Name: rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Vi takke Susanne Lopes Rasmussen og Solvej Kolbjørn Jensen for deres tekniske bistand og for håndtering af kliniske prøver. Dette projekt er en del af EbolaMoDRAD-konsortiet, der har modtaget støtte fra det nyskabende medicin initiativ 2 fælles tilsagn under grant aftale N ° 115843. Dette fællesforetagende modtager støtte fra EUs Horisont 2020 forskning og innovation program og EFPIA.

Udvalget om biomedicinsk forskning etik og region hovedstaden har givet informeret samtykke, og alle metoder beskrevet her er fritaget fra en anmeldelse af etiske komité-systemet i overensstemmelse med den danske lov om assay udviklingsprojekter.
1. forberedelse af blod samling vakuumrør for Virus inaktivering og hurtige NA udvinding
Advarsel: Den buffer, der bruges til denne protokol indeholder guanidinium kaliumthiocyanat (GITC) og en nonionisk overfladeaktivt sto...

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood.">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li><li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015.">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li><li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease.">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests.">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li><li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis.">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li><li>Schmitz, H., K&#246;hler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever.">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li><li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

I denne rapport beskriver vi en sikker, hurtig og enkel manuel sengelamper NA ekstraktion metode til downstream molekylære påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. Metoden beskrevet NA udvinding blev udviklet udføres direkte på hele blodprøver indsamlet i vakuum blod indsamling rør indeholdende lysis/binding buffer (Table of Materials)7. Denne specifikke buffer inaktiverer EBOV7 og det kritiske element i metoden. Efter samlinge...

I virus udbrud situationer, når patienter er begrænset til isolation hospitalsafdelinger eller hvor der er behov for en hurtig diagnose, er en sikker, enkel og præcis punkt af pleje molekylære diagnose afgørende for den patient pleje og risiko indeslutning. De to seneste viral udbrud af Ebola virus (EBOV) i Vestafrika (2013) og Zika virus i Sydamerika (2015), har øget interessen for forbedret punkt af pleje Molekylær diagnostisk test, såsom reverse transkription loop-medieret isotermiske forstærkning (RT-lampe)1,2 og recombinase-polymerase forstærkning (RPA)3,4. Både RT-lampe og RPA er hurtige, følsomme og specifikke molekylære test, der kan udføres på forenklet prøve præparater. Zika virus, er RT-lampe blevet kombineret med en lateral flow analyse (LFA), der kan spore Zika virus i ikke renset hele blodprøver inden for 30 min1; men for EBOV, der er klassificeret som en risiko gruppe 4 patogen og er meget smitsom, prøverne skal håndteres under biosikkerhed niveau 4 (BSL-4) betingelser og inaktiveret før nogen sikker diagnostiske procedurer kan udføres.
Forenklet inaktivering metoder til EBOV, såsom tilføjelsen af lysis buffere til prøve2,3,4,5, blev brugt under udbrud. disse metoder kræver dog håndtering på BSL-4 betingelser med laboratorieudstyr, som BSL-3 biosikkerhed kabinetter, centrifuger, varme blokke og pipetter, på et minimum. Dette udstyr er normalt ikke til stede i isolation afdelinger eller i felthospitaler. For at overvinde denne udfordring, man har forsøgt at udføre diagnosticeringen i kufferter3og flere bærbare enheder og maskiner har været udviklet [f.eks.en bærbar enhed for nukleinsyre (NA) udvinding]6. Men EBOV-positive prøver stadig skal deaktiveres, før disse enheder kan bruges.
Vi har tidligere rapporteret en hurtig sengelamper virus inaktivering metode til EBOV7, Vaccinia virus og Cowpox virus8 ved tilsætning af en kommerciel lysis/binding buffer til almindelige vakuum blod indsamling rør, giver mulighed for direkte overførsel af blod fra patienten til inaktivering buffer7. Denne direkte og umiddelbar inaktivering i et lukket system eliminerer behovet for håndtering af prøver ved hjælp af en fuldkommen indeslutning, som BSL-4 betingelser7, og prøverne kan håndteres under normale BSL-2. Denne inaktivering metode er kompatibel med flere NA udvinding systemer, som robotter og hånd rensning kits7; disse metoder kræver dog laboratorieudstyr, som robotter, centrifuger og elektricitet, der ikke er altid til stede i Feltindstillinger eller inde i isolation hospitalsafdelinger.
I denne rapport beskriver vi en sikker, hurtig og forenklet manuel NA ekstraktion metode til efterfølgende molekylære påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. NA ekstraktion metode kræver ikke noget udstyr end en magnet/magnetiske indehaveren. Ingen centrifuger, varme blokke eller elektricitet er nødvendig for NA udvinding. Derfor, denne metode er ikke afhængige af laboratoriefaciliteter og nemt kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler, i isolation hospitalsafdelinger eller med lav-ressource-indstillinger). NA ekstraktion metode er hurtig og enkel og kan anvendes direkte i enhver downstream NA test, såsom qPCR, RT-qPCR, lampe eller RT-lampe. Når denne NA ekstraktion metode kombineres med lampe og en bærbar batteri-drevet isotermisk instrument, kan en bedside diagnose opnås indenfor 40 min i samlingen blod.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1081">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:544px;">Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td>
			<td style="width:251px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368861</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plus Blood Collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">362725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUER LOK syringe (3 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Butterfly needle with small-bore extension tubing</td>
			<td style="width:251px;">J&#248;rgen Kruuse A/S</td>
			<td style="width:119px;">121714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% Virkon&#160;</td>
			<td>Nomeco A/S</td>
			<td style="width:119px;">849265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">03246752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">3038505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag&#8482;-5 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette (3.5 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#8482; Samco&#8482; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

Hurtig diagnosticering af en infektion er afgørende for udbruddet forvaltning, risiko indeslutning og patientpleje. Vi har tidligere vist en metode til hurtig sengelamper inaktivering af Ebola virus under udtagning af blodprøve for sikker nukleinsyre (NA) test ved at tilføje en kommerciel lysis/binding buffer direkte i vakuum blod indsamling rør. Brug denne sengelamper inaktivering fremgangsmåde, har vi udviklet en sikker, hurtig og forenklet sengelamper NA ekstraktion metode til efterfølgende påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. NA udvinding udføres direkte i blodet indsamling rør og kræver ingen udstyr eller elektricitet.
Når blodet er indsamlet i lysis/binding buffer, indholdet blandes ved at vende røret ved håndkraft, og blandingen er udruget i 20 min. ved stuetemperatur. Magnetisk glas partikler (FUP) er føjet til røret, og indholdet blandes ved at vende samling røret ved håndkraft. De flerårige udviklingsprogrammer er derefter indsamles på siden af blod samling røret ved hjælp af en magnetisk indehaveren eller en magnet og en elastik. De flerårige udviklingsprogrammer er vasket tre gange, og efter tilsætning af eluering buffer direkte i collection tube, NAs er klar til NA tests, såsom qPCR eller isotermisk loop forstærkning (lampe), uden fjernelse af FUP fra reaktionen. NA ekstraktion metode er ikke afhængig af nogen laboratoriefaciliteter og nemt kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler og hospitalsafdelinger isolation). Når denne NA ekstraktion metode kombineres med lampe og en transportabel instrument, får en diagnose indenfor 40 min i samlingen blod.

Protokollen præsenteres her er enkle og effektive og kan anvendes bredt på enhver Molekylær analyse skal gennemføres på infektiøs hele blodprøver inaktiveres med lysis/binding buffer. Arbejdsgangen for blod inaktivering og NA udvinding er vist i figur 1, herunder udarbejdelse af blod samling vakuumrør7 (figur 1A), blod samling7 (figur 1B), NA ud...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Vi præsenterer her, en protokol til hurtig virus nukleinsyre udvinding fra fuldblod virus-inaktiveret. Ekstraktionen udføres direkte i blodet indsamling rør og kræver ingen udstyr eller elektricitet. Metoden er ikke afhængige af laboratoriefaciliteter og kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler).

Hurtig, sikker og simpel manuel sengelamper nukleinsyre udvinding til påvisning af Virus i blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flowcytometri-fluorescens In situ Hybridisering (LNA flow-FISH): En metode til bakteriel små RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En simpel og effektiv tilgang til Construct Mutant vacciniavirus Vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

A Simple flowcytometriske metode til at måle glukoseoptagelse og Glucose Transporter Udtryk for Monocyt undergrupper i fuldblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetisk omrører metode til påvisning af<em&gt; trikiner</em&gt; Larver i Muscle Prøver

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering af humane monocyt delmængder af fuldblod Flow flowcytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...