Name: syringe-injectable mesh electronics for stable chronic rodent electrophysiology
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00
Duration: 9 min 58 s
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C.M.L. reconnaît la prise en charge de ce travail par l’Air Force Office of Scientific Research (FA9550-14-1-0136), un prix Harvard Université des Sciences physiques et ingénierie accélérateur et un instituts nationaux de santé directeur de Pioneer Award) 1DP1EB025835-01). T.G.S. reconnaît la prise en charge par le Department of Defense (DoD) à travers le Programme National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. reconnaît la prise en charge de bourse de l’American Heart Association (16POST27250219) et la voie à l’indépendance Award (Parent K99/R00) de l’Institut National sur le vieillissement de la National Institutes of Health. Cette œuvre était jouée en partie au Centre universitaire de Harvard pour le systèmes nanométriques (CNS), un membre de la National Nanotechnology coordonnée Infrastructure réseau (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation sous NSF ECCS prix n 1541959.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Toutes les étapes de la fabrication et l’utilisation de l’électronique de la maille sont importants, mais quelques-uns sont particulièrement critiques. Avant de relâcher l’électronique de maille de leur plaquette, il est essentiel d’oxyder la surface pour faire les mailles facilement suspendus dans une solution aqueuse (étape 1.6.1). Si cette étape est ignorée, les mailles généralement flottant à la surface de l’eau, ce qui les rend difficiles à charger dans les aiguilles, et si ils peuvent être chargés, ils collent souvent aux côtés des aiguilles verre, nécessitant de grands volumes (> 100 µL) pour l’injection. Échec d’oxyder la surface avant la libération, par conséquent, en général signifie que les mailles ne peuvent être utilisés et la fabrication doivent être re-joués depuis le début. Une autre étape critique est la flexion le maillage électronique « tige » à ~ 90° pendant les e/s interface (étape 4.3). Si l’angle est inférieur à 90°, puis tous les pads de I/O 32 ne tiendra pas dans le connecteur ZIF ; certains devront être couper l’extrémité pour permettre l’insertion, en réduisant le nombre d’électrodes connectées. Le processus doit aussi faire doucement pour prévenir la tige de se casser.
La conception de maillage électronique peut être personnalisée pour diverses applications en modifiant les masques et en utilisant le même procédé de fabrication décrit dans la Figure 2. Par exemple, alors que les sondes de maillage électronique utilisés pour enregistrer les données dans la Figure 9 ont été conçus pour avoir 32 électrodes d’enregistrement couvrent la souris hippocampe et le cortex somatosensoriel primaire, l’emplacement des électrodes dans le maillage ultra-flexible peut être sélectionné pour cibler n’importe quel cerveau région (s) ou plus grandes électrodes pour la stimulation peuvent être constituée de27. La même procédure de structure et de la fabrication de maille de base sont conservées, mais le placement des électrodes et la conception sont ajustées pour répondre aux besoins de l’étude. Enquêteurs devraient faire preuve de prudence, cependant et toujours tester que dessins modifiés peuvent être injectés facilement à travers les aiguilles prévues. Petits changements à la déformation mécanique de maillage électronique peut avoir des effets substantiels sur l’injectabilité. Un tel exemple est qu’un angle de 45° entre transversales et longitudinales SU-8 rubans donne une sonde électronique de maille qui peut être injectée simpliste mais qui se froisse et obstrue les aiguilles21entraîne un angle de 90°.
Mesurer l’impédance des électrodes enregistrement est utile pour le dépannage. Une électrode de Pt 20 µm de diamètre circulaire devrait avoir une magnitude de l’impédance près 1 MΩ lorsqu’il est mesuré à une fréquence de 1 kHz en vivo ou en 1 x PBS29. Une impédance sensiblement plus grande que cela implique que l’électrode est pas exposé, comme peut se produire si elle est contaminée par des résidus de résine photosensible ou pas électriquement connecté. Ce dernier peut se produire si, par exemple, poussière sur le masque photo pendant les PL qui interconnecte les conduit à un décalage dans l’UA, ou si une des touches I/O maille n’est pas contactée par les broches du connecteur ZIF au cours de l’interfaçage de I/O. Une magnitude de l’impédance à peu près la moitié de la valeur attendue suggère que le canal peut être court-circuités à celle adjacente, créer un circuit de deux impédances électrode parallèlement les uns aux autres. Les valeurs d’impédance mesurée servent de guide pendant le dépannage ; combiné avec la microscopie optique des sondes électroniques maille, la source du problème peut généralement être identifiée et corrigée en conséquence dans la prochaine fabrication exécuter ou la tentative d’interfaçage de I/O.
L’utilisation de seringue-injectable maillage électronique pour les études de toxicité aiguë est limitée à cet activité fortification unitaires n’est pas habituellement observée jusqu'à 1 semaine post injection27, bien que des travaux récents (non publiée) montrent que ce problème est facilement vaincu. Des facteurs déterminants du temps requis pour voir l’activité de fortification sont la maille design, le volume du liquide injecté dans le cerveau ainsi que de l’électronique de la maille et le diamètre de l’aiguille utilisée pour l’injection, comme ceux-ci affectent le degré des lésions tissulaires au cours de la l’injection et le taux de guérison. Volumes d’injection grande peuvent être requis si l’électronique de maille n’est pas traités avec le plasma d’oxygène avant la publication dans Ni etchant ; autrement dit, si le maillage n’est pas hydrophile, il peut adhérer à l’aiguille de verre. Parfois, les mailles ont des défauts qui mènent à la flexion mécanique qui les rendent difficiles à injecter. Lors du chargement de l’électronique de la maille, il est important de vérifier que des maillages sont déplacent facilement et en douceur au sein de l’aiguille (comme sur la vidéo supplémentaire 1). Si ce n’est pas le cas, une sonde électronique de maillage différent doit être utilisée. Meilleurs résultats pour interfacer les neurones sans soudure seront atteint avec l’idéal injecter des volumes de 10 à 50 µL par 4 mm de longueur de maille injectée. Des résultats plus récents avec des sondes d’électronique plus fines maille injectée et/ou petites AIG capillaire de diamètre (aussi petit que le diamètre intérieur de 150 µm, 250 µm de diamètre extérieur) montrent que seule unité de dopage peut être observée de peu de temps après l’injection (mesures aiguës) Grâce à des temps plus longs. Fichiers de conception du masque pour ces structures fines de la maille sont disponibles sur demande ou sur le site de ressource, meshelectronics.org. Nous estimons que le rendement global de notre en vivo maille injection procédures avec 400 µm de diamètre intérieur (650 µm de diamètre extérieur) aiguilles à environ 70 %, même si le rendement est plus proche de 80 à 90 % pour nos travaux plus récents avec 150 µm de diamètre intérieur (250 µm diamètre extérieur de ) aiguilles. Les raisons les plus fréquentes de l’échec sont (1) que le maillage injecte-t-il pas sans à-coup, entraînant œdème cérébral des volumes important d’injection dans le cerveau, rupture de maille (2) au cours de la manipulation manuelle requise dans les entrées/sorties, interface de procédure et (3) saignement d’endommager un vaisseau sanguin pendant l’injection. Endommager un vaisseau sanguin au cours de l’injection est rare (la cause de moins de 10 % d’échecs) et pourrait être réduite davantage en utilisant la chirurgie guidée par l’image. Notons aussi que les dommages des vaisseaux sanguins sont une limite commune de toutes les procédures impliquant la pénétration du tissu cérébral, y compris l’injection de particules virales pour la transfection, l’implantation des sondes cérébrales rigide et l’injection de l’électronique de la maille.
Maillage électronique sondes sont capables de stablement enregistrer et suivre les mêmes neurones individuels au moins les mois aux échelles de temps de l’année et n’évoquent presque aucune réponse immunitaire chronique, comme le montre la Figure 9 et Figure 10, respectivement. Cela représente un avantage significatif par rapport aux électrodes de profondeur de convention, qui souffrent souvent de diminution des amplitudes de spike, signaux instables et une inflammation chronique au cours de la longue durée d’enregistrement des expériences14, 15. en outre, l’électronique de maille ont l’avantage qu’ils peuvent être laissés dans le tissu lors de coupes histologiques, la coloration, et d’imagerie, contrairement aux sondes classiques, qui sont trop rigides et doivent donc être enlevés avant l’histologie analyses. Par conséquent, maillage électronique permettre la capacité unique d’analyse immunohistochimique permet d’étudier précisément l’environnement cellulaire entourant chaque site d’enregistrement.
Le protocole présenté ici s’ouvre-up excitant de nouvelles opportunités en neurosciences. La méthode mini-invasive de la livraison et l’intégration transparente de maillage électronique avec tissu cérébral réduit au minimum la perturbation de circuits neuronaux et évite la réponse immunitaire chronique, pouvant être bénéfique pour la plupart des types d’expériences d’enregistrement neuronaux chronique. La capacité de maillage électronique pour enregistrer et suivre les mêmes neurones seul pour de longues périodes sera particulièrement intéressant pour les chercheurs qui cherchent à établir une corrélation entre activité de fortification à l’échelle de la milliseconde par mois à l’année longue des processus comme le vieillissement, la pathogénie de la maladie du cerveau, ou cerveau développement16,18. En outre, il existe des opportunités importantes pour étendre et personnaliser ce protocole, telles que l’ajout de composants électroniques actifs sur la scène-tête de PCB pour implémenter des fonctionnalités comme numérique, multiplexage8,35, sans fil communication de36,35,37et35, conjointement par injection de cellules souches ou des polymères avec l’électronique de maille pour faciliter tissue regeneration18,38, de traitement du signal 39et incorporant des nanofils effet transistors de champ (NW-FETs) en maillage électronique pour très localisée et cerveau multifonctionnel sondes24,29,40,41 ,,42.

Le développement d’outils capables de cartographier le cerveau avec une résolution unique-neuron est d’une importance cruciale pour les neurosciences et la neurologie. Technologies non invasives pour les études neurales comme électroencéphalographie (EEG), magnétoencéphalographie (MEG) et imagerie de résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) se sont avérés utiles pour corréler l’activité cérébrale avec comportement chez les humains1, 2, mais ils n’ont pas la résolution spatio-temporelle nécessaire pour étudier la structure et la dynamique des réseaux neuronaux à leurs fondamentaux micromètre et millisecond balances, respectivement3,4. Certaine expression (ECoG) des sondes et des méthodes d’imagerie optiques à l’aide de colorants sensibles au voltage ont réussi à enregistrer unitaires fortification activité in vivo5,6, mais ils sont généralement efficaces que près de la surface du cerveau, limite l’application à l’étude des régions cérébrales superficielles. En revanche, les sondes électriques implantables peuvent mesurer électrophysiologie single-neurone en se déplaçant librement animaux de pratiquement n’importe quelle région du cerveau sans besoin de marquage fluorescent, ce qui les rend indispensables aux neurosciences au niveau des systèmes, en particulier comme les techniques de microfabrication de l’industrie des semi-conducteurs ont poussé canal compte dans les centaines de milliers3,7,8,9. En vertu de ces capacités, implantables sondes électriques ont fait de nombreuses et importantes contributions aux neurosciences et neurologie, y compris des études fondamentales de traitement dans le système visuel10, le traitement de neurologique de l’information troubles comme la maladie de Parkinson,11et la démonstration des interfaces cerveau-machine (IMC) pour prothèses avancé12,13.
Néanmoins, l’instabilité à long terme que qui se manifeste comme diminution des amplitudes de spike et signaux instables sur des échelles de temps des semaines aux mois14,15 a limité l’applicabilité des sondes implantables à l’étude de relativement courte durée phénomènes, laissant des questions telles que le développement et le vieillissement cérébral dans une large mesure sans réponse. Les limitations dans l’instabilité à long terme sont le résultat d’un déséquilibre entre les sondes classiques et tissu cérébral dans la taille, la mécanique et topologie14,15,16,17,18. En termes de taille, alors que les synapses neuronales et les corps cellulaires sont environ une dizaines de nanomètres à quelques dizaines de micromètres de diamètre19, respectivement, les sondes traditionnelles sont souvent nettement plus grandes, dans le cas des matrices de microélectrodes silicium > 4 fois la taille d’un seul neurone corps cellulaire7,8. La taille relativement importante de ces sondes peut-être perturber la structure naturelle et la connectivité du dense tissu neural, contribuant ainsi à système immunitaire chronique et perturber les circuits neuronaux à l’étude. En termes de propriétés mécaniques, les sondes traditionnelles sont considérablement plus rigides que le tissu neural extrêmement doux, dans lequel ils sont implantés ; sondes même « flexibles » de 10 à 20 µm feuilles épaisses de polyimide sont au moins 100.000 fois plus rigides que le tissu de cerveau20,21. Ce décalage dans la rigidité de flexion provoque motion relative au cisaillement entre les tissus sonde et le cerveau, conduisant à unitaires non fiable de suivi durant les enregistrements étendus et induisant une gliose chronique sur le site d’implantation. Enfin, la structure topologique de sondes cérébrales conventionnelle exclut nécessairement un volume solide du tissu. Tel décalage dans la topologie perturbe la connectivité des circuits neuraux, s’oppose à la distribution des neurones, cellules gliales et les vaisseaux sanguins dans le cerveau tissu22interpenetrated (3D) naturelle en trois dimensions et entrave le transport 3D de signalisation des molécules23. Ensemble, ces lacunes des sondes classiques ont fait la compatibilité à long terme recherchée pour des applications cliniques et des études de neurosciences longitudinale au niveau de single-neurone en deçà.
Pour pallier ces insuffisances, nous avons cherché à brouiller la ligne entre les systèmes neurones et électroniques en mettant au point un nouveau paradigme de sondes neuronales « tissus-like » appelé maillage électronique16,21,24. Maillage électronique aborde les questions correspondantes ci-dessus dans la taille, la mécanique et topologie en incorporant des caractéristiques (1) structurales de la même nanomètre à l’échelle du micromètre taille du tissu neural, propriétés (2) mécaniques similaires à celles du tissu cérébral et (3) un 3D topologie de macroporeux qui est > 90 % open space et accueille ainsi l’interpénétration de neurones et de la diffusion des molécules à travers l’environnement extracellulaire. Maillage électronique sondes peuvent être livrés avec précision à certaines régions du cerveau grâce à une seringue et une aiguille, causant des dommages aigus minimal tout en implanter même dans les régions de cerveau profond21,25. Axones et soma neuronale montrent s’interpénètrent la structure ouverte de maillage 3D électronique sonde après l’injection semaines, créant ainsi une interface homogène et exempt de gliose entre enregistrement électronique et qui entourent le cerveau tissu21 , 26 , 27. ces particularités ont permis à maillage électronique sondes suivre stablement fortification de l’activité de neurones individuels mêmes pendant au moins une année calendrier27. En outre, la fabrication de l’électronique de maillage issu de photolithographie (PL) offre évolutivité élevée du nombre d’électrodes qui peuvent être incorporés, avec canal démontrée compte jusqu'à 128 électrodes par sonde à l’aide de la lithographie par simple contact masque 28 et une conception plug-and-play d’entrée/sortie (e/s) permet une connexion électrique rapide périphériques électroniques sans équipement spécialisé29.
Un large éventail d’études peut-être bénéficier de maillage électronique intégrant de protocoles de mesure. Plupart enregistrement intracortical expériences pourraient bénéficier de la procédure d’implantation minimalement invasive maillage électronique par injection seringue, la réponse immunitaire réduite considérablement après l’implantation, et la possibilité de quitter maillage électronique en la tissu au cours d’histologie ultérieur et immunostaining pour une analyse précise de l’environnement biologique entourant chaque site d’enregistrement. Expériences d’enregistrement chronique dérivent en particulier valeur de la capacité unique de maillage électronique pour suivre un grand nombre de neurones individuels pendant des mois aux années. Cette fonctionnalité offre des possibilités d’études avec une résolution de single-neurone qui étaient précédemment irréaliste, par exemple, des études longitudinales de vieillissement des circuits neuraux, enquêtes du cerveau en développement et des enquêtes sur la pathogenèse de transmissibles16.
Dans le présent protocole, les auteurs décrivent toutes les principales étapes d’une expérience d’enregistrement neuronaux typique de souris à l’aide de la seringue-injectable maillage électronique (voir Figure 1). Étapes décrites comprennent la fabrication de l’électronique de maille dans un éventuel processus axés sur les PL standard dans de nombreuses universités, chargeant le maillage électronique dans aiguilles capillaires standards, injection stéréotaxique du maillage électronique en vivo, connexion de la Mesh I/O pour instrumentation standard interfaces, sessions d’enregistrement restreints ou librement mobiles et les coupes histologiques du tissu cérébral contenant le maillage électronique. Certains chercheurs utilisant le maillage électronique uniquement pour les études d’histologie ne peuvent exiger qu’interface électrique et un enregistrement, auquel cas ils peuvent ignorer ces étapes. Après en se familiarisant avec ce protocole, les enquêteurs devraient avoir toutes les connaissances nécessaires pour utiliser le maillage électronique dans leurs propres expériences.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Motorized stereotaxic frame</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MTM-3</td>
			<td>For mouse stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>512-channel recording controller</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3004</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHD2132 amplifier board</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3314</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHD2000 3-ft ultra thin SPI interface cable</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3213</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TV-150&#160;STD</td>
			<td>Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafers</td>
			<td>Nova Electronic Materials</td>
			<td></td>
			<td>3&#34; P &#60;100&#62; .001-.005 ohm-cm 356-406&#956;m Thick 
			Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &#38; 
			6,000 A&#176;&#177;5% Wet Thermal Oxide on both sides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks (chrome on soda lime glass)</td>
			<td>Advance Reproductions</td>
			<td></td>
			<td>Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator</td>
			<td>Sharon Vacuum</td>
			<td></td>
			<td>Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000.5 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 mask aligner</td>
			<td>Karl Suss Microtec AG</td>
			<td></td>
			<td>Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOR3A lift-off resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipley 1805 positive photoresist</td>
			<td>Microposit, The Dow Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-CD-26 positive photoresist developer</td>
			<td>Microposit, The Dow Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td>To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Reynolds Tech</td>
			<td></td>
			<td>For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ plasma surface treatment system</td>
			<td>AST Products, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td>For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remover PG</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride solution</td>
			<td>MG Chemicals</td>
			<td>415-1L</td>
			<td>A component of Ni etching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36% hydrochloric acid solution</td>
			<td>Kanto Corp.</td>
			<td></td>
			<td>A component of Ni etching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary needles</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder U-type</td>
			<td>Molecular Devices, LLC</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>NORM-JECT&#174;, Henke Sass Wolf</td>
			<td></td>
			<td>Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene intrademic catheter tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td>Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece camera</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>DCC1240C</td>
			<td>Used to view mesh electronics within capillary needles during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to view mesh electronics within capillary needles during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EXL-M40 dental drill</td>
			<td>Osada</td>
			<td>3144-830</td>
			<td>For drilling the craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 mm drill burr</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-09</td>
			<td>For drilling the craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer 14 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-50</td>
			<td>Used to sterlize surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1950 cryosectioning instrument</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Triton x-100</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab177487</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Neurofilament</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8135</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>PA516291</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>Molecular weight = 70-150 kDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle end clamp</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>RA180/M</td>
			<td>Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printed circuit board (PCB)</td>
			<td>Advanced Circuits</td>
			<td></td>
			<td>Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel standard amplifier connector</td>
			<td>Omnetics Connector Corp.</td>
			<td>A79024-001</td>
			<td>Component assembled onto the PCB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel flat flexible cable (FFC)</td>
			<td>Molex, LLC</td>
			<td>152660339</td>
			<td>Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-ch zero insertion force (ZIF) connector</td>
			<td>Hirose Electric Co., LTD</td>
			<td>FH12A-32S-0.5SH(55)</td>
			<td>Component assembled onto the PCB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

syringe-injectable mesh electronics for stable chronic rodent electrophysiology

Sondes d’électrophysiologie cérébrale implantables sont des outils précieux en neurosciences en raison de leur capacité à enregistrer activité neurale avec haute résolution spatio-temporelle de régions cérébrales superficielles et profondes. Leur utilisation a été entravée, toutefois, de mécaniques et structurelles des incompatibilités entre les sondes et le cerveau tissu entraîner que communément micromotion et gliose avec résultant du signal l’instabilité chronique enregistrement des expériences. En revanche, après l’implantation de maille ultra-flexible électronique par injection de la seringue, le maillage des sondes forme une interface transparente et gliose-libre avec les tissus environnants de cerveau qui permet le suivi stable de neurones individuels au moins un an échelle de temps. Ce Détails du protocole les étapes clés dans une expérience d’enregistrement neuronaux typique souris à l’aide de la seringue-injectable maillage électronique, y compris la fabrication de l’électronique de maille dans un standard photolithographie processus possible dans de nombreuses universités, chargement maillage électronique en aiguilles capillaires standards, injection stéréotaxiques in vivo, connexion du maillage d’entrée/sortie aux interfaces de l’instrumentation standard, freinés ou se déplaçant librement des sessions d’enregistrement et histologique sectionnement du cerveau contenant du tissu mesh électronique. Représentant enregistrements neurones et les données histologiques sont présentées. Enquêteurs familiers avec ce protocole auront les connaissances nécessaires pour intégrer le maillage électronique dans leurs propres expériences et tirer parti des opportunités uniques offertes en créant une interface neurale stable à long terme, telles que les études du vieillissement processus, le développement du cerveau et la pathogenèse de la maladie du cerveau.

Résultats variera selon l’espèce animale à l’étude, la région du cerveau ciblées, le temps écoulé depuis l’injection, le montant des dommages aigus subis pendant l’injection et le succès de l’i/o interface de procédure, parmi d’autres facteurs. Activité de fortification unitaires peut-être ne pas apparaître jusqu’au jour 1 (dans le cas des aiguilles de diamètre intérieur 150 µm) et 1 semaine après que les amplitudes injection et spike peuvent varier jusqu'à 4 à 6 semaines. La figure 9 présente des données électrophysiologiques représentatives d’une sonde électronique de 32 voies maille injectée dans l’hippocampe et le cortex somatosensoriel primaire d’une souris mâle adulte de C57BL/6J. Environ 300-µV amplitude potentiels de champs locaux (LFPs) ont été enregistrées sur les 32 voies et activité de fortification unitaires a été enregistrée le 26 chaînes. Les LFPs et les pointes isolées restent similaires entre 2 et 4 mois, ce qui suggère une interface hautement stable entre l’enregistrement électronique et neurones au cours de cette période de temps prolongée. La figure 10 montre des résultats représentatifs de coupes histologiques et immuno-coloration du tissu cérébral contenant le maillage électronique 1 an après l’injection. Coloration pour NeuN, un marqueur des corps cellulaires neurones et neurofilaments, un marqueur des axones neurones, ne révèle peu ou aucun perte de densité des tissus au point d’injection, ce qui implique d’interfaçage sans couture entre le tissu de maille électronique et le cerveau. Coloration pour GFAP (un marqueur pour les astrocytes) plus révèle près-fond des astrocytes autour de maillage électronique, indiquant que sa présence suscite peu chronique réponse immunitaire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg"> Figure 1 : étapes dans un seringue-injectable maillage électronique expérience. Ce protocole décrit toutes les étapes clés dans une expérience d’enregistrement neuronaux rongeur typique utilisant le maillage électronique. Expériences entraînent habituellement, par ordre de mise en œuvre, (1) fabrication de maillage électronique, (2) chargement de maillage électronique en aiguilles capillaires, injection (3) stéréotaxique de maillage électronique dans le cerveau, I/O (4) électrique interfaçage maillés électronique, enregistrements de restreints ou librement mobiles (5) et (6) maille/tissu de sectionnement et de coloration pour l’histologie. Dans certaines études, seules les données histologiques peuvent désirer, auquel cas les étapes (4) et (5) peut être ignorée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg"> Figure 2 : schéma illustrant la procédure de fabrication pour l’électronique de maille plug-and-play dans la région périphérique ultra-flexible (première rangée), tige d’interconnexions (rangée du milieu) et I/O (rangée du bas). (A) SU-8 photosensible négative (rouge) s’inspire avec masque de PL-1 pour définir le fond passivation couche de chaque sonde électronique de maille plug-and-play. (B) structuration avec masque-2 PL, l’évaporation thermique et déjaugeage métal définir Au interconnexions et plaquettes de I/O (or). (C) structuration avec masque-3 PL, évaporation par faisceau d’électrons et métal déjaugeage définir Pt électrodes (bleu). (D) SU-8 photosensible négative (rouge) s’inspire avec PL masque-4 définir la couche de passivation. Ouvertures dans le SU-8 sont laissés à chaque électrode Pt et coussin I/O. (E) A terminé mesh sonde électronique avec des boîtes en pointillés indiquant les emplacements agrandis dans le haut, au milieu et lignes de fond. Photomasque fichiers de conception sont disponibles sur demande auprès des auteurs ou depuis le site de ressource, meshelectronics.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg"> Figure 3 : photographies et images de microscope optique de plug-and-play maillage électronique. (A) en mosaïque d’images de microscope optique d’une sonde électronique de seringue-injectable maille avec e/s plug-and-play. La sonde a été photographiée après que l’achèvement de la fabrication les étapes dans la Figure 2 , mais avant la publication du substrat Ni enduit. Les zones en pointillés correspondent de gauche à droite pour les sections de la région périphérique ultra-flexible, la tige et la région I/O amplifiés dans C, D et E, respectivement. Echelle = 1 mm. (B) photographie d’une plaquette de TR 3 pouces contenant 20 terminé mesh sondes électroniques. Echelle = image microscope optique 20 mm. (C) de 20 µm de diamètre Pt enregistrement des électrodes dans la région périphérique ultra-flexible. Echelle = 100 µm. (D) image par microscope optique de haute densité Au interconnexions dans la région de la tige. Chaque interconnexion UA est isolée électriquement et connecte à une seule électrode Pt sur un coussinet de I/O unique. Echelle = 100 µm. (E) optique image microscopique des plaquettes I/O. Chaque tampon se compose d’une région réductible maille et une région minces continue sur la tige. Conducteurs non SU-8 rubans connecter les portions de maillage des plaquettes ensemble pour aider à maintenir l’alignement. Echelle = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg"> Figure 4 : montage des appareils pour la tenue des aiguilles capillaires pendant l’injection de. Photographie (A) des composants de l’appareil. Les composants incluent (1) une aiguille capillaire de verre, (2) le titulaire de la pipette, (3) une attache de vis circulaire pour le titulaire de la pipette et (4) une rondelle conique pour le titulaire de la pipette. Points (2) à (4) sont inclus avec l’achat d’un détenteur de la pipette. La flèche indique la sortie du titulaire de la pipette, qui doit être collé fermé avec de l’époxy. (B) photo du titulaire pipette après montage et insertion d’une aiguille capillaire de verre. L’époxy ajouté est visible à la sortie en haut du porte-pipette (indiquée par la flèche) et tube capillaire connecte le titulaire de la pipette sur une seringue (non illustrée). (C) photo du titulaire de la pipette et l’aiguille capillaire après la fixation au cadre stéréotaxique avec une pince à angle droit fin. Barreaux de l’échelle est 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg"> Figure 5 : chargement de maillage électronique en verre aiguilles. (A) illustration schématique de la procédure de chargement pour l’électronique de maille plug-and-play. Une aiguille de verre est positionnée près de l’extrémité de la I/O d’une sonde électronique de maille, alors qu’il est suspendu dans une solution. Le piston de la seringue est alors manuellement rétracté pour dessiner dans la sonde électronique de maille. Positionnement idéal, c’est avec la région périphérique ultra-flexible juste à l’intérieur de l’extrémité de l’aiguille. Photographies (B) correspondant à (A) d’une sonde électronique de maille chargée dans une aiguille de verre. Barreaux de l’échelle = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg"> Figure 6 : schéma de la station de chirurgie stéréotaxique. Un cadre stéréotaxique motorisé (A) avec porte-pipette jointe sert à positionner l’aiguille dans la région du cerveau désirée. La position de l’aiguille et chargé de maillage électronique sont surveillées avec un objectif et fixé la caméra (B) et affichés sur un ordinateur (C). Un pousse-seringue (D) volumes précis d’une solution saline, traverse de l’aiguille, permettant une injection précise et contrôlée de maillage électronique dans la région du cerveau désiré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg"> Figure 7 : Plug-and-play I/O interfaçage procédure. (A) An FFC substrat de serrage est sécurisée avec un ciment dentaire adjacent à la craniotomie. (B) Plug-and-play maillage électronique est stereotaxically injecté dans la région du cerveau désirée à l’aide de la méthode de champ de vision. (C), l’aiguille, avec les pads I/O du maillage électronique sonde toujours à l’intérieur, est repositionné au-dessus de la FFC, substrat de serrage. Débit (D) est repris par l’aiguille pour éjecter les coussinets de I/O sur la FFC substrat de serrage. (E) les plaquettes de I/O sont pliées à 90 ° par rapport à la tige, s’est déroulée avec le côté conducteur vers le haut et séché en place. Substrat (F), la FFC est garnie de ciseaux à un linéaire environ 0,5 mm entre le bord des plaquettes I/O. Substrat excès est coupé pour permettre l’insertion dans un connecteur ZIF de 32 voies. Tampons (G), les entrées/sorties sont insérés dans un connecteur ZIF de 32 voies monté sur un circuit imprimé personnalisé. Le connecteur ZIF est verrouillé fermée pour faire contact avec les plaquettes I/O. (H), le verrou est cimenté fermé, le PCB est renversé sur le crâne et le PCB est maintenu en place avec du ciment dentaire. (I) The PCB forme un préamplificateur compact doté d’un connecteur standard amplificateur pour l’interfaçage facile au cours de sessions d’enregistrement. Barreaux de l’échelle = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg"> Figure 8 : enregistrements sobres et émouvant librement. (A) photographie d’une souris C57BL/6J mâle dans une drisse pendant une session d’enregistrement. Un préamplificateur de 32 canaux de PCB a été inséré dans le connecteur standard amplificateur. Photographie (B) de la même souris avec 32 canaux préampli PCB au cours d’une expérience d’enregistrement librement mobiles. Barreaux de l’échelle = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg"> Figure 9 : inscription neural représentatif des résultats. (A) représentant LFP cartes de chaleur de 32 canaux de maille sondes électroniques injectés dans la souris hippocampe et le cortex somatosensoriel. Les données ont été enregistrées tandis que la souris explorer librement sa cage à 2 mois (en haut) et après l’injection 4 mois (en bas). Amplitude de la LFP est codé par couleur selon la barre de couleur à droite. Passe-haut filtrés traces (noir) montrant l’activité de fortification sont superposées sur le spectrogramme pour chacun des 32 canaux. (B) pointes isolées après que le tri des données tracées dans (A). Activité de fortification unitaires a été détectée sur 26 de la 32 canaux les deux 2 mois après injection (en haut) et de 4 mois après (en bas). Les nombres au-dessus de chaque cluster de pointes correspondent aux numéros canal (a). Ce chiffre a été modifié par Fu, et al. 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg"> Figure 10 : résultats histologiques représentatif. (A) schéma illustrant l’orientation de maillage électronique au sein de l’horizontale (panneau central) et sagittales tranches de cerveau (panneau inférieur). (B) image microscope de Fluorescence d’une tranche de cerveau cortical épais de 10 µm un an après l’injection d’une sonde électronique de maille 16 canaux. La tranche a été immunomarquées pour NeuN (vert). (C) la même tranche de cerveau immunomarquage des neurofilaments (rouge). (D) le même cerveau tranche immunomarquage pour GFAP (cyan). (E), une image composite de (B) à (D) montrant le maillage électronique/tissu s’interfacer avec marqué NeuN (vert), neurofilaments (rouge), GFAP (cyan) et maillage électronique (bleu). Barreaux de l’échelle = 100 µm. Ce chiffre a été modifié par Fu et al. 27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Supplémentaire vidéo 1 : répété le chargement et l’injection de maillage électronique dans la solution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

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Seringue-injectable maillage électronique pour l’électrophysiologie rongeur chronique Stable

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