olarak ifade edilen genlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu prosedürü çalışırken, bu sindirim üzerinde adacık önlemek ve tek hücreli işlemler sırasında RNase ücretsiz bir ortam korumak için kollajenaz sindirim önce hızlı bir şekilde pankreas perfüzyon hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, adacık yapısının görselleştirilmesini kolaylaştırmak ve hücresel yanıtları ve ilaç stimülasyonunun incelenmesi için adacık görüntüleme ve kültür gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.Geliştirme den sonra, bu teknik adacık soy gelişimi ve rejenerasyon mekanizmaları keşfetmek için pankreas araştırma alanında araştırmacılar için yol açtı, memelilerde diyabet ilerlemesi gibi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...